Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Özet

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Özet

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

Giriş

primer meme tümörü tümör hücrelerinin yayılması makrofajlar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere stromal hücreler sadece tümör hücrelerini içerir, ancak ana bilgisayar gösterilmiştir. Bundan başka, tümör damar sistemi artan geçirgenliği ¹ anormaldir. Bu durumda, tümör hücreleri, makrofajlar ve endotelial hücreler, primer tümör mikro-vasküler geçirgenliği ve tümör hücre intravasation aracılık etkileşim belirleyen anlaşılması metastaz için önemlidir. damar geçirgenliği, tümör hücre intravazasyonunda ve tümör mikroçevresinde çok hücreli etkileşimler altında yatan sinyal mekanizmasının kinetik anlama anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesine ve yönetiminde önemli bilgiler sağlayabilir.

In vivo olarak tümör damar geçirgenliğini incelemek birincil yöntemi Evans Mavi ^2, yüksek molekül ağırlıklı dekstranlar (155 kDa) halinde ekstravasküler boyalar ölçülmesi olmuşturBoyanın enjeksiyonundan sonra sabit bir zaman noktalarında ³ ve florofor ya da (albümin dahil) Radyoaktif-konjüge proteinler ^4. Mikroskopi Gelişmeler, hayvan modelleri ve floresan boyalar intravital mikroskobiyle ⁵ boyunca hücresel süreçleri ve canlı hayvan vasküler geçirgenliğin görselleştirme sağlamıştır.

Birkaç kez puan üzerinden statik görüntülerin, ya da kısa time-lapse dizilerinin satın alarak Canlı hayvan görüntüleme tümörün mikro ^6,7 dinamik olayların anlaşılması için izin vermez. Nitekim, 24 saat boyunca statik bir görüntü elde etme tümör damar ancak damar geçirgenliği dinamikleri ⁶ gözlenmemiştir, sızdıran olduğunu göstermiştir. Böylece, 12 saate kadar uzatılmış sürekli time-lapse görüntüleme tümör mikroçevresinde dinamik olayların kinetik yakalar.

Bu protokol, uzun bir zaman atlamalı multiphot kullanımını tarif ederintravital mikroskopi tümör mikro-dinamik çok hücreli olayları incelemek için. tümör mikroçevresinde birden fazla hücre tipleri enjekte edilebilir boyalarla veya floresan proteinleri ifade transgenik hayvanlar kullanılarak etiketlenir. vasküler boyalar veya proteinler görüntüleme başladıktan sonra enjekte edilebilir bir kuyruk damarından sonda kullanılarak tümör mikro çok hücreli olayların kinetik veriler elde etmek için. canlı hücre görüntüleme için meme tümörü deri bir kapakla cerrahi hazırlık aracılığıyla maruz kalmaktadır. Görüntüler birden photomultiplier tüpler (PMT) dedektörleri ⁸ ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak 12 saate kadar için edinilir. Uygun filtreleri kullanarak, bir çıkarma algoritması tümörün mikro aynı anda ⁹ 5 floresan sinyalleri elde etmek 4 PMT dedektörleri sağlar. Yüksek çözünürlüklü multiphoton İntra vital mikroskopik daha iyi bir yol, tümörün mikro tümör stromanın etkileşimleri, tek bir hücre çözünürlüklü görüntü yakalar Uvasküler geçirgenlik ve tümör hücre intravasation ^10-13 nderstanding. Spesifik olarak, bir tümör hücresi, bir makrofaj ve endotel hücre arasındaki etkileşimi bölgelerde seçici meydana genişletilmiş intravital görüntüleme ortaya yüksek derecede lokalize edilen, geçici vasküler geçirgenlik etkinlik ¹³ (metastaz, TMEM ¹⁴ tümör mikro-olarak tanımlanmıştır). Bundan başka, tümör hücre intravasation, sadece TMEM gerçekleşir ve uzamsal ve geçici olarak vasküler geçirgenliği ¹³ ile ilişkilidir. Bu olayların dinamiklerinin tek hücreli çözünürlükte tümör mikroçevresinde floresan işaretli hücrelerin uzun time-lapse multiphoton mikroskobu kullanımı ile mümkün olmuştur.

Protokol

açıklanan tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Albert Einstein College of tarafından önceden onay da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır.

1. Getirici floresanla işaretlenmiş tümörler ve tümör bağlantılı makrofajlar

1. Gelişmiş yeşil floresan fare meme tümörü virüsü uzun terminal tekrarı, yani fluoresan muhabir [transgenik fareler polioma orta T antijenini (MMTV PyMT) tahrik kendiliğinden, yerli, genetik olarak fare meme kanseri modeli geçerek floresan etiketli tümör hücrelerinin oluşturmak protein (EGFP), geliştirilmiş mavi floresan proteinin (ECFP) ya da Dendra2] ^8,9.
2. PyMT hayvanlarda floresan etiket makrofajlar ile floresan [yani, MacGr myeloid- ve makrofaj spesifik floresan gazetecilere genetiği fare modelleri geçerek tümör hücrelerinin etiketlieen ¹⁵ veya MacBlue farenin CSF1R -GAL4VP16 / UAS ECFP ^16].
3. Seçenek olarak ise, floresan floresan etiketli PyMT tümör hücreleri (singeneik), insan meme kanseri hücre soyları ya da primer insan hastaya türevli tümörlerde (ksenogrefleri) ^11,17 ortotopik transplantasyon ile tümörlerinin, etiketli oluşturur.
   1. İmplant floresan floresan etiketli tümör hücreleri ve miyeloid hücreler ¹³ hayvanlar oluşturmak için floresan protein etiketli miyeloid hücreler ile singeneik farelere PyMT tümör hücrelerini etiketli.
4. başlangıç ​​2 saat önce floresan etiket makrofajlara insan hücre çizgileri ve hasta türetilmiş primer tümörlerin ksenograft tümör ağır birleşik bağışıklık eksikliği (SCID) farelere 10 mg damar içi (IV) kuyruk damarı / kg floresan 70 kDa dekstran 100 ul enjekte intravital görüntüleme.

2. Mikroskop Kurulum ve Görüntüleme Hazırlık

Not: Bu yordam set-up açıklarBir multiphoton mikroskop ⁸ intravital görüntüleme için.

1. iki foton lazerler ve dedektörler de dahil olmak üzere tüm mikroskop ve lazer bileşenleri açın.
2. sahne öncesi ısınmak için 30 ° C, ısıtma kutusunu açın. Bu adım, bir hayvan fizyolojik ısısını muhafaza etmek için kritiktir.
3. ters bir mikroskop yerinde mikroskop sahnede ısmarlama sahne uç ile kullanım içindir. Özel uç görüntüleme için merkezi delikten geçen çapı "sahne ekleme uzayda ve 1 ile uyacak şekilde işlenmiş kalın alüminyum" 1/8 bir sayfadır.
   1. % 70 etanol ve kuru hava ile mikroskop sahne ve sahne parçasını silin.
   2. cam kapak ile optik temas sağlamak için 20X, 1.05 NA mikroskop objektif su büyük damla yerleştirin.
   3. mikroskop sahne uç üzerindeki görüntüleme portu üzerinden yer cam kapak (# 1.5 kalınlık). laboratuar bant ile yerde sabitleyin.
   4. 2 cm x 2 cm delik yumruk bir delik yumruk kullanınve esnek bir lastik pedi özel sahne eki delik ile uyumlu pad deliği mikroskop sahnede lastik pedi yerleştirin.

Görüntüleme sırasında Enjeksiyon için 3. Kuyruk Ven Kateterine hazırlanması ve Reaktifler

1. polietilen (PE) tüp içinde 30 cm uzunluğunda kesilir.
2. plastik montaj kopana kadar forseps kullanarak, ileri ve geri bir 31 G iğne metal iğne taşımak.
3. forseps kullanarak, PE boru içine müstakil iğnenin künt ucunu.
4. PE boru diğer ucunu bir 31 G iğne takın.
5. steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1 cc şırınga doldurun ve 31 G iğne takın ve PBS ile tüp ve iğne bütün havayı temizlemek. PBS hidrasyon ve kan ozmolarite ^9,18 muhafaza etmek için kullanılır, bununla birlikte izotonik tuz da kullanılabilir.
6. 3 mg, 200 ul 1 cc şırınga doldurmak / 155 kDa dekstran-tetrametilrodamin (TMR kg) Veya vasküler etiketleme için kuantum noktaları.
7. Bu buz üzerinde 1 cc şırınga ve yerine vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGFA ₁₆₅₎ içindeki bir 165 amino asit izoformunu gibi diğer enjekte edilebilir proteinleri hazırlayın. 0.05 mg / ml'lik bir konsantrasyonda 0.2 mg / kg VEGFA ₁₆₅ ¹⁹ enjekte edilir.

Kalıcı Tail Ven Kateter 4. yerleştirilmesi

1. Taşıyıcı gaz olarak O ₂ ile% 5 izofluran ile bir indüksiyon odasını kullanarak anestezi altında hayvan yerleştirin.
2. tam anestezi ve bir ayak tutam yanıt vermiyor kez ameliyat platforma fare aktarın.
3. Cerrahi platforma Açık izofluran anestezi hattı, indüksiyon odasına anestezi hattını kapatın ve hayvanın burnu üzerine burun konisi yerleştirin. 2.5% 5 ile% den izofluran azaltın.
4. anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözleri oftalmik merhem sürün.
5. ısıtma lambası altında hayvan ısıtınEk 2 dk kuyruk dolaşımını artırmak için sirkülasyon derin anestezi ile yavaşlatır olarak.
6. % 70 etanol ile fare kuyruğu ven sterilize edin.
7. hayvanın yan kuyruk damar içine Bölüm 3 inşa kateter 31 G iğne ucu yerleştirin ve 2-3 mm iğne itin.
8. kuyruk damarından yerleştirilir kateter sağlanması, kan görmek şırınga geri çekin.
9. kuyruk uzunluğu boyunca damar yer paralel iğne tutma iğne üzerine yerleştirilen laboratuvar bant 1 cm uzunluğu kullanın.

5. Cilt Kapak Cerrahi Prosedür Meme Tümör Açığa

1. ameliyat işlemine hayvan tümörü ve% 70 etanol ile ventral yüzeyi bez. Not: tarif edildiği gibi, bu işlem tam aseptik gerçekleştirilmez. enfeksiyon karıştırıcı bir faktör haline gelebilir uzun görüntüleme oturumları için, uygun aseptik teknik kullanılması tavsiye edilir.
2. Steri kullanmaSteril makas ventral orta hat uzunluğu yaklaşık 1 cm boyunca bir cilt altı kesi yapmak ile le forseps, ventral cilt kaldırın. insizyon sırasında periton delinmesiyle kaçının.
3. Yavaşça meme tümörü açığa çıkarmak üzere periton meme bezi ve tümör bağlama bağ dokusu kesti.
4. yavaşça çıkarın ve tümör damar bütünlüğünü korumak ve kanama en aza indirirken tümörün maruz yüzeyinden fasya ve yağ kesip, makas ve forseps kullanma. Bu adım tümörün tümör mimarisi ve damar kaynağı sağlamada önemlidir.

Mikroskopi 6. Hayvan hazırlanması

1. görüntüleme için mikroskop objektif üzerine sahne insert üzerine lamel üzerine yerleştirilir maruz tümör ile önceden ısıtılmış görüntüleme aşamasına hayvan aktarın. İğneyi çıkarmak için değil, böylece hayvan ile hafifçe kuyruk ven kateteri aktarmak için özen gösterin.
2. Yeri inciHayvanın burnu üzerinden e anestezi burun konisi% 3 izofluran anestezi seti korumak için.
3. Tümör kauçuk ped deliğe aittir ve cam lamel ile temas eder, böylece hayvan yerleştirin.
4. yavaşça yerine tümör tutun ve görüntü alımı sırasında hareketi azaltmak için laboratuvar bant ile mikroskop sahneye bunları düzeltmek için iki lastik pedleri kullanmayın.
5. hidratlı doku tutmak ve lamel ile optik temas sağlamak için PBS ile lastik pedi odasına doldurun.
6. Bir pulse oksimetre probu ile hayvanın hayati belirtilerini izlemek başlayın. hayvan uyluk bir klip sensörünü takın. Seçenek olarak boyun çevresine uyacak şekilde yapılandırılmış bir yaka kullanılabilir.
7. 30 ° C ²⁰ korumak için hayvan üzerinde ısıtma kutusu yerleştirin.
8. Yavaş yavaş anestezi korumak ve kan akışını korumak için 0.5-1% izofluran düzeyini azaltır.

7. Görüntü Alma ve Fluoresc Enjeksiyonent Boyalar ve Enjekte Proteinler

1. Tümörün yüzeyinde floresan tümör hücreleri üzerinde mikroskop mercek odak kullanma.
2. kan damarlarını akan alanları bularak ilgi alanı seçin. akan kan damarları ile ilgi alanının seçimi tümör damarsal değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.
3. ilgi bir bölge seçildikten sonra multiphoton görüntüleme moduna mikroskop geçin.
4. z-serisi üst ve alt limitlerini ayarlayın. istediğiniz başlangıç ​​konumuna hedefi taşımak için odak ayarlayıcısı kullanarak ve Z konumu "Üst" butonuna tıklayarak z serinin üst sınırını ayarlayın. ikinci harmonik üretimi (SHG) kanal tümör yüzeyindeki kolajen lif şebekesi görselleştirilmesi ve hiçbir hücre sadece kolajen lifleri görünür olduğunda gözlemleyerek z serisinin üst sınırını belirleyin.
   1. (Typica istenen görüntüleme derinliğe kadar objektif hareket ettirerek z serisinin alt sınırını ayarlayınLly 50-150 mikron) ve Z konumu tıklayarak "Alt" tuşuna basınız.
   2. adım büyüklüğü alanına istediğiniz değeri yazarak adım boyutunu ayarlayın. çözünürlük ve satın alma süre hususlara dayalı adım boyutunu belirlemek (genellikle 2 mikron yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılan ve 5 mikron aksi bir).
5. Time-Lapse alanına istenilen hızlandırılmış zamanı Time-Lapse paneline geçiş ve girerek time-lapse aralığını ayarlayın. Optimal zamansal çözünürlük için sürekli görüntüleme için 0 sn için zaman aralığını ayarlayabilirsiniz. Not: Uzun time-lapse görüntüleme için objektif daldırma sıvı doldurmak için satın almalar arasında 10 sn zaman aralığını ayarlamak için tavsiye edilir.
6. görüntüleme için parametreler belirlenmiştir edildikten sonra, yavaş yavaş 155 kDa dekstran-TMR enjekte edilir.
   1. Kuyruk ven kateteri PBS ile şırınga çıkarın ve li içine herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için 155 kDa dekstran-TMR özen içeren şırınga ile değiştirinne.
   2. Yavaş yavaş 200 ul maksimum hacmi ile, fare içine 155 kDa dekstran-TMR enjekte ve şırınga PBS içeren şırınga değiştirin. KRİTİK ADIM: yavaş yavaş enjeksiyon yapın ve ven dışında çözüm almamak için önlem alın.
7. Kayıt butonuna tıklayarak daha sonra bunları bastırmak için Z-Stack ve Time-Lapse düğmeleriyle tarafından Z-yığın time-lapse görüntüleme edinilmesini başlatın.
8. Diğer floresan dekstranlar, örneğin, 10 kDa dekstran-floresin izotiyosiyanat (FITC), veya proteinler, örneğin, VEGFA _165, önceden hazırlanmış ise, 0 = en az bir başlangıç ​​için görüntü elde başladıktan sonra bunları enjekte edilir.
   1. Kuyruk ven kateteri PBS ile şırınga çıkarın ve hattına herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için 10 kDa dekstran-FITC veya VEGFA ₁₆₅ özen içeren şırınga ile değiştirin.
   2. Yavaşça kuyruk ven kateter yoluyla fare içine enjekte edilebilir enjekteve PBS ihtiva eden bir şırınga ile bir şırınga değiştirin.
9. Her 30-45 dk, yavaş yavaş hayvanın hidrasyon korumak için PBS veya serum fizyolojik 50 ul enjekte edilir.

8. Ötenazi

1. görüntü alımı bitiminde, hayvan euthanize.
   1. % 5 izofluran artırın.
   2. nefes ve sahne hayvan kaldırmak çözüldükten sonra 30 saniye kadar% 5 izofluran altında hayvan tutun.
   3. tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin.

9. Görüntü İşleme

1. her zaman bir noktada her kanal için 16 bit TIFF dosyalar görüntüleri kazanmak ve sırayla kaydedin.
2. Spektral örtüşme (yani, GFP ve OBP), xy sürüklenme ortadan kaldırılması ve ImageJ ⁹ kurulan yöntemler kullanılarak time-lapse dizilerinden film nesil ayrılmasını gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü görüntüler ¹³ 3D yüzey rekonstrüksiyon gerçekleştirin.

Sonuçlar

Genişletilmiş zaman atlamalı intravital mikroskopi tümör mikroçevresinde çok hücreli süreçlerin tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme sağlıyor. floresan etiketleme tümör hücreleri, makrofajlar, vasküler alan, ikinci harmonik oluşumu sinyali kullanılarak kolajen lif şebekesi görselleştirerek, tümörün mikro birden fazla bölme aynı zamanda görüntüleme sırasında izlenir. Dendra2 (Şekil 1A) ile etiketlenmiş meme tümörü hücreleri,...

Tartışmalar

tümör mikroçevresinde kendiliğinden meydana gelen hücresel etkileşimler, tümör hücre hareketliliği ve intravasation değişikliklere yol açabilir. Canlı tümör dokusunun yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme son derece geçici ^10,13,24 olabilir çok hücreli dinamikleri görselleştirme izin verir. Tümörün mikro süreçlerin moleküler mekanizmaları hakkında gerekli bilgi verebilir ayrık zamanlı noktaları ile elde edilen in vivo deneylerde veya time-lapse gör?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate	Sigma Aldrich	T1287	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
70 kDa dextran-Texas Red	Life Technologies	D-1830	reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS
10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate	Sigma Aldrich	FD10S	reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS
Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Life Technologies	Q21561MP	Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection
MMTV-PyMT mice	Jackson Laboratory	2374
Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)	Jackson Laboratory	26051
Csf1r-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
1x PBS	Life Technologies
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	AirTech
1 ml syringe, tuberculin slip tip	BD	309659
30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle	BD	305128
Polyethylene micro medical tubing	Scientific Commodities Inc	BB31695-PE/1	0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D.
Microscope coverglass	Corning	2980-225	thickness 1.5, 22 x 50 mm
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors	Kent Scientific
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
soft rubber pad	McMaster-Carr	8514K62	Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back
hard rubber pad	McMaster-Carr	8568K615	High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer
Microscope	Olympus		The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens.
7-Punch set	McMaster-Carr	3429A12	1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch