Bir Yaklaşım sırt kök ganglion nöronlar hizalama ve myelinizasyondur Artırma

Özet

This protocol describes the isolation of dorsal root ganglion (DRG) neurons isolated from rats and the culture of DRG neurons on a static pre-stretched cell culture system to enhance axon alignment, with subsequent co-culture of Schwann Cells (SCs) to promote myelination.

Özet

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to bridge the lesion site, properly organized axonal alignment is required. Since demyelination after nerve injury strongly impairs the conductive capacity of surviving axons, remyelination is critical for successful functioning of regenerated nerves. Previously, we demonstrated that mesenchymal stem cells (MSCs) aligned on a pre-stretch induced anisotropic surface because the cells can sense a larger effective stiffness in the stretched direction than in the perpendicular direction. We also showed that an anisotropic surface arising from a mechanical pre-stretched surface similarly affects alignment, as well as growth and myelination of axons. Here, we provide a detailed protocol for preparing a pre-stretched anisotropic surface, the isolation and culture of dorsal root ganglion (DRG) neurons on a pre-stretched surface, and show the myelination behavior of a co-culture of DRG neurons with Schwann cells (SCs) on a pre-stretched surface.

Giriş

Sinir yaralanmalarının ise, yakın ve uzak sinir kütükleri çoğu zaman lezyon yerinde ^1-2 sinir liflerinin direkt yeniden düzenlenmesi engellenir. Normalde, akson yolları bağlantı karmaşık ağlar oluşturan aksonların çok düzenli ve uyumlu demetleri, oluşmaktadır. Ancak, sinir rejenerasyonu kötü organize akson hizalama ^3-4 dolayı kaotik bir süreçtir. Bu nedenle, lezyon yerinin köprü aksonlar rejenere yeterli bir sayı üretmek için, iyi organize aksonal hizalanma yaratmak için de gereklidir. Ayrıca, demiyelinizasyon yaralanma yerinde myelinating hücrelerin ölümüne bağlı sinir yaralanmaları eşlik eder. Demiyelinizasyon kuvvetle aksonlar hayatta iletken kapasitesini bozar yana, demiyelinizasyon hedefleme veya yeniden miyelin oluşumunu teşvik tedaviler sinir hasarı ⁵ sonra fonksiyonel iyileşme için önemlidir. Dolayısıyla, bu protokolün amacı, bu iki konuyu ele alan bir mühendislik yaklaşımı göstermektirSinir rejenerasyon.

Bir malzemenin fiziksel ve mekanik özellikleri, farklı eksenler boyunca ölçüldüğünde, bir fark olarak tanımlanan yüzey anizotropi, hücre hizalama, büyüme ve taşıma ^6-7 etkilemek için uygulanmaktadır. topografya ek olarak, anizotropi indükleme için diğer yöntemler bulunmaktadır. Daha önce, poli-dimetil-siloksan (PDMS) membranın mekanik statik ön streç neden olduğu yüzey anizotropi incelenmiştir. "Büyük uygulanan küçük deformasyon süper" teorisi hücreleri gerilmiş yönde anlamda etkili bir sertliği dik yönde farklıdır tahmin ve etkin sertlikteki bu fark anizotropi ⁸ yüzey kaynaklanmaktadır. Önceden gerilmiş PDMS zar üzerinde kültürlenmiş mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) aktif yüzeyi çekerek ve bunun sonucu olarak anizotropiye duyu önceden gerilmiş yönde ⁹ hizalamak edebiliyoruz. Benzer şekilde, anizotropik yüzey armekanik ön-gerilmiş yüzeyinden ising sırt kök gangliyonu hizalamasını yanı sıra büyüme ve miyelinasyonun (DRG) ¹⁰ aksonlar etkiler. Burada akson rejenerasyonu ¹⁰ artırmak için statik bir önceden gerilmiş PDMS substrat yüzey anizotropi uyarılması için bir protokol sağlar.

Akson hizalama, istenilen desenleri ile topolojik özellikleri ortaya çıkarmak için, hizalanmış lifleri ve kanallar ^6,11-12 ile temas rehberlik sağlamak için rapor, akson hizalama ^11,13 kolaylaştırmak için ortaya konmuştur. Ancak, bu tür lifleri, kanallar ve desen olarak topolojik özellikler aracılığıyla akson hizalama uyarılması için teknikler bildirdi uzatmak ve akson kalınlığını artırmak için koyamadık. Tersine, mekanik kademeli bir esneme ¹⁴ büyüklüğü arttı daha uzun ve daha kalın akson streç yönünde akson hizalama yol germe. Bununla birlikte, in vivo koşullarında, bir çalışan motorlu cihazı içeren değildirmümkün. Bunun aksine, statik önceden gerilmiş neden anizotropi daha az karmaşık ve daha kolay bir şekilde in vivo uygulamalar için gelecekteki iskele tasarımlar içine dahil edilebilir.

Bu protokol, statik önceden gerilmiş hücre kültür sistemi topolojik özellikler olmadan yüzey anizotropi indüklemek için kullanılır. Membran çerçevesi üzerine sabitlenir ve önceden tespit edilmiş bir germe büyüklüğü germe aşaması uygulanır, bunun üzerine önceden gerilmiş kültür sistemi, PDMS zar, bir gerilebilir çerçeve ve bir germe aşamasında oluşmaktadır. 21 güne kadar önceden gerilmiş yüzünde kültür taze izole DRG nöronları akson hizalama ve kalınlık için izlenir. Daha sonra, Schwann hücreleri (SCS) miyelinasyon izlenir hizalanmış aksonlar ile birlikte kültürlendi. Ön streç kaynaklı yüzey anizotropi birleşmeyle biz MSC ve DRG nöronlarının sırasıyla ^9-10, hücre hizalama farklılaşma ve akson hizalama büyümeyi artırmak başardık.

Protokol

hücrelerin izolasyonu için tüm prosedürler, Michigan State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Önceden gerilmiş Anisotropik Yüzeyin hazırlanması 1.

1. taban ve sertleştirme maddesinin 1 çözeltisi ve bir doku kültürü kabı (12 cm çapında) içine dökün: 10 karıştırın. 4900 mg tabanı ve toplam çapraz bağlama karışımı için sertleştirici 490 mg kullanın.
2. Hava kabarcıklarını uzaklaştırmak için 20 dakika süreyle vakum altında jel karışımı tutun.
3. 60 ° C de bir gece sertleştirme fırında jel karışımı yerleştirin.
4. PDMS membran tedavileri sonrasında, 165 mTor 3 dakika ve O ₂ 65 sccm akışı için bir plazma temizleme / aşındırma sistemi kullanılarak oksijen plazma ile yüzey davranın.
5. haberdar olmak hangi tarafı oksijen tedavi ise, çanak dikdörtgen membranın (5 × 3.5 cm) bir parça kesin emin oksijen tedavi tarafı karşı karşıya makyaj ve germe çerçeve üzerine sabitleyin. Bir çerçeveye yerleştirin sahne germe ve eşit 10% uzama ulaşıncaya kadar sahnede düğmeyi çevirerek streç (ya da diğer bazı önceden belirlenmiş streç; uzama doğrudan germe aşamasından okunabilir) uzun eksen ^9. çerçeve vidaları sıkarak streç sabitleyin.
6. aşamasından çerçeveyi çıkarın. membran yüzeyi kuru ve tozsuz olduğundan emin olun, sonra zara sıkıca bağlamak için odasının yapışkan tarafını sağlayan zar üzerine bir silikon odasına yerleştirin.
   Not: Silikon odası PDMS zarı üzerinde hücre orta tutmak için bir kuyu sağlar. Cihaz tasarımı Şekil 1 'de gösterilmiştir.
7. 10 dakika boyunca UV ile yüzey sterilize edin.
8. Ekle 1 ml poli-L-lizin plazma işlemi 6 saat içinde oda içinde PDMS yüzeyine (PLL) (fosfat tamponlu salin içinde% 0.01) ve 37 ° C de 2 saat inkübe DRG nöronlarını tohumlanmasından önce. Bu hücre eki artırır.

DRG le "> 2. İzolasyon

1. DRG nöronlar için standart büyüme ortamı hazırlayın.
2. izolasyon öncesinde, izolasyon ekipmanları ve filtre reaktifleri otoklav. 6 oyuklu plakanın bir kuyuya yalıtım tamponu 5 ml, ve buz üzerinde plaka koyun. 9 mi% 0.05 tripsin-EDTA (1 mg / ml), kolajenazın (500 U / ml), 1 ml ekleyerek ayrışma ortamı 10 ml hazırlamak buz üzerinde 0.22 um'lik bir filtreden ve yer ile çözümler filtre.
3. izolasyonu için 7 gün 'Sprague-Dawley sıçanları - on 5 oniki kullanın. % 75 izopropanol ile yavrular Sprey ve boyunları vurularak kurban.
4. arka omurilik örten cilt kesip ve omurga etrafında herhangi bir aşırı doku kaldırmak. cerrahi spot ışıklandırma cerrahi büyüteç altında bir kesim makas ile her iki tarafta omurga boyunca, sonra boynundan ilk kesi yapmak ve. Yavruların vücuttan omurga ayırın ve aşırı kas çıkarın. Ardından, lon boyunca kesmek için makas kullanınomurga ve kullanımı cımbız g ekseni tam omurga açıp steril bir 15 ml tüp içine yalıtım tamponu DRG'ler aktarımı için daha büyük bir açıklık oluşturmak için bir pipet spinal cord.Remove uç elde etmek için.
5. cımbız ince çifti kullanılarak, kemik cebinden ganglion kaldırmak ve yaklaşık 10 toplamak - Her iki taraftan 16 DRG. sinir kökleri Trim ve buz gibi soğuk izolasyon tampon ganglionlar aktarın.
6. steril bir 15 ml tüp içine yalıtım tamponu DRG'ler aktarımı için daha büyük bir açıklık oluşturmak için bir pipetten ucu çıkarın. Kimyasal ayırmadan sonra, santrifüj 900 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C'de gangliyon.
7. dokular tüpün dibine çöker ve yavaşça üstüne izolasyon tampon kaldırmak ve tüp içine ayrışma ortamı 10 ml ekleyelim.
8. 10 dakika - tüp her 5 çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C su banyosu içinde ayrışma ortamı içinde parçalara dokuların inkübe edin.
9. SonraKimyasal ayrışma santrifüj 900 xg'de gangliyon ve 5 dakika için 4 ° C.
10. Süpernatantı ve 10 ml standart büyüme ortamı ve vorteks pelet yeniden askıya.
11. bir kez daha bölüm 2.9 de belirtildiği gibi ayrışmış hücreleri Santrifüj.
12. Süpernatantı standart büyüme ortamı ve vorteks 12 ml pelet yeniden askıya.

Önceden gergin Yüzeyde DRG 3. Kültür

1. , Hücrelerin ekim odasından PLL çözümleri kaldırmak ve steril su ve kuru hava ile PDMS yüzeyin durulanması önce.
2. 2 dakika enkaz tüpün dibine yerleşmek için izin - hücrelerin yeniden askıya sonra, 1 için süspansiyon seti sağlar. Her streç odasına hücre süspansiyonu, 1.5 ml ilave edilir ve% 5 _CO2 seviyesinde 37 ° C'de inkübe edin.
3. 10 ul (veya 15 ul) floro-2-deoksi-uridin ve üridin (FDU-U) stok soluti karışımı ekleyin, in vitro 1 gün (DIV) de, glial hücreleri ortadan kaldırmak için(Malzeme Tablo bakınız) de her birine. 7 saat sonra, taze, standart büyüme ortamı ile orta yerine ve% 5 _CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde, önceden gerilmiş bir kültür Cihazı.
4. Hücre kültürü döneminde (2-3 hafta), taze ortam ile yarım harcanan orta değiştirerek her iki günde bir ortamı değiştirmek. Not: 2 hafta boyunca gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerde kültürlendikten sonra arıtılmış, SC'ler bölmeye ilave edilir ve bir hafta (aşama 4.7) kültürlendi.

Önceden gergin Yüzey üzerinde DRG Nöronlar ile Schwann Hücreleri (SC'ler) 4. Co-kültür

1. Dr Campana'nın grubuna daha önce ¹⁵ tarafından açıklandığı gibi SC'ler izole eder.
   1. Kısaca, bir 1 gün eski yavru SC'ler izole eder. Toplayın ve mekanik siyatik sinirleri kimyasal (Tripsin-EDTA ve kollajenaz A) hem de (18 gauge iğne / 10 ml şırınga) ¹⁵ ayırmak.
   2. poli-D-lisin (PDL) co ayrışmış hücreleri Tohum% 5 _CO2 37 ° C'de ATED T25 şişesi ve kültür. 5. günde, anti-Thy 1.1 antikoru ve tavşan komplemanı kullanılarak antikor seçimi ile hücrelerin saflaştırılması ve geçişi ile 2 saflaştırılmış hücreleri alt-kültürü - Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM),% 10 fetal inek serumu ihtiva eden 4. kültür ortamı (FBS) ,% 1 Penisilin / Streptomisin (Penn / Strep), 21 ug / ml büyükbaş hayvan hipofız bezi (BPB) ayıklamak ve 4 uM Forskolin.
2. SC'ler kültür ortamının çıkarın ve şişeye 5 mi,% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin. 3 dakika - 2% 5 _CO2 seviyesinde 37 ° C'de inkübe hücreleri.
3. bu şişeden kaldırın, ardından da, kültür ortamının 5 ml ilave edilir ve şişe hücreler ile karıştırmak için 10X objektif kullanılarak optik mikroskop altında Hücrelerden.
4. 200 xg, 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj hücre süspansiyonu ilave edilir ve 5 dakika boyunca 20 ° C.
5. Süpernatantı ve 7 ml standart DRG büyüme med peletia.
6. Bir 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine hücre süspansiyonu 10 ul alır tripan mavisi 10 ul ile kanştınn, ve daha sonra bir 10X objektif kullanılarak optik mikroskopta hemasitometre kullanılarak hücre sayısı. DRG büyüme ortamı ekleyerek ml başına 5.000 hücreleri hücre süspansiyonu seyreltilir.
7. gerilmiş bölme DRG kültüründen 0.5 ml ortamda çıkarın ve DRG kültüre SC süspansiyon 0.5 ml ilave ediniz.
8. Kültür, 37 ° C'de ve% 5 CO _2. değiştirme 1 hafta hücreler ortam DRG taze standart büyüme ortamı yarı harcanan ortamının değiştirilmesiyle her iki günde. 1 hafta ko-kültür sonrası işlem immünohistokimyasal ^10, hücrelerin.

Sonuçlar

Önceden gerilmiş hücre kültür sistemi DRG akson hizalama ¹⁰ terfi. DRG nöronları için 12 gün önceden gerilmiş gerek gerilmemiş yüzeylerine kültürlenmiştir. Aksonlar hizalarını göstermek için β-III-tubulin boyandı. 2 Kültür 12 gün sonra önceden gerilmiş gerek gerilmemiş PDMS yüzeylerde akson yönünü karşılaştırır Şekil. rastgele uyum gösterdi ve gerilmemiş PDMS substrat üzerinde birbirine bağlı bir ağ ...

Tartışmalar

önceden gerilmiş bir yüzeye akson hizalama teşvik etmek için, iki kritik adımlar vardır: 1) PDMS zarı ve homojen kalınlıkta düz olmalıdır; ve 2) glia hücreleri DRG uzaklaştırılmalıdır. PDMS ve çapraz bağlayıcı karıştırma ve bir fırında kür sonra, çapraz PDMS jel düz bir tezgah üstünde tutulur ve herhangi bir eğilmesini önlemek için dikkatle ele alınmalıdır. Plazma tedaviden sonra (hücre bağlanması için gerekli olan) sert yüzeye adsorbe zamanla azaltır çünkü PDMS dokunun ok...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal Medium 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Supplement 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Nerve Growth Factor-7S	Invitrogen	13290-010
Penicillin-streptomycin	GibcoBRL	15140-122
0.05% Trypsin-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
Fluoro-2 deoxy-uridine	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Isolation Buffer
Type I Collagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Heat inactivated Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Silicone chamber	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
Plasma cleaning/etching system	March Instruments	PX-250
Anti-Thy 1.1 antibody	Sigma- Aldrich	M7898
Rabbit Complement	Sigma- Aldrich	S-7764
Standard growth medium			For 500 ml Neurobasal Medium 1x, add 10 ml of B-27 50x, 5 ml of Glutamax-I 100x, 2.5 ml of Penicillin/Streptomycin (Penn/Strep), 1 ml of Albumax-I, and 1 μl of NGF-- 7S (50 μg/ml).
FDU Uridine stock solution			FDU 100 mg in 10 ml of ddH2O (10 mg/ml), filter in the hood and divided in 500 μl aliquots and store at -20 ºC. Uridine 5 g in 166.7 ml of ddH2O (33 mg/ml), filter in hood, divide in 200 μl aliquots and store at -20 ºC. Take 61.5 μl of FDU (10 mg/ml) and 20.5 μl of Uridine(33 mg/ml), and add 4,918 μl of ddH2O to a final stock concentration, then divide in 1 ml aliquots and store at -20 ºC.