Klinik Örneklerden RNA Virüs tarafsız Derin Sıralama

Özet

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Özet

Burada de novo meclisleri ve klinik ve biyolojik kaynaklardan toplanan viral genom içi konak varyant aramaları sağlayan yeni nesil RNA sıralama protokol özetlemektedir. yöntem tarafsız ve evrensel olduğu; Bu cDNA sentezi için, rastgele primerler kullanarak ve viral sekans içeriğine hiçbir ön bilgi gerektirir. dahil olmak üzere, poli (rA) taşıyıcı ve ribozomal RNA - - Viral RNA numunesinden kütüphane yapımı önce seçici RNase H tabanlı sindirim istenmeyen RNA tüketmek için kullanılır. Seçici tükenmesi veri kalitesini ve benzersiz sayısının viral RNA dizileme kütüphanelerde okur hem geliştirir. genel kütüphane oluşturma süresini azaltır Üstelik, bir transposaz dayalı 'tagmentation' aşamalı protokol kullanılır. protokol hızlı derin sıralama sağladı 600'ün üzerinde Lassa ve Ebola virüsü örnekleri dahil kan ve doku hem izolatları-ve diğer mikrobik genomik çalışmalar geniş çapta uygulanabilir tahsilatlar.

Giriş

Klinik kaynaklardan virüslerin Gelecek nesil dizileme iletimi ve enfeksiyonların epidemiyolojisi, yanı sıra teşhis yardım desteği romanı, aşı ve tedavi gelişimini bilgilendirebilir. rastgele primerler kullanılarak cDNA sentez farklı eş bulaşmaya genomları ya da yeni bir virüs ^1,2 algılama ve montaj sağladı. diğer tarafsız yöntemlerinde olduğu gibi, istenmeyen kirletici birçok sıralama okur ve olumsuz sıralama sonuçlarını etkileyebilir işgal. Sunucu ve poli (rA) taşıyıcı RNA birçok mevcut viral örnek koleksiyonlarında mevcut kirletici maddelerdir.

protokol tarafsız toplam RNA seq dayalı derin sıralama RNA virüsüdür genom verimli ve maliyet-etkin bir şekilde açıklamaktadır. Yöntem istenmeyen konak ribozomal ve taşıyıcı RNA kaldırmak için bir RNase H seçici tükenmesi adımı ³ kullanır. Zayıflatılması viral içeriğine (Şekil 1) için zenginleştirir ve dizi verileri kalitesini artırırKlinik örneklerden (Şekil 2). Ayrıca, tagmentation önemli ölçüde kütüphane oluşturma süresini azaltır protokol uygulanır. Bu yöntemler, hızlı bir şekilde Ebola ve Lassa virüsü genomlarının ^2,4,5 büyük veri kümelerini üretmek için kullanılmış ve RNA virüslerinin geniş bir çalışma için kullanılabilir. Son olarak, bu yaklaşım, insan örnekleri ile sınırlı değildir; zayıflatılması yardımcı Lassa enfekte kemirgen ve insan olmayan primat hastalık modellerinde ^5,6 toplanan doku örnekleri üzerinde gösterilmiştir.

Şekil 1. Toplam RNA İçerik Zenginleştirme Seçici tükenmesi kullanarak Lassa Virüsü İçerik yansıtır. Dokuz farklı klinik izole edilen rRNA tükenmesi üzerine genel içerik (RNA girişi) ve benzersiz Lassa virüsü (LASV) zenginleşmesine okur (Kütüphane içerik) başlatılıyor. Bu Şekil ^6, modifiye edilmiş . Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Yüksek Kalitede Dizi Taşıyıcı RNA tükenmesi. Poli sıralama döngüsü (rA) başına medyan baz nitelikleri Lassa virüsü kitaplıkları (kırmızı) ve QC raporu ¹³ den kontrol (siyah kütüphanesinde gözlenen hiçbir taşıyıcı) Kontamine sonra. Hem 1 okumak ve eşleştirilmiş sonu 2 kitaplık BAM dosyasında birleştirilir okur ve kalite puanları her üssünde gösterilmiştir okuyun. Bu rakam ^6'dan modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

çıkarılan doğrudan kütüphanelerin viral RNA seq protokol detayları inşaatRNA klinik ve biyolojik örneklerden topladı. kişisel güvenliğini sağlamak için, tüm viral serum, plazma ve doku örnekleri RNA ekstraksiyonu öncesinde uygun tamponlar içinde inaktive edilmelidir. Bazı inaktivasyonu ve çıkarma kitleri, taşıyıcı poli (rA) RNA dahildir; Bu ilk RNase H zayıflatılması aşaması esnasında çıkarılır. tam iyileşme göre taşıyıcı RNA beklenen konsantrasyonu, 100 ng / ml. Protokolde, 110 ng / | il oligo dT RNA (1.1x taşıyıcı yoğunluğu) azalması için kullanılmaktadır. poli (rA), taşıyıcı numunede mevcut değilse, o zaman, oligo (dT) azalması önce ilave edilmemelidir.

Aşağıdaki protokol (250 ul hacim kadar) PCR levha formatında 24 reaksiyonlar için tasarlanmıştır. Bu protokolün bir önceki sürümü Matranga, vd bildirildi. ^6..

Protokol

Etik bildirimi: Lassa Ateşi hastalarının Tulane Üniversitesi, Harvard Üniversitesi, Broad Enstitüsü, Irrua Uzmanı Eğitim Hastanesi (ISTH), Kenema Devlet Hastanesi (KGH), Sağlık, Ibadan Oyo Devlet Bakanlığı insan denekler komiteleri tarafından onaylanan protokolleri kullanarak bu çalışmaya alındı , Nijerya ve Sağlık Sierra Leone Bakanlığı. Tüm hastalar bakım benzer bir standart ile muamele edildi ve çalışmaya katılmak için karar olup olmadığını ilaç Ribavirin, sunuldu. Lassa Ateşi (LF) hastalarda, Ribavirin ile tedavi şu anda tavsiye edilen kurallar takip ve genellikle kısa sürede LF kuvvetli şüphe gibi sunuldu.

Nedeniyle Ebola virüsü Hastalığı (EVD) şiddetli salgın, hasta standart protokoller yoluyla razı olamazdı. EVD hastaların klinik aşırı örneklerin yerine kullanılması değerlendirilir ve Sierra Leone ve Harvard Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulları tarafından onaylandı. OffiSierra Leone Etik ve Bilimsel İnceleme Komisyonu, Sağlık ve Sanitasyon Sierra Leone Bakanlığı ve İnsan Deneklerin Kullanımına İlişkin Harvard Komitesi ce sırası ve hasta ve temas örneklerinden elde edilen kamuya açık viral dizileri yapmak için rıza bir feragat verdiğinizi Sierra Leone Ebola salgını sırasında toplanan. Bu organlar da salgın yanıt sırasında bakım alma tüm şüpheli EVD hastalardan toplanan de tanımlanan örnekler için klinik ve epidemiyolojik verilerin kullanımını verdi. Sağlık ve Sanitasyon Sierra Leone Bakanlığı da salgın örneklerinin genomik çalışmalar için geniş Enstitüsü ve Harvard Üniversitesi'ne Sierra Leone bulaşıcı olmayan, biyolojik olmayan örneklerin gönderiler onayladı.

Örnek RNA (Toplam RNA Çıkarılan kadar 55 ul ~ 4 saat) 1. DNaz tedavi

1. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, bir biyo-güvenlik kabini, buz üzerinde 96 oyuklu bir plaka içerisinde, PCR DNaz reaksiyonu başlatacak 1.1 (toplam hacim 70 ul / kuyucuk) Adım. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir.
2. Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüjlenir.
3. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. RNA Katı Faz Döner İmmobilizasyonu (SPRI) boncuk kullanılarak Temizleme.
   1. Sıcak RNA taneleri oda sıcaklığında 30 dakika için.
   2. Yavaşça yerleşmiş olabilir herhangi bir manyetik parçacıkların tekrar süspansiyon RNA boncuk şişe çalkalanır. DNaz ile muamele edilmiş RNA (70 ul) RNA tanelerin 1.8x hacmi (126 ul) ilave, pipetle 10 kere karıştırmak ve (iyi, 196 ul toplam hacim) oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
   3. Manyetik istasyonunda karışımı yerleştirin. (- 10 dk 5) temizlemek için çözüm bekleyin.
   4. ise pipet ve artıklar ile istasyonda temizlenir çözüm çıkarın. istasyonda da,% 70 etanol ile pelet içeren boncuk yıkama ve 1 dakika boyunca inkübe edin. Pipet ve ıskarta ile etanol çıkarın. İki yıkamadan toplam tekrarlayın.
      Not: tam olarak% 70 taze hazırlanmış et kullanılmasınumunenin ⁷ kaybına neden olabilir <% 70 etanol ise daha yüksek bir yüzdesi, küçük ölçekli moleküllerin verimsiz yıkama neden olacaktır olarak HANOL, kritik öneme sahiptir.
   5. istasyonunda plaka tutun ve kurumaya açık bırakın. Not: boncuk çatlamak başlayana kadar boncuklar tamamen kurumasını bekleyin emin olun.
   6. RNA elüte etmek için plakaya nükleaz içermeyen su 55 ul ekle. iyice pipetleme boncuk ve su karışımı istasyonundan plakasını sökün. Not: Alternatif olarak, toplam RNA konsantre etmek için (10 ul ≤) daha az su kullanın.
   7. geri istasyonunda plaka koyun. çözüm uzun süreli depolama için yeni vidalı kapaklı tüp pipet ile transfer temizler kadar bekleyin (-80 ° C). tükenmesi için yeni 96-PCR plaka 5 ul RNA yerleştirin (adım. 2.4).
   8. İsteğe bağlı. Kaydedin ve rRNA QRT-PCR için 19 ul su (1:20) 1 ul seyreltik (örneğin, 18S, 28S rRNA) (Tablo 2) ve viral belirteçler ⁵

Viral RNA Numune gelen Ribosomal ve Taşıyıcı RNA 2. Seçici tükenmesi (~ 4 saat)

1. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi lineer akrilamid taşıyıcı ile 5x hibridizasyon ve 10x RNase H, reaksiyon tamponları ve nükleaz içermeyen su sağlayın.
2. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, bir 96-yuvalı PCR plaka buz üzerinde rRNA tükenmesi oligolar (Tablo 3) ve oligo (dT) RNA birleştirerek melezleştirme reaksiyonu ayarlayın.
   Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir. Özel bir sentetik RNA (ERCCs ⁸⁾ 50 femtogram (FG), viral sıralama işlemi ve potansiyel indeksi okunur çapraz kontaminasyonu iki izleme için ilave edilebilir.
   1. Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüjlenir.
      saniyede -0.1 ° C de 45 ° C, 2 dakika, yavaş rampa 95 ° C'de inkübe edin. 45 ° C 'de PCR Pause.
3. açıklandığı gibi buz üzerinde RNaz H reaksiyon karışımı kurmakTablo 1 'de D, daha sonra 2 dakika boyunca 45 ° C'de ısıtın. Not: Bir ana karışımı hazırlanmış olabilir.
   1. 45 ° C 'de PCR plakası tutarken plaka melezleştirme reaksiyonu, önceden ısıtılmış RNase H karışımı ekleyin.
   2. 8 kez - Nazik pipetleme 6 ile iyice karıştırın. 30 dakika daha 45 ° C'de inkübe edin. buz üzerine yerleştirin.
4. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi buz üzerinde DNaz Reaksiyon karışımı ayarlama Not:. Bir ana karışımı hazırlanabilir.
   1. plaka RNaz H reaksiyonuna ekleme, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüjlenir. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. 5 ul 0.5 M EDTA ilave ederek DNase reaksiyonu durdurun. Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüjlenir.
5. Bir 1.8x hacmi (144 ul) boncuk kullanılarak RNA boncuk (adım 1.3) kullanılarak Temizleme. nükleaz içermeyen su 11 ul Zehir. Not: Güvenli soğuk hava deposu, mağaza RN tükenmişBir numuneler -80 ° C Ç / N.

3. cDNA Sentezi (~ 6 saat)

1. Karışım rRNA / 96 oyuklu bir plaka, PCR buz üzerinde rastgele primerler taşıyıcı tükenmiş RNA Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüjlenir.
   1. bir PCR, 10 dakika boyunca 70 ° C'ye kadar karışım ısıtılır. 5 dakika - hemen ısı denatürasyon sonra, 1 buz üzerinde RNA yerleştirin. RNA önce ilk iplikli tepki daha uzun 5 dakika boyunca (hatta buz üzerinde) durmasına izin vermeyin.
2. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi buz üzerinde birinci sarmal sentezi, reaksiyon karışımı ayarlayın.
   Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir.
   1. plaka RNA / rastgele primer karışımı ekleyin, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüjlenir. 10 dakika boyunca 25 ° C'de - 22 C'de inkübe edilir.
   2. 60 dakika boyunca bir hava kuluçka makinesi içinde 55 ° C'de inkübe edin. Tepkimeyi sonlandırmak için buz üzerinde plaka koyun. DeğilE: Hava kuluçka kullanımı primerleri tavlama ve ilk şerit uzunlamasına başlar sırasında birinci dal reaksiyonu yavaş yavaş ısınmaya oluşturmak için tavsiye edilir.
3. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi buz üzerinde ikinci sarmal sentezi, reaksiyon karışımı ayarlayın.
   Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir.
   1. plaka birinci sarmal sentezi, reaksiyon ekleme, girdap yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüjlenir. 16 ° C (25 ° C 'de kapağı tutmak) 2 saat süreyle inkübe edin. sıcaklığın 16 ° C'nin üzerine çıkmasına izin vermeyin.
   2. daha sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüj, yumuşak ve iyice karıştırın, 0.5 M EDTA, 5 ul ekleyerek reaksiyonu inaktive, buz üzerinde plaka koyun.
4. boncuklar 1.8x hacmi (153 ul) kullanılarak DNA boncuk (protokolü için adım 1.3) ile Temizleme. Elüsyon tamponu 9 ul (EB) 'de Zehir. ölçümü için 1 ul kaydedin. subseque için cDNA 1 ng kullanımınt adımlar. cDNA konsantrasyonu tespit tagmentation için cDNA 4 ul kullanmak için çok düşük ise (adım 4.1).
5. Güvenli soğuk hava deposu, mağaza at cDNA çift sarmallı 4 ° CO / N veya -20 Uzun süreli depolama için ° C.

4. Kütüphane Hazırlık - DNA Kütüphane İnşaatı (~ 4 saat)

1. Gerekirse, 96 oyuklu bir plakaya transfer cDNA 4 ul ve bir ikinci girişimde kalan cDNA kaydedin.
2. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi buz üzerinde tagmentation reaksiyonu ayarlayın.
   Not: Bir ana-mix hazırlanmış olabilir. arka plan ve genel maliyeti azaltmak için, tagmentation reaksiyonun toplam hacmi 20 ila 10 ul arasında azaltılır. CDNA, kısıtlayıcı bir faktör olduğu için, reaksiyonda kullanılan ATM (yani, transposome) miktarı, aynı zamanda entegrasyon sitelerinden sayısını azaltmak için azaltılır.
   1. 1 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 280 xg'de yavaşça ve iyice ve santrifüj plaka, girdap cDNA için tagmentation karışımı ekleyin.10 ° C'de tutun 5 dakika boyunca 55 ° C'de inkübe edin.
   2. Bir kez 10 ° C'de hemen reaksiyonu sona erdirmek için nötralize Tagment tamponu (NT) 2.5 ul ekle. yukarı pipetleme karıştırın ve aşağı, sonra 1 dakika boyunca (oda sıcaklığında) 280 xg'de santrifüj.
   3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
3. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi buz üzerinde PCR amplifikasyon reaksiyonu ayarlayın.
   1. Vorteks yavaşça ve iyice, sonra 1 dakika için oda sıcaklığında 280 x g'de santrifüjlenir.
   2. Tablo 1 'de tarif edilen koşullar kullanılarak ısıl PCR gerçekleştirin.
      Not: PCR 12 çevrim tagmented cDNA 1 ng önerilmektedir; Ancak, viral klinik örneklerin çoğu kez cDNA belirlenemeyen miktarda var. cDNA (<1 ng) düşük miktarlar için, sıralama için yeterli bir kütüphane oluşturmak için PCR 18 döngü kadar kullanabilirsiniz.
4. Kütüphane Hazırlık - temizleme ve sıralama için havuzu
   1. EB ile 50 ul örnek getirin.
   2. ile Temizleme0.6x hacmi (30 ul) boncuk kullanılarak DNA boncukları (protokolü için adım 1.3). 15 ul EB Zehir.
   3. Bölge analizinden astar dimerleri (~ 120 bp) hariç Bioanalyzer yazılımını ⁹ kullanarak bölge analizi (150 bp 1,000) yaparak kitaplığı (Şekil 3) konsantrasyonunu belirlemek. Not: Alternatif olarak, qPCR kütüphaneleri ¹⁰ ölçmek için kullanılabilir.
   4. 1 nM ya da daha düşük mol konsantrasyonda Havuz kütüphaneleri. Kütüphane 1 nM altında ise bu kütüphanelerden dizi bilgileri yakalamak için havuz (diğer kütüphanelerin ~ 1x hacmi) için kütüphaneye küçük bir hacim kazandırmak.
   5. Yukarıda belirtildiği gibi 0.7x DNA boncuklar ile temizleme havuzu (bkz: adım 2). 15 ul EB Zehir. Not: tanelerin hacmi havuzunda nihai hacmine bağlı olacaktır.
   6. Havuz ⁹ analiz edin. Bölge analizi (150 bp 1,000) ⁹ yaparak molar konsantrasyonunu belirlemek. Not: Alternatif olarak, qPCR kütüphanesi havuz ^{10 <ölçmek} için kullanılabilir/ Sup>.
   7. Çift barkod ¹¹ okur ile 101 bp oluşturmak için 22:00 kütüphane konsantrasyonda yük sequencer, paired-end okur.

Ebola virüsü Klinik Örneklerden inşa 3. Kütüphaneler Şekil. 4 temsilci Ebola virüsü (EboV) kütüphanelerin Jel görüntüsünü. Kütüphane ve astar dimerleri Bölgeler gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Sonuçlar

açıklanan protokol eşsiz viral içerik zenginleştirici ise yüksek kaliteli dizileme nesil düşük giriş viral RNA örnekleri okur sağlar. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bir protokol en az 18S rRNA (~ 100 pg toplam RNA)' in en az bir milyon adet olan (sigara tükenmiş kontroller ile karşılaştırıldığında) Bütün numuneler, beş kat özgü Lassa virüsü içerik zenginleştirilmiş. Benzer şekilde, dizi başarısı, belirli bir örnek içinde virüs miktarı ile korelasyon gösterdi. Viral miktar için bir vekil, ~ en sık tam montajları oluşturulan 1.000 veya daha fazla virüs genom kopyaları içeren numune olarak QRT-PCR kullanılarak (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, poli (rA) taşıyıcının deliği (Şekil 2) okur temiz preparasyonlarda elde edilen ve daha iyi kalitede sıralama sağlanması kütüphanelerinde A ve T homopolimer dizileri azaltır. düşük giriş viral klinik örneklerden Final kütüphaneler genellikle 150 1000 bp geniş bir fragman uzunluğa sahip(Şekil 3).

Sıralama sonra, havuz ¹² içindeki kütüphaneleri arasında örnek yanlış tanımlanma problemleri ve karışma azaltmak için, sadece index 25 (S25) bir taban kalite puanı ile okur ve sıfır uyumsuzlukları demultiplexing sürecinde tutulur emin olun. Viral genom farklı virüs ^2,4-6 özgü biyoenformatik boru hattı kullanılarak birleştirilebilir. Bu araçlar https://github.com/broadinstitute/viral-ngs ya da ticari bulut platformları ⁴ edinilebilir.

Adım 1.1: DNaz tepki
reaktif	Reaksiyon başına hacim (ul)
10x DNaz tamponu	7
Nükleaz içermeyen su	6
Çıkarılan viral RNA'nın	55
DNase (2 U / & #181 L)	2
Toplam ses	70
5x hibridizasyon tamponu: 2.1 Adım
reaktif	1 ml hacim (ul)
5 M NaCI	200
1 M Tris-HCl (pH 7.4)	500
Nükleaz içermeyen su	300
Toplam ses	1000
Adım 2.1: 10x RNaz H reaksiyon tamponu
reaktif	1 ml hacim (ul)
5 M NaCI	200
1 M Tris-HCl (pH 7.5)	500
1 M MgCI2	200
Nükleaz içermeyen su	500
Toplam ses	1000
Aşama 2.1: su wi sayılı lineer akrilamid
reaktif	1 ml tampon için Volume (ul)
Nükleaz içermeyen su	992
Doğrusal akrilamid (5 mg / ml)	8
Toplam ses	1000
Aşama 2.2: zayıflatılması için bir melezleştirme tepkimesi
reaktif	Reaksiyon başına hacim (ul)
5x hibridizasyon tampon	2
rRNA-tükenmesi oligo karışımı (100 uM)	1.22
Oligo (D) S (550 ng / | il),	1
DNaz ile muamele edilmiş toplam RNA,	5 e kadar
Spike-RNA (Bu isteğe bağlıdır)	0.5
Su (lineer akrilamid ile)	10 toplam getirmek
Toplam VOLUben mi	10
Adım 2.3: seçici tükenmesi için RNaz H tepki
reaktif	Reaksiyon başına hacim (ul)
10x RNase H Reaksiyon Tamponu	2
Su (lineer akrilamid ile)	5
Termo RNaz H (5 U / ul)	3
Toplam ses	10
Adım 2.4: DNaz reaksiyon sonrası seçici tükenmesi
reaktif	Reaksiyon başına hacim (ul)
10x DNaz Tampon	7.5
Su (lineer akrilamid ile)	44.5
RNaz inhibitörü (20 U / ul)	1
Rnaz içermeyen Dnaz I (2.72 U / ml)	2
Toplam hacim (Rnaz H reaksiyonu ile)	75
Adım 3.1: cDNA sentezi, rasgele primer melezleme
reaktif	Reaksiyon başına hacim (ul)
rRNA / taşıyıcı tükenmiş RNA	10
3 ug rasgele primer	1
Toplam ses	11
Aşama 3.2: Birinci sarmal cDNA sentez reaksiyonu
reaktif	Hacim (ul)
5x İlk Strand Reaction Buffer	4
0.1 M DTT	2
10 mM dNTP karışımı	1
RNaz inhibitörü (20 U / ul)	1
Ters transkriptaz (son ekleyin)	1
(Yukarıdaki RNA) ile toplam hacmi	20
Adım 3.3: İkinci iplik cDNA sentezi reaksiyonu
reaktif	Hacim (ul)
RNaz içermeyen su	43
10x İkinci Strand Reaction Buffer	8
10 mM dNTP karışımı	3
E. Coli DNA ligaz (10 U / ul)	1
E. coli DNA polimeraz I (10 U / ul)	4
E.coli RNaz H (2 U / ml)	1
Toplam hacim (1 inci iplikçik reaksiyon)	80
Adım 4.2: Tagmentation reaksiyonu
reaktif	Hacim (ul)
Amplikon Tagment Mix (ATM)	1
Tagment DNA Tampon (TD)	5
Toplam hacim (cDNA)	10
Kütüphane PCR reaksiyonu: 4.3 Adım
reaktif	Hacim (ul)
PCR Master Mix (YKY)	7.5
Endeks 1 astar (i7)	2.5
Endeks 2 primer (i5)	2.5
Toplam hacim (cDNA tagmented) ile	25
Aşama 4.3.2: Kütüphane PCR koşulları
72 ° C, 3 dakika
95 ° C, 30 saniye
95 ° C'de 18 devir-10 saniye, 55 ° C'de 30 saniye, 30 saniye için 72 ° C 'de
72 ° C, 5 dakika
10 ° C, sonsuza

Tablo 1:. Reaksiyon set-up ve tamponlar Adım adım tüm tamponlar ve reaksiyon karışımlarının içeriği ile tablolar.

Tablo 2: QRT-PCR Astarlar Diziler ana bilgisayar (18S rRNA) ve viral (Ebola ve Lassa) içeriği ölçmek için kullanılan primerler.. 'KGH' Ebola primerleri ² test edildi Sierra Leone, içinde Kenema Devlet Hastanesi olduğunu. 'Kulesh' primer ¹⁴ set tasarlanmış araştırmacı olduğunu.

Tablo 3: Ribozomal RNA (rRNA) tükenmesi Oligo seçici tükenmesi adım ⁶ insan rRNA tamamlayıcı 195 50 nükleotid uzunluğunda diziler.. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.

oligo Adı	Sıra (5 'ila 3')
Ebola KGH FW	GTCGTTCCAACAATCGAGCG
Ebola KGH RV	CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT
Ebola KULESH FW	TCTGACATGGATTACCACAAGATC
Ebola KULESH RV	GGATGACTCTTTGCCGAACAATC
Lassa SL FW	GTA AGC CCA OBEB GYA AAB CC
Lassa SL RV	AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A
18S rRNA FW	TCCTTTAACGAGGATCCATTGG
18S rRNA RV	CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT

Tartışmalar

Özetlenen yaklaşım sağlam, evrensel, hızlı sıralama sağlar ve 2014 mihrak ^2,4 sırasında Ebola virüsü sıralanması için kullanılmıştır. tagmentation kütüphane yapımı seçici tükenmesi ve cDNA sentezi birleşerek, genel işlem süresi bir önceki bağdaştırıcı ligasyon yöntemleri ~ 2 gün kadar azaltılmıştır. Daha yakın zamanlarda, bu protokol büyük bir başarı ^15,16 ile uluslararası işbirlikçileri ve diğerleri tarafından istihdam edildi ve yerel genomik tabanlı araştırmalar ve teşhis ¹⁷ desteklemek için Batı Afrika'da laboratuarlara görevlendirilecek.

Burada açıklanan protokol Viral RNA'ya DİZİ kütüphaneleri için cDNA hazırlamak için rastgele primerler kullanılır. Önceki Viral RNA'ya DİZİ yaklaşımlardan farklı olarak, hiçbir özel bir virüs ya da dalının için sekans verileri veya karmaşık ve zaman alıcı bir primer tasarımı hakkında önsel bir bilgi gerektirmektedir. yöntem, herhangi bir viral RNA numunesinin tatbik edilebilir. Örneğin, her iki Ebola viral içeriği oluşturmak için kullanılanve Lassa örnekleri ^6. Protokolü ayrıca ana transcriptomic, metagenomic ve patojen bulma dizi projelerine ¹ için de kullanılabilir.

protokol kritik bir safha, Rnaz H sindirim, yüksek verimli viral örnekleri istenmeyen bir taşıyıcı ve konakçı RNA çıkarmak için düşük maliyetli bir yöntemdir hedeflenmektedir. protokol seçici tükenmesi adımı birçok bileşenleri kullanır ve beceri ve doğruluk gerektirir. Ekstra zaman ve bakım ilk kurulum sırasında alınmalıdır.

çoğu klinik serum ve plazma numuneleri genellikle çok az nükleik asit malzeme var gibi, kirlenme ve örnek kaybı yaygındır. Bu protokolü kullanırken bu sorunları önlemek için, özel bakım alınmalıdır. İlk olarak, RNA ayrışma son derece duyarlı olduğu; Bu nedenle tüm alanları temiz ve nükleazlar arındırılmış olmalıdır. İkinci olarak, bu protokolde kullanılmak için müsait örnekleri belirlemek için, her iki ana RNA ve virüs için QRT-PCR miktarının ^5,6 kullanılmalıdır . Giriş karşılaştıran protokolden sıralama sonuçları, sıralama başarı ile miktarlar zaman (yani, tam viral montaj için yeterli veri nesil) en az 100 pg toplam RNA ve virüsün 1,000 kopya içeren örnekleri ile ilişkili. Nükleik asitlerin, çevresel kaynaklardan Üçüncü olarak, maruz kaçınılmalıdır. Burada özetlenen protokol güvenlik önlemleri için bir biyogüvenlik kabini ve çevre kirleticileri sınırlamak için yapılır. Ayrıca, bizim grup ve diğerleri ticari enzimler düşük girdi örneklerinde ^6,18 bakteriyel nükleik asitlerin kirletici başka bir kaynak olabileceğini fark etmiş. Temiz bir çalışma alanı (örneğin PCR kaput, biyogüvenlik kabini) ve negatif kontrollerin kullanımı (örneğin, su veya tampon), sırasıyla hafifletmek ve kirlenmeyi izlemenize yardımcı olacaktır. numuneler için 19 daha uygun olabilir.

Ev sahibi rRNA tükenmesi dizileme kütüphaneleri viral içeriğinden zenginleştiren ve serum veya plazma, kemirgenler ve insan olmayan primatlar ^5,6 dokuların çok tip dahil olmak üzere farklı Numune alım için de geçerlidir. 28S rRNA tükenmesi sonra kalan insan olmayan organizmalar, rRNA, insan ve diğer türler ^6,20 arasında daha az korunmuş bir 28S düşündürmektedir hizalama okunur. Insan olmayan izolatlar, bu yöntem kullanılarak, belirli bir ana bilgisayar ^3,21 ıraksak rRNA dizilerine tamamlayıcı DNA oligo ile tamamlamak için gerekli olabilir.

Protokol tarafsız olduğu viral toplam kütüphanesi içeriğinin sadece küçük bir bölümünü temsil edebilir okur. rRNA en bol konak RNA türlerinin ve sadece rRNA küçük bir yüzdesini okur (olmasına rağmen0% 1), seçici yok olmasından sonra, tüm diğer konakçı RNA (örneğin mRNA) yok olmasından sonra kalır ve bir çok dizi örnek okur için hesap bulunur. Bu nedenle "örnekleme" (yani, oversequencing), ayrı ayrı kütüphaneler, viral düzeneği ve varyant aramalar için yeterli kapsama alanı elde etmek için gereklidir. Bizim çalışmaları için, biz dizisine ~ 20 milyon viral genomik ve ilişkili varyantların analizi için yeterli derinlik yanı sıra metagenomic içeriğin ^2,5 olması numune başına okur girişimi. metagenomic ve patojen bulma çalışmaları için, konakçı DNA kirletici DNase sindirilerek kaldırılır dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle DNA genomları ihtiva virüs ve diğer patojenleri sürecinde kaybolmuş olabilir, ancak RNA ara yine sıralı olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well PCR Plates	VWR	47743-953
Strips of Eight Caps	VWR	47745-512
Nuclease-free water	Ambion	AM9937	50 ml bottle
TURBO DNase	Ambion	AM2238	post RNA extraction step, 2 U/µl, buffer included
PCR cycler			any PCR cyclers
Agencourt RNAClean XP SPRI beads	Beckman Coulter Genomics	A63987	beads for RNA cleanup
Real Time qPCR system			any system
DynaMag-96 Side Skirted Magnet	Invitrogen	12027
70% Ethanol			prepare fresh
qRT-PCR primers	IDT DNA		see Table 2
5 M NaCl	Ambion	AM9760G
1 M Tris-HCl pH 7.4	Sigma	T2663-1L
1 M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Linear acrylamide	Ambion	AM9520
DNA oligos covering entire rRNA region	IDT DNA		see Table 3, order lab-ready at 100 µM
Oligo (dT)	IDT DNA		40 nt long, desalted
Hybridase Thermostable RNase H	Epicentre	H39100
RNase-free DNase Kit	Qiagen	79254	post selective depletion step
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Random Primers	Invitrogen	48190-011	mostly hexamers
10 mM dNTP mix	New England Biolabs	N0447L
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080-093	with first-strand buffer, DTT
Air Incubator			any air incubator cyclers
NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer	New England Biolabs	B6117S	10x
E. coli DNA Ligase	New England Biolabs	M0205L	10 U/μl
E. coli DNA Polymerase I	New England Biolabs	M0209L	10 U/μl
E. coli RNase H	New England Biolabs	M0297L	2 U/μl
0.5 M EDTA	Ambion	AM9261
Agencourt AMPure XP SPRI beads	Beckman Coulter Genomics	A63881	beads for DNA cleanup
Elution Buffer	Qiagen		10 mM Tris HCl, pH 8.5
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
Qubit fluorometer	Invitrogen	Q32857
Nextera XT DNA Sample Prep Kit	Illumina	FC-131-1096
Nextera XT DNA Index Kit	Illumina	FC-131-1001
Tapestation 2200	Agilent	G2965AA
High Sensitivity D1000 reagents	Agilent	5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584
BioAnalyzer 2100	Agilent	G2939AA
High Sensitivity DNA reagents	Agilent	5067-4626
Library Quantification Complete kit (Universal)	Kapa Biosystems	KK4824	alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification