Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Özet

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Özet

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

Giriş

Cam ya da topuk kısmı yüzeylerinde gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme DNA alt tabakası, ^1,2 ve polimer fizik DNA-protein etkileşimleri, protein dinamiği araştırmak için kullanılmıştır. ^3,4 tek gergin büyük DNA molekülleri için bir platform tat birkaç var avantajlar diğer DNA immobilizasyon yöntemlerine göre. ⁵ İlk ^olarak, yüzey üzerinde gergin büyük bir DNA molekülü bağlanma sitesi tanıyan bir DNA-bağlama proteini için kritik öneme sahip olan bir kesme akışı olmadan doğal rasgele sargı bir biçime sahiptir. İkinci olarak, bir akış odasının enzimatik reaksiyonlar için bir dizi DNA molekülüne kimyasal ortamı değiştirmek oldukça kolaydır. Üçüncü olarak, bir mikroakışkan kesme akımı alternatif DNA uzama kullanarak elde etmek çok zordur tam kontur uzunluğu,% 100 kadar uzanan moleküler DNA, yüzey immobilizasyon ⁶ ve nanochannel hapsi olarak yaklaşımları neden olur. ⁷ A stretche tamD bir DNA molekülü genomik haritada enzimatik hareketlerini izlemek için yararlı olabilir konumsal bilgi sağlar.

Bununla birlikte, DNA, bağlama yaklaşım, YOYO-1 genel olarak, bağlı DNA molekülleri kolaylıkla flüoresan uyarma ışık kırılması neden olduğu için bu araya eklenen boyanın önemli bir dezavantajı vardır. Genel olarak, büyük DNA moleküllerinin bir flüoresan mikroskobu altında görüntülenmesi için bir floresan boya ile boyanmış olması gerekir. Bu amaçla, YOYO-1, ya da diğer TOTO serisi boyalar da iki-şeritli DNA interkalasyon olduğunda bu boyalar, sadece floresan için öncelikle kullanılır. ⁸ Bununla birlikte, bis-araya eklenen boyanın ışık kaynaklı DNA verilmedi-bölünme için neden olduğu iyi bilinmektedir fluorophores ardalanması. ⁹ ayrıntılı bir yüzeyde gergin floresan lekeli DNA molekülleri kesme akımları serbestçe DNA moleküllerini hareketli kuvvetleri kırılma uygulamak beri daha kırılgandır. Bu nedenle, biz bir roman D olarak FP-DBP geliştirdiyüzey üzerinde gergin büyük DNA moleküllerini görüntülenmesi için NA-boyama Protein boya. AP-DBP kullanmanın avantajı, bunun bağlandığı DNA moleküllerinin verilmedi-bölünmesini neden olmasıdır. ^10. Ayrıca bis-interkalasyon boyalar çevre uzunluğu artmakta, AP-DBP, DNA çevre uzunluğu artmaz yaklaşık% 33.

Bu video yöntemi PEG-biyotin yüzeye büyük DNA moleküllerini hayvan zinciri için deneysel bir yaklaşım getirmektedir. 1 küt uçlar ve yapışkan uçları ile DNA tethering farklı yaklaşımlar göstermektedir Şekil. Bu durumda, bu boyama yöntemi, DNA molekülünün her türlü uygulanabilir. 2 DNA moleküllerini germek için ve kimyasal ve enzimi yüklemek için kesme akışı üretmek üzere bir şırınga pompası ile kontrol edilebilir akış odası düzeneğinin şematik bir temsilini tasvir etmektedir çözümler. Şekil 3 PEGylat üzerinde gergin tamamen gerilmiş DNA moleküllerinin mikrograflarını gösteriyorEd yüzeyi ¹¹ ve AP-DBP ile boyandı.

Protokol

1. DNA Biyotinilasyon

1. Terminal transferaz kullanılarak kör uçlu DNA biyotinilasyon (TdT)
   Not: künt uçlu DNA Kullan T4 DNA (166 kbp).
   1. 2.5 mM _CoCl2, 10 x reaksiyon tamponu 5 ul 10 mM biyotin-11-dUTP ve 0.5 ul, terminal transferaz 0.5 ul (10 birim) ve T4 DNA 0.5 ul (0.5 ug / ul), 5 ul ekle reaksiyon karışımına. Su 38.5 ul ekleyerek 50 ul son hacim olması için yapın.
   2. 1 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyon karışımı inkübe edin.
      Not: Genişletilmiş reaksiyon süresi, yani çift gergin DNA verebilir, biotins iki ucunda etiketlenmiş olması mümkündür.
   3. 0.5 M EDTA, pH 8 5 ul ilave ederek reaksiyonu durdurun.
   4. 4 ° C'de tüp tutun.
2. DNA ligazı kullanılarak yapışkan uçlu DNA biyotinlenmesi
   Not: Bir yapışkan uç DNA Kullan λ DNA (48.5 kbp).
   1. T4 DNA ligaz 1 ul 10 x ligasyon tampon maddesi 5 ul, 25 ng 1 ul ekle / λ faj DNA ul ve 50 ul bir son hacim yapmak için, su 43 ul ilave edin.
   2. 4 ° C'de tüp tutun.

2. İşlevsel yüzey türetilmesi

Not:. Şekil 1 'de gösterildiği şekilde, cam yüzey üzerinde bir DNA molekülünün bir son halata için, bir birincil amin grubu biyotin-PEG kaplama ardından bir lamel silanlı olan bu PEGilasyon prosesi, tek bir molekül, DNA görüntüleme için önemlidir çünkü o önemli ölçüde yüzeyde istenmeyen moleküllerin eki tarafından oluşturulan rastgele gürültüyü azaltabilir.

1. piranha Temizleme
   Not: Piranha çözümleri bu nedenle uygun güvenlik yönergeleri izleyerek, dikkatle ele alınmalıdır, organik malzemelerle şiddetle tepki.
   1. Bir yerde bir politetrafloroetilen (PTFE) rafa lamelleri, b onları tutuny PTFE boyuna iplik mühür bandı, raf üzerinde yüzeylerin kenarında ve yarım yarım. sarma sonra, temizlik işlemi sırasında raf işlemek için bant uzun parçası (~ 5 cm) bırakın.
   2. _{SO, H2O 2 4} ve 150 ml davlumbaz pirana çözelti yapmak için _H2, 350 ml 1 L cam beher. 2 saat pirana çözelti içinde raf yerleştirin.
   3. beher su pH kadar iyonu giderilmiş su ile iyice boş kaptan pirana çözeltisi ve durulama lamelleri nötr ulaşır. pH kağıdı şeritleri kullanın.
   4. 30 dakika süre ile, beher içeren su içinde kapak slipleri raflar sonikasyon. beher sadece amino silanizasyon önce boş su. cam yüzeylerin temizlenmesi ve türetmek için sonikasyon gücü 75 W kullanın.
2. Cam Yüzeyinde Aminosilanization
   1. N 2 ml ilave edilir - [3- (trimetoksisilil) propil] etilendiamin ve 200 ml buzlu asetik asit 10 miaminosilanization çözeltisinin hazırlanması için temiz polipropilen kaba metil alkol.
   2. polipropilen kaba temizlenmiş lamelleri yerleştirin. 30 dakika boyunca 100 rpm'de ve oda ısısında çalkalanır.
   3. W, en az 30 dakika boyunca 100 rpm'de ve oda ısısında çalkalayın 75 ° C'da 15 dakika için türetilmiş kapak slipleri ile beher sonikasyon.
   4. etil alkol ile iki kez beher solüsyonun boşaltın ve metil alkol ile bir kez dikkatli bir şekilde lamelleri durulama ve. Mağaza etil alkolde lamelleri ve iki hafta içinde bunları kullanmak.
3. Lamel PEGilasyon
   1. 0.1 M sodyum bikarbonat, 10 ml _(NaHCO3) sağlayın. 0.22 um'lik bir şırınga filtresi ile filtre solüsyonu.
   2. Biyotin-PEG-süksinimidil karbonat (biyotin-PEG-SC) NaHCO ₃ 350 ul PEG-süksinimidil valerat 80 mg (mPEG-SVG) 2 mg eritin. hafif bir koruma tüpü kullanın.
   3. 1 için kuvvetli bir şekilde tüp vorteks0 sn ve santrifüj o 1 dk kabarcıklarını çıkarmak için 10.000 x g'de.
   4. etil alkol ile yıkama, ardından aseton ile, bir cam slayt, durulayın. havaya slayt tamamen kurumasını bekleyin.
   5. temiz bir cam slayt PEG çözeltisi bir damla (50 ul) yerleştirin. herhangi bir kabarcıklar oluşturmadan, bir amino Silanlanmış kapak kayma ile hafifçe damlacık örtün.
   6. 3 saat boyunca yer slaytlar gecede karanlıkta oda sıcaklığında nemli odasını iyi tesviye etmek. altta su ile oda olarak boş bir pipet ucu tutucu kullanın. tüp içinde kalan PEG çözeltisi kapatılır ve 4 ° C'de tutun.
   7. iyonu giderilmiş su ile iyice PEG'lenmiş lamel durulayın. kullanana kadar karanlık ve kuru bir yerde saklayın.

3. Bir akış odası Montaj

1. . Şekil 2'deki gibi, bir delikli akrilik tutucu imal boru ucun çapı 0.762 mm olduğundan emin olun ve bir delikli bir giriş olduğu tayin ve diğeribir çıkış (Şekil 2).
2. Herhangi bir kanal delik perturbing değil, bir giriş ve çıkış deliğine dik hizalama çift taraflı yapışkan bant şeritler akrilik tutucu (genişlik 5-6 mm) (Şekil 2), yerleştirin. Çok kanallı duvarları odaları yapmak için bu bant şeritlerini kullanın. Bir pipet ucu kullanılarak bandı fırçalayın.
3. yüzükoyun PEG'lenmiş tarafı, akış odalarını yapmak için üstüne bir PEG'lenmiş lamel yerleştirin.
4. sızıntı herhangi bir çözüm önlemek için, çift taraflı bantlar yerleştirilir alana bir lamel üstüne basın. Üst ve alt (Şekil 2'de sarı renk) de odacığın kenarlarını kapatma çabuk kuruyan epoksi yapıştırıcı ekleyin.
5. Bir gaz geçirmeyen şırınga boru (dış çapı OD, 0.042 ") arasında kısa bir parça (2.5 cm) geç ve epoksi yapıştırıcı ile bağlantıyı tıkamak.
6. şırınga ile bağlantılı boru ve epoksi yapıştırıcı ile ortak mühür: Uzun esnek borular (0.03 "OD) bağlayın.
7. Tubi doldurunng DI su ile şırınga ile bağlantılı. hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun.
8. epoksi yapıştırıcı ile kapatılmış akış odasının deliğe boru yerleştirin.
9. bir rezervuar olarak diğer delik sarı ucu (200 ul ucu) yerleştirin.

Akış Odası içine 4. Numune Yükleme

Not: Neutravidin streptavidin gibi diğer avidin protein ile değiştirilebilir. Bu açıklanan sürece bütün tepkimeler, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. Sarı uç örnek çözümü almak ve akrilik tutucu (Şekil 2b) deliği üzerine solüsyonu ile ucu yükleyin.

1. / Dakika, 50 ul şırınga pompa akış hızını ayarlayın. Yük avidin protein 20 ul (T50 çözeltisi içinde 25 ug / ml, 10 mM Tris, NaCl 50 mM, pH 8), 10 dakika için tutun.
2. Yük 20 biyotinlenmiş oligodeoksinükleotidler ul (1 x TE 100 uM) ve 10 dakika için tutun. terminal transferaz kullanılırsa, yükleme atlamakoligodeoksinükleotidler evi.
3. Yük 20 10 ul / dk'lık bir akış oranında akış odasına Kademe 1 DNA çözeltisi ul ve 30 dakika için tutun.
4. 1 × TE ile akış odasına yıkayın ve FP-DBP ¹⁰ (~ 80 nM) 40 ul yükleyin.
5. 60X objektif lens 1 × TE boyama moleküllerin sürekli akış ile floresan mikroskop altında DNA gözlemleyin. FP (eGFP) -DBP uyarılması için 488 nm katı hal lazer kullanın. DNA moleküllerinin tam germek için, kullanılan DNA uzunluklarına göre farklı akış oranlarına uygulanır. Örneğin, T4 DNA 166 kbp için λ DNA 48.5 kbp, ve 100 ul / dakika 50 ul / dak uygulanır.
   1. Akrilik tutucu geri dönüşümü için, bir deterjan çözeltisi ¹² monte akış odaları ıslatın. tamamen çıkarmak için elleriyle bir jilet ve ovalayın kasetleri ve epoksi çıkarın. şırınga iğneleri ile delikleri unclog. sonraki kullanıma kadar deiyonize su içinde tutucular tutun.

Sonuçlar

Şekil 1, 1b, Şekil. Şekil 1a yapışkan uçlu DNA moleküllerinin avidin kaplı PEG yüzeyi üzerinde hareketsiz tamamlayıcı biyotinile oligonükleotid ile melezlenir verilmektedir. DNA molekülünün ucu yapısına bağlı olarak, iki farklı DNA bağlama yöntemleri gösterir eklenmesini gösterir biyotinile ddNTP veya terminal transferaz ile kör uçlu DNA 3 'hidroksil grubuna dNTP. Bu DNA moleküllerinin yapıları ve biyoti...

Tartışmalar

Burada yüzeylerde ankraj için biyotinile uzun DNA moleküllerini görselleştirmek için bir platform sunuyoruz. Bu biyotinile sığır serum albümini ile bir avidin protein kaplı yüzey üzerine gergin DNA molekülleri için bir yaklaşım. ^6. önceki yaklaşımda bildirmiştir, biz gergin DNA moleküllerini leke bis-interkalasyon boyalar neden olduğu DNA verilmedi-parçalanmasının önemli bir sorun bulduk yüzey. Bu sürekli heyecanlı fluorophores uyarma ışık güç foto-bölünme önlemek için m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack			Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ tape
Sulfuric acid	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, 95% Purity
Hydrogen peroxide	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35% in water
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine	Sigma-Aldrich	104884
Glacial Acetic Acid	Duksan Chemicals	414	99% Purity
Methyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9% Purity
Polypropylene Container	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9% Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe Filter	Sartorius	16534----------K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99% Purity
Microscope Slides	Marienfeld-Superior	1000612	~76 mm x 26 mm x 1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support			Custom Fabrication
Double-sided Tape	3M		Transparent type
Quick-dry Epoxy	3M
Polyethylene Tubing	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe	Hamilton	81165
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma base
Microscope	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.