Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri

Özet

Adaptif gelişimi ve izolasyon teknikleri tarif hızla heksoz ve enzimin pentoz karışık şekerler undetoxified hidrolizatlarını şekerleştirilir ve 40 g / L etanol içinde birikir tüketmek mümkün Scheffersomyces stipitis suşunun türevleri NRRL-Y-7124 elde etmek üzere gösterilmektedir.

Özet

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Giriş

Lignoselülozik biyokütle tahmini yıllık 1,3 milyar kuru ton etanol üretimini desteklemek ve ABD% 30, petrol tüketimini azaltmak için izin verebilir. ¹ glikoz ve ksiloz zengin bitki biyokütle hidroliz verimleri şeker karışımları, fermantasyon inhibitörleri gerekli kimyasal ön tarafından oluşturulan rağmen hemiselüloz yıkmak ve enzimatik saldırı için selülozu ortaya çıkarmak. Asetik asit, furfural ve (HMF) hidroksimetilfurfural ön-muamelesi sırasında oluşturan birçok önleyicileri arasında temel bileşenleri olduğu düşünülmektedir. İleri lignoselülozik etanol endüstriyi için, araştırma ve prosedürler hayatta kalan ve etkili bir şekilde gerekli olan bu tür önleyici bileşikler varlığında heksoz ve pentoz şekerleri her ikisini de kullanmak fonksiyon görme yeteneğine sahip maya suşları evrimini izin vermek. Saccharomyces cerevisiae gibi geleneksel sanayi maya suşları, önemli bir ilave zayıf verimli fermen yetersizlikBitki biyokütle hidrolizatları kullanılabilir ksiloz t.

Pichia stipitis tip suşu NRRL Y-7124 (5773 CBS), son zamanlarda yeniden Scheffersomyces stipitis iyi etanol ksiloz fermente bilinen bir yerli pentoz fermantasyon mayası olduğunu. ^2,3 burada izlenmiştir NRRL Y-7124 evrimi bu belgelenmiş oldu çünkü küçük ksilitol yan ürün ile birlikte, 40 g / l'den fazla ekonomik olarak etanol birikmesine ana maya kökü büyük bir potansiyele sahiptir. ^4,5,6 uygun ortam, S. olarak stipitis NRRL-Y-7124 0.41 ± 0.06 g / g yüksek hücre yoğunluklu kültürleri (6 g / L hücreleri). ^7,8 direnç bir verimle 40 saat (1.75 g / L / saat) 'de 70 g / L etanol üretir fermantasyon inhibitörleri, etanol, furfural ve HMF de ⁹ ve S. bildirilmiştir stipitis ticari ölçekli etanol Bluz mevcut en umut verici yerli pentoz fermente mayalar arasında yer olmuşturn lignoselüloz gelen. ¹⁰ Amacımız endüstriyel uygulamalar için uygun NRRL Y-7124 daha sağlam bir türevi doğru evrimi zorlamak için çeşitli undetoxified lignoselülozik hydrolyzates ve etanol seçilim baskıları uygulamak oldu. aranan geliştirilmiş özellikleri arasında anahtar konsantre hidrolizatları daha hızlı şeker alım hızları, daha etkin bir karışık şeker kullanımı için daha az diauxy ve etanol ve önleyicilerinin yüksek toleransları edildi. S. uygulanması undetoxified hidrolizatları için stipitis gibi overliming olarak hidrolizat detoksifikasyon süreçleri ile ilişkili ilave işletme giderini ortadan kaldırmak için araştırma önemli bir odak noktası oldu.

İki endüstriyel umut verici hidrolizatları evrimi zorlamak için uygulanmıştır. (PSGHL) şekerleştirilmiş amonyak fiber genişletme ön tedavi mısır koçanı hidrolisat (AFEX CSH) enzim ve asit-ön tedavi darı hidrolizat içki sulandırmak ^11,12 AFEX ön teknolojisi geliştiriliyorseyreltilmiş asit ön en yaygın güncel en düşük maliyet teknolojiyi temsil eden enzimatik sakarifikasyon için selülozik biyokütle maruz uygulanan ederken, fermantasyon inhibitörlerinin üretimini en aza indirmek. PSGHL ön sonrası kalan selüloz ayrılabilir ve glikoz karakteristik hidrolize hemiselüloz gelen ksiloz zengin, ama düşüktür. AFEX CSH ve PSGHL kompozisyonlar evrim sürecini yönetmek için istismar edildi kilit yönlerini birbirinden farklıdır. AFEX CSH PSGHL (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında, amino asitler ve amonyum azot kaynakları furan aldehit ve asetik asit inhibitörleri düşük ancak daha yüksektir. PSGHL baskın şeker mevcut olan ksiloz ek bir meydan okuma sunuyor. Böylece PSGHL özellikle hidrolizatları geliştirilmiş ksiloz kullanımı için mevcut maya ticari kullanımını engelleyen bir zayıflık zenginleştirmek için uygundur. Hatta yerli pentoz fermantasyon mayaları arasında optimal şeker Xylo dayanmakse hücre büyümesini desteklemek ve onarım daha da zorlu nedenlerden dolayı çeşitli hidrolizatları kazanmaktadır. sebebiyle redoks dengesizlikler metabolizmaya yapısal bütünlüğünü ve bozulma hücre yaygın hasara neden besin eksiklikleri, inhibitörleri ⁹ Azot takviyesi, özellikle şeklinde amino asitler, fermantasyonlar için önemli bir işletme maliyetini temsil edebilir. izole tarama ve sıralama azot takviyesi etkisi darı hidrolizatları ile araştırılmıştır.

Geliştirilmiş bireyler S. doğal genetik çeşitliliği dayanan çoklu seçim baskıları kullanarak gelişmekte popülasyonda zenginleştirildi İki farklı hidrolizatları, etanol veya UV ışınlarına maruz kalma tarafından uyarılan stipitis nüfus ve mutasyonlar. Seçim basınçları S. evrimi ilerlemesini keşfetmek için paralel ve seri olarak uygulanmıştır büyümek ve hidrolizatları verimli fermente edebilir istenen türevleri doğru stipitis(Şekil 1). giderek daha zor hidrolizatları fonksiyonel popülasyonlarının tekrar kültür ya da% 12 glukan AFEX csh'ın bir seyreltme serisi kullanılarak ya da başka bir PGSHL% 20 katı yüklemede hazırlanan mikro-plakalar içinde gerçekleştirilmiştir. Sürekli kültüründe ksiloz üzerinde etanol-meydan büyüme uygulama daha ksiloz kullanımı baskıyı etanol daha az etkileniyor gösteren fenotipleri için zenginleştirerek AFEX CSH adapte popülasyonları düzeldi. İkinci özellik son zamanlarda glikoz fermantasyonu aşağıdaki NRRL Y-7124 ile pentoz kullanımına sorunlu gösterilmiştir. PSGHL ⁸ Zenginleştirme sonraki hidrolizat işlevselliği genişletmek için araştırılmıştır.

S. varsayılan gelişmiş türevleri stipitis NRRL Y-7124 en yaygın nüfus gelen koloniler almak için stres koşulları ve seyreltme kaplama kapsamında hedeflenen zenginleştirme kullanarak evrim sürecinin her aşamasında izole edilmiştir. boyutsuz akrabaperformans endeksleri (RPIs) kinetik davranış uygulanan farklı hidrolizat türleri ve besin takviyeleri değerlendirildi genel performansa dayalı suşları sıralamak için kullanıldı. Çeşitli adaptasyon prosedürlerinin başarıları S. işlevselliğini artırmak için olsa lignoselülozik hidrolizatları bölgesindeki stipitis önce undetoxified hidrolizatları, ekonomik etanol üretimi gösteren suşlar, daha önce rapor edilmemiş, belgelenmiştir. ^13-17 evrimi prosedürler kullanılarak burada daha ayrıntılı olarak görüntülenmiştir için Slininger ve ark., ¹⁸ belirgin olarak üzerinde geliştirilmiş olup soyları geliştirilmiştir üst NRRL-Y-7124 ve AFEX CSH> 40 g / L etanol üretmek ve uygun nitrojen kaynakları ile takviye edilmiş şekerleştirilmiş switchgrass hidrolizatı (SGH) enzim edebiliyoruz. Bu yeni suşlar etanol endüstrisine gelişmekte olan lignoselüloz gelecekteki ilgi ve ek genomik çalışmalar binanın konular gibidirDaha önce sıralı NRRL Y-11545 olanlar üzerinde. ¹⁹ suş geliştirme araştırmaları ilerletmek için bir başlangıcı olarak gelişimi sırasında meydana gelen genetik değişikliklerin geçmişini aydınlatmak istiyorum Şekil 1'de diagramed evrimin çeşitli aşamalarında üretilen üst soyların bir genomik çalışması.

Protokol

1. Tahliller için Malzemeler ve Ekipmanları Başlangıç ​​hazırlayın

1. evrim, izolasyon kullanımı ve sıralama işlemleri için ön reaksiyonunda 18 ila% 20 ilk biyokütle kuru ağırlık kullanılarak hydrolyzates hazırlayın. Slininger ve ark. Detaylı yöntemleri için 2015 ¹⁸ evrim, izolasyon veya sıralamasında kullanılan azot takviyesi N1 veya N2 ile AFEX CSH, PSGHL ve SGH hazırlamak bakın. Her hidrolizat Çeşidi kompozisyon için Tablo 1'e bakınız.
   NOT: üre, vitamin serbest amino dahil azot kaynakları ile: azot oranı (N C) 1 molar karbon: SGH-N1 = SGH 42 güçlendirilmiş aşağıdaki gibidir: SGH Azot tahkimatı tanımlanan SGH-N1 veya SGH-N2 olarak tayin edildi tanımlanmış kaynaklardan kazein, D, L-triptofan, L-sistein ve vitaminlerden asitler (örneğin ~ mol azot N% 15 primer amino azotu (PAN) olduğu = N% 85 üre olduğu); 1: C: SGH-N2 = SGH 37 zenginleştirilmiş N üre ve düşük maliyetli ticari kaynak o kadar soya unu ileF'nin, amino asitler ve vitaminler, ~ karterinden N% 12 ve üre gibi% 88 sağlar.
2. Yönetmen olarak ana suşunun liyofilize kültür Edinme, Scheffersomyces stipitis NRRL ARS Kültür Koleksiyonu Y-7124 (5773 CBS) (Tarımsal Kullanımı Araştırmalar Ulusal Merkezi, Peoria) ve gliserol stok kültürleri hazırlamak. Hazır üst maya kültürleri ve -80 ° C'de% 10 gliserol içinde türevlerini koruyun.
   1. agar plakaları maya malt Pepton Dekstroz (YM) için Şerit gliserol stokları (3 g / L maya ekstresi, 3 g / L malt ekstresi, 5 g / L pepton, 10 g / L dekstroz, 20 g / L ağar) ve inkübe 48- 25 ° C. ⁸ gelişmiş plakaları 72 saat 4 ° C'de bir hafta kadar saklanabilir sıvı ön-kültür inokulum ile ıslatılmıştır.
3. Hazırlayın Optimal, Orta (ODM) daha önce ana str etanol ile ksiloz optimal dönüşüm için geliştirilen endüstriyel formülasyon prosedürleri ²⁰ ile uyumlu sentetik ortam Tanımlıain Scheffersomyces (Pichia) NRRL Y-7124. ⁷ kullanın fermantasyon performans biyoanalizlere için tüm takip eden ön kültür ve kültürler tanımlanan orta ve ayrıca etanol için meydan, ksiloz beslenen sürekli kültür evrimi stipitis. ODM kompozisyon Tablo 2'de başvuru için listelenir.
4. Daha önce tarif edildiği gibi, ^18, 620 nm (A ₆₂₀₎ kültür içine çekmeyi ölçmek üzere, uygun bir şekilde, cuvette- ya da mikro-plaka okuma spektrometresi kullanılarak hücre biyokütle analiz eder. şekerler, etanol, furfural, hidroksimetilfurfural (HMF) ve daha yüksek verim için, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ya da glikoz robotik enzimatik belirlenmesi ve ksiloz kullanılarak kültür örnekleri asetik asit nicelleştirmektedir.

2. AFEX CSH Seri Transferi sırasında Sağlam Türev zenginleştirin

1. NRRL Y-7124 bir ön kültüre aşılamak. 75 mi ODM + 150 g / L ksiloz YM agar transfer hücreleri o altında büyüme yeteneğini korumaksmotic stres. Silikon sünger ile kapatılmış 125 mi ön kültür şişelerinde (150 rpm, 1 "yörünge) çalkalanarak 25 ° C'de 24 saat fişler inkübe edin.
2. kullanım için soğuk suda 6-12% glukan AFEX csh'ın çözülme dondurulmuş alikotları. Gerekirse 5 pH ayarlamak ve filtre bir seyreltme serisi hazırlamak 96-çukurlu mikropleytin önce sterilize edin.
3. (620 nm) ₆₂₀ ≥0.1 ilk emicilik sağlamak için oyuk başına önkültürü birkaç mikrolitre inoküle daha sonra, göz başına 50 | il ve hidrolizat seyreltme başına 8 kuyucuklu mikro doldurun. nem ıslak kağıt havlu ile bir plastik kutu içinde 25 ° C'de statik 24-48 saat inkübe edin.
4. İlk A ₆₂₀ ≥0.1 ulaşmak için gözle görülür bir yeni hidrolizat seyreltme serisinin her bir kuyunun A _620> 1 transfer 1-5 ul büyüdü en yoğun hidrolizat seyreltme kullanma.
5. Spektrofotometre ile büyüme kültürü mikropleytin içinde ₆₂₀ izleyin. Aşılanmamış seyreltme serisi serBir kontrol ve boş olarak ves. Plaka kapakları bulaşmasını önlemek için izleme sırasında sol ve okumalar buna göre ayarlanır.
6. Düzenli olarak geliştirilmiş suş daha sonra izole edilmesi için veya sürekli hidrolizat seyreltme serisi reinoculating kullanılmak üzere uyarlanması kültürleri gliserol stokları hazırlayın. Havuz, kolonize büyük hidrolizat konsantrasyonunun dört kuyu (200 ul) stokları hazırlamak için. -80 ° C'de% 10 gliserol içinde hücreler dondurma, cryovials içinde% 20 steril gliserol ile 1: 1 karışım.
7. % 12 glukan AFEX CSH büyüme 24 saat sonra sürekli görünür oluncaya kadar tekrarlayın 2.3-2.6 adımları tekrarlayın.

AFEX CSH üzerinde Zenginleştirme sonra 3. İzole Tek Hücre Toleranslı Türevleri

1. YM agar uyarlama kültürleri ve kullanımı çizgiler Şerit seçilen gliserol stokları, üç mikro levha boşluklarda (A ₆₂₀ ± 0.1 başlangıç) her biri% 3 veya% 6 AFEX CSH glukan (pH 5) 50 ul aşılamak için. Adım 2.3 gibi 24 saat mikropleytin kuluçkaya yatmaktadır. havuz çoğaltmate güçlü büyüme ve seyreltme plaka ym veya% 6 glukan AFEX CSH agar ile en yüksek hidrolizat güçte kuyu kolonize. Filtrenin 1 karışımı sıcak bir otoklava, 30 g / L ağar çözeltisi ile% 12 glukan AFEX CSH sterilize: 1 olarak ikinci hazırlayın.
2. gliserol stok kültürleri olarak dondurmak için 25 ° C'de 24-48 saat inkübasyondan sonra en yüksek seyreltme plaka gösteren büyümeden 5 tek koloniler seçin. Streak bir YM plakasına her koloni. 24 saat inkübe edilir. steril bir çerçevenin bulunduğu,% 10 gliserol, küçük bir hacme kadar hücrelerin gelişmiş bir çizgi transferi hücrelerin süspansiyonu karışımı, -80 ° C'de dondurma 2-3 cryovials dağıtın.

4. Ana karşılaştırıldığında AFEX CSH Toleranslı Türevler Performans değerlendirin

1. Testi Basit% 6 Glukan AFEX CSH Toplu Kültürleri İzolatlarının.
   1. 48 saat levha transfer edilen hücreler, ₆₂₀ = 10. Kullanım ile 1 ul hücre süspansiyonları hazırlamak için, pH 7, potasyum fosfat tamponu (0.4 mM), gliserol stoklarından çizgiliHer bir süspansiyon, bir ₆₂₀ = 0.2 başlangıç 50 ul% 3 glukan hidrolizatı dört gözeneğe her inoküle etmek için. Adım 2.3 gibi 24 saat mikropleytin kuluçkaya yatmaktadır. Steril su ile 3:% 12 glukan AFEX CSH 1 seyreltilerek pH 5% 3 glukan AFEX CSH hazırlayın.
   2. Aktarım, iki 24 saat mikro levha boşluklarda tüm gücünün% 50 kullanılan pH 5 ila 12% glukan AFEX csh'ın 25 mi ön kültür aşılamak için. . *, 25 ° C'de, 150 rpm (1 "yörünge) 24 saat süre ile, silikon sünger kapaklı 50 ml'lik şişelere ön kültür inkübe hidrolizatı 1 seyreltilerek glukan AFEX CSH yarım kuvvette% 12 hazırlayın: steril su ile 1.
   3. A ₆₂₀ = 0.1 başlangıç benzer 25 ml büyüme kültürleri aşılamak için yarım gücü hidrolizatı takip eden ön kültür kullanın. (4.1.2) yukarıdaki gibi büyüme kültürleri inkübe ve günlük (0.2 ml) örnek. Monitör biyokütle birikimleri (A ₆₂₀₎ ve şeker ve fermantasyon ürünleri (HPLC) konsantrasyonları.
2. Seçenek olarak ise, repitch (yani, hasat ve reuse)% 8 glukan hidrolizat parti kültürü içinde testi için% 6 glukan AFEX CSH yetiştirilen maya popülasyonları, daha önce tarif edildiği gibi. ¹⁸
3. Seçenek olarak ise, daha önce tarif edildiği gibi,% 12 glukan hidrolizatı ile beslenerek repitched% 6 glukan AFEX CSH kültürlerinin diğer test popülasyonu. ¹⁸
4. Karışık şeker ile ODM toplu kültürlerinde izolatların diauxic gecikme test edin.
   1. YM gliserol çizgiler döngü transferi silikon sünger kapaklı 125 ml'lik şişelerde 150 g / L ksiloz ile 75 ml ODM takip eden ön kültür aşılamak. Adım 2.1 gibi 24 saat bekletin.
   2. ODM, pH 6.5 75 g / L glukoz, 75 g / L ksiloz içeren içindeki 75 ml test kültürleri aşılamakta ön kültür kullanın. 25 ° C, 150 rpm'de çalkalama. Günlük Örnek.
   3. başlangıç ​​pH'ı pH 6-7 du korumak için test kültürleri 6.0 ± 0.2 olarak ayarlanmıştır hariç Alternatif olarak, benzer bir protokol kullanılarak glukoz ve ksiloz fermantasyon sırasında diauxy ilgili 0-15 g / L asetik asit etkisini testDaha önce tarif edildiği gibi, asetik asit tüketimi halka. ¹⁸

5. Etanol-meydan Xyloz Kullanımı için seçin Sürekli Kültür uygula

1. pH 6.3 ± 0.2 olarak 60-100 g / L ksiloz, 20-50 g / L etanol ile sürekli kültür besleme ortamı olarak ODM hazırlayın. ~ 0.5 g etanol / g ksiloz potansiyel verim varsayılarak 150 g / L ksiloz kısmi fermantasyon simüle etmek için ksiloz ve etanol kombinasyonu seçin ve 50-70 g / L ortaya etanol potansiyelini barındırmak için. ⁸
2. Sürekli kültür inokulum hazırlamak için, etanol içermeyen ODM (100 g / L ksiloz 75 ml 48 saatlik bir YM plaka AFEX CSH dayanıklı koloni (koloni 5'e benzer bir örnekte, Şekil 1) halka ile bir temsilci transfer 125 ml'lik şişelere bu durumda) 'de. 24 saat 25 ° C'de, 150 rpm (1 "yörünge) inkübe. İlk sürekli kültür tutan hacmi uyacak şekilde ön kültür ODM ksiloz konsantrasyonu seçin.
3. PH ODM sürekli bir kültür tutma hacmi inoküle 6.3 ± 0.2 olan 100 g / L ksiloz + 20 g / L etanol • koloni 5, Şekil 1 'bir AFEX CSH dayanıklı izolatının bir ön kültür konsantrenin 5-10 ml (analog ) ilk A ₆₂₀ ~ 0.5 100 ml elde etmek. Kılıflı bir 100 mi dönen şişeden 200 rpm'de karıştırıldı ve steril pH elektrodu, pH kontrol aracı, sıcaklık kontrollü bir dolaşan su banyosu ile donatılmış 25 ° C 'de kültür tutma hacmi (V _K), muhafaza edin.
4. hücre büyümesi nedeniyle etanol maruz kalma yavaş olacağından, başlangıçta, pH çalıştırılan pompa kullanılarak doz besleme ortamı kurmak. Kültür fermentasyon böylece daha fazla pH düşüşü durdurma 5.4 pH düştüğünde 100 g / L ksiloz ve 50 g / L etanol ile pH 6.3 ODM beslemek için bir pompa ayarlayın. Bir çıkış pompa sürekli kültür yüzeyi kaymağını 100 ml hacmi korumak. Sonuç olarak, etanol konsantrasyonu sürekli metabolizma ve beslenme ile yükselir.
5. Çıkış maddesi ölçülür ve daha önce tarif edildiği gibi, viyabl hücre konsantrasyonu, ürün ve substratların analizi için sürekli kültürleri her 48-72 saat örnekleri (1-2 mi) çeker. ¹⁸ viyabl hücre konsantrasyonu bulmak için, numunelerin seri 1:10 seyreltiler tamponu (4.1.1) ve yayılma plaka YM agar dilüsyonlar (1.2.1 bakınız). Atık toplama oranları (Q) dayanarak, S. örneğinde, sulandırma oranı (D) (Q / V _R) hesaplamak ve stipitis 0'dan 0.01 saat kadar değişiyordu ^-1.
6. zenginleştirme o zaman en yaygın sağlam kolonicileri temsil 30-100 koloni oluşturan tamponlu numune dilüsyonları canlılığı plakaları izole ederek düzenli olarak gliserol stokları kaydedin. % 10 gliserol ~ 5 ml Sel plakaları çift cryovials hazırlanmasını sağlamak için. bakım veya bir mühlet için, sürekli kültür durdurmak ve en güncel (dirençli) gliserol stoku (ler) kullanılarak gerektiği gibi yeniden başlatın.
7. , Çoğu çizgi gliserol stoku (ler) yeniden başlatmak içinYM agar dirençli popülasyonları ve yukarıdaki gibi inkübe etanol içermeyen ODM ön kültüre halka ile 24-48 saat hücreleri transferi. Önceden kültürlenmiş maya konsantresi kullanan ₆₂₀ 0.5 başlangıç ODM hacmini tutan 100 ml aşılamak ve yem orta akışı yeniden başlatılmadan önce kültür yığın halinde durağan faza büyümeye olanak sağlar.
8. Kültürler> 25 g / L etanol varlığında, ksiloz üzerinde sürekli> 0.01 st ^-1 büyümesi durumunda, düşük de (30-50 g / L arasında değişen ODM + 60 g / L ksiloz + etanol) sürekli bir kültür besleme başlatmak seyrelme oranı ~ 0.01 sa ^-1 hacmi (ilk ODM + 60 g / l ksiloz + 20 g / L etanol) sahip 100 ml. Zamanla, 50 g / L doğru yemlerde etanol yükseltmek. gliserol stoklarında ileri popülasyonları yakalayın.
   NOT: Düşük seyreltme oranını korumak oksijen kullanılabilirliğini ve destek fermantasyon azaltmak için yeterince yüksek bir hücre konsantrasyonu oluşumunu sağlar.
9. İsteğe bağlı olarak, irradiat ultra mor (UV) uygulanıriyon aylık sürekli kültürleri reinoculate için kullanılan stok popülasyonları gliserol.
   1. 60 g / L ksiloz ve tek steril bir şişede tüm stokları havuz ile (takip eden ön kültür olduğu gibi) ODM 10 ml gliserol stok damlaciklarini süspanse koloniler. Sadece 6 ml / plaka 4-5 Petri plakaları taban kapağı ~ 5 x 10 ⁸ canlı hücre / ml'de Toplanmış hücre süspansiyonu uygulanır. Standart tek kullanımlık petri tabağında 6 ml kapsama almak yüzey gerilimini aşmak için 15 ml dağıtmak ve sonra 9 ml kaldırmak için.
   2. Bir biyolojik güvenlik kabini ışık kaynağından UV her açık bir kültür pozlandırınız. İstenilen öldürme oranı>% 90 elde etmek için UV ışınlarına maruz kalma süresi ya da mesafeyi ayarlayın. Burada kaynak yaklaşık 56 cm, 45 dakika boyunca maruz kalmaktadır.
   3. radyasyondan önce ve sonra plaka hücre seyreltilmiş süspansiyonlar hazırlanmıştır. Tahmin öldürmek oranı koloni oluşturan birim dayalı. S. örnek stipitis, öldürmek oranı ~% 97 idi.
   4. Bir folyo-cov UV maruz kalan kültürleri (24-30 ml) aktarın50 ml şişe ola- rak ve canlı hücrelerin küçük bir yüzdesi yaklaşık 1 x 10 ⁸ canlı S. yeniden doldurmak için izin vermek için 25 ° C ve 24 saat boyunca 150 rpm'de inkübe hücre / ml stipitis. kültürler kuluçkaya ise fotoğraf reaktivasyonlar önleyerek, folyo kapak mutasyonlar korur.
   5. Yaklaşık 1 x 10 ⁷ canlı hücre / ml olacak şekilde sürekli kültürleri aşılamakta depolanmışsa mutagenize kültür kullanın. seçimi işlemlerini sürdürmek için etanol zenginleştirilmiş ODM + 60 g / L ksiloz ortamı besleme başlatın.

6. Gliserol Stok popülasyonları değerlendirin ve Etanol Varlığında Geliştirilmiş ksiloz Fermantasyon olanlar tanımlayın

1. Şerit etanol varlığında, ksiloz iyi büyüme ve fermantasyon için ekranın ilk adım olarak YM agar gliserol stok kültürleri seçilir.
2. Her gelişmiş göç hareketini 150 g / l glikoz ile ODM 75 mi ön kültür agar damlaciklarini filtrelenmiş ve 125 ml'lik şişelere 96 inkübe edilmesiönce saat test kültürleri için inokulum olarak kullanmak için. Büyük bir glikoz yetişen popülasyonları ksiloz kullanımı için enzimlerin indüksiyonu gerektirecektir.
   1. 60 g / L ksiloz + 30-45 g / L etanol ODM 40 A ₆₂₀ başlangıç ve 25 ° C'de inkübe, 30 ml hücreleri askıya her kültür hasat, indüksiyon test etmek için, 150 rpm (1 "yörünge) silikon sünger kapaklar ile 50 ml'lik şişelerde. HPLC analizi ile ksiloz alımını izlemek için günde iki kez numune çizin.
3. Slininger de tarif edildiği gibi alternatif olarak, ve diğ., ^18, etanol mevcudiyetinde ksiloz üzerinde büyüme değerlendirmek 125 ml'lik şişelere 150 g / L ksiloz ODM, 75 ml döngü transferi her gelişmiş nüfus eden ön kültür hazırlanması ve 96 kuluçkalanması 25 ° C, 150 rpm (1 "yörünge) İK. 125 ml'lik şişelere ODM + 60 g / l ksiloz + 30-45 g / L etanol içinde 25 ml 0.1, düşük bir ilk a ₆₂₀ test kültürleri inoküle. inkübe 25 ° C'de şişeler, 300 rpm, 1 "yörünge ve örnek.

7. Etanol mevcut olduğunda PSGHL içinde ksiloz yararlanın Tek hücreli Koloni yalıtmak

1. Aşama 6 sonuçlarına göre, büyümeye ve etanol varlığında, ksilozu fermente üstün kabiliyetini gösteren gliserol hazır popülasyonları seçin. çizgi plakaları için bunları kullanın. Çizgi Plakalar daha sonra hücre süspansiyonları, bir ₆₂₀ = 0.5, 96-derin yuvalı plakalar içinde takip eden ön kültür aşılamak için kullanılır A ₆₂₀ = 5. yoğun, tamponlu hücre süspansiyonları hazırlamak için kullanılır. ODM + 50 g / L ksiloz (Resim etanol) 1: PSGHL 1 mi ön kültür: 1 karışık inoküle. Boş kuyulardan 96-de, Bacalı, düşük buharlaşma ile derin kuyu plakaları 25 ° C'de 48 saat, 400 rpm, 1 "yörünge için kapsar. Ayrı ayrı gliserol stok toplumlarda takip eden ön kültür inkübe edin.
2. 1 PSGHL: 20 ODM + 50 g / L ksiloz, 30, ya da toleranslı kolonicileri ettirecek 40 g / L etanol, her ön kültüre kullanarak, on altı 1 mi kültürler ₆₂₀ ± 0.5 1 başlangıç çoğaltma inoküle. zenginleştirme Cultu inkübetakip eden ön kültür benzer res.
3. her biri farklı gliserol stokunun için, en yüksek etanol konsantrasyonu büyüme ve ksiloz kullanılmasına izin kültür kuyuları hasat. gliserol korumak için yaygın tek koloniler elde etmek için YM agar her hücre hattını Plate. gliserol stok hazırlanması için YM agar plaka hücre hattı ve çizgi her başına on koloniler seçin.

8. Ek AFEX CSH için olduğu gibi, PSGHL Seri Transferi sırasında Sağlam Evolved düzensizliğin zenginleştirin

1. NRRL Y-7124 (üst) ön kültürler hazırlayın AFEX CSH dayanıklı izole gelişti ve sürekli kültür etanol varlığında, ksiloz kullanma özelliği ile olan bu nüfus gelişti. AFEX CSH hidrolizat adaptasyon işlemi için (adım 2.1) yukarıda tarif edildiği gibi gliserol hazır damlaciklarini halka ile ODM + 150 g / L ksiloz 75 mi inoküle.
2. artan konsantrasyonlarının bir dizi sağlamak üzere, su ile PSGHL seyreltilir. Her kullanarak üç hücre çizgilerinin her biri için, 96-çukurlu mikro levha hazırlanmasıPSGHL seyreltme 50 ul 8 kuyu doldurun. Bir ₆₂₀ ~ 0.1-0.5 başlangıç seyreltme serisi, her 50 ul mikro-kültür aşılamak için ön kültüre kullanın.
   1. Kültürler Δtime başına ΔA ₆₂₀ istikrarlı bir 14-d ortalama oran tam mukavemet hidrolizatta büyümek mümkün kadar yukarıdaki (adım 2) detaylı AFEX CSH hidrolizat adaptasyon aynı prosedürü kullanarak PSGHL güçlü artan maya gelişimini devam ediyor gibi seri transferleri ek dört ay devam edilir.

veya Etanol Mücadelesi olmadan PSGHL Degradeleri kullanma 9. İzole Tek hücreli Kolonileri

1. tek hücreli YM agar seyreltme kaplama tam mukavemet PSGHL son adaptasyon plakaları doğrudan izolatlarının edinin. Daha önce (adım 3.2) açıklandığı gibi gliserol stokları hazırlamak için YM plakalarına üç hücre hatları ve bar çizgi her biri için on büyük koloniler seçin.
2. İsteğe bağlı olarak, daha önce zaman noktaları keşfetmekÜç hücre çizgilerinin depolanan gliserol stoklarından izole ederek evrim süreci.
   1. gliserol hazır çizgiler döngünün her hücre hattı için bir ön kültüre inoküle ve 30 ml ODM + 50 g / L ksiloz 24 saat (50 mi şişeler, 25 ° C, 150 rpm) inkübe edilir.
   2. Ilk A ₆₂₀ ~ 0.2 mikroplaka kuyuların% 50 PSGHL 50 ul aşılanması ve statik 48 saat inkübe edilerek hidrolizatta büyümeye takip eden ön kültür gelen meydan hücreleri.
   3. (Teslim ~ plaka başına 300-400 canlı hücreler) 0-50% gücü hidrolizatı değişen PSGHL degrade agar plakaları üzerine her zenginleştirilmiş kültür 0.1 ml yayılmış ve degrade mümkün olan en yüksek hidrolizat konsantrasyon alanından hücre hattı başına 10 tek koloniler almak . ²¹ Streak adım 3.2 olarak gliserol stok hazırlama YM için koloniler aldı.
   4. Bunun yerine gradyan agar inoküle bölgesinin 9.2.3 adım için bir alternatif olarak, bir ₆₂₀ ~ 0.2 başlangıç 96-çukurlu mikro levha kuyuları inoküle, whekuyu 10, 40 g / L% 50 kuvvetinde ve etanol ile 100 arasında hidrolizat konsantrasyon aralığı muhafaza etmek üzere tasarlanmış olan yeniden. Bu durumda, adım 2.3 gibi aksi mikro-plakaları 72-96 saat geliştirmek ve. seyreltme kaplama yoluyla büyüme gösteren sert hidrolizat-etanol kombinasyonları kuyulardan on tek koloniler izole ve adım 3.2 olarak gliserol stokları hazırlamak.

Birincil Ekran 10. İki Besin Koşullarında PSGHL üzerinde Performanslar karşılaştırılması ve Sıralama İnferior izolatı eleyin

1. Kontroller altı top suşları seçmek için otuz ekranına PSGHL performansı yüksek verim derin kuyu plaka ekranı uygulayın beş set NRRL Y-7124 ebeveyn ve (Şekil 1 evrim örneği Colony 5 benzer) AFEX CSH dayanıklı izolatı ile birlikte izole eder her setten (% 20) ikincil Gözlemleme seviyesi (aşama 12) geçmek için.
2. oyuk başına 1 ml doldurulmuş ve wi kaplı derin kuyu plakaları ekranı yürütmeksiyah silikon düşük buharlaşma mühürler ile inci paslanmaz çelik kapaklar. inkübatör / çalkalayıcı kuruluna tüm plakaları Kelepçe ve 25 ° C ve 400 rpm (1 "sallama yörüngesi) çalışır. Tasarım tüm derin kuyu açık kuyulardan farklı izolatlarının ayrılmasını sağlamak için desen dolgu plaka.
3. toprağı ekme başlamak için, 30 ile hazırlanan gliserol çizgiler bir hücre boncuk çekme yukarıdaki gibi izole edilen ODM + 50 g / L ksiloz kuyu çoğaltmak ve 48 saat kuluçkalanması (Adım 3, 7 ve 9 olarak).
4. ODM + 10 g / L glikoz + 50 g / L ksiloz 1: izolatları preculturing için bir meydan okuma ortamı olarak, PSGHL 1 karıştırılarak% 50 PSGHL hazırlar. 30 izolat ve iki kontrol suşları, 16 izolatın her başı 2 kuyuları ile 2 tabak taranması için farklı izolatlar arasındaki boş kuyu bırakarak doldurulur.
5. Zorluk kültürleri, transfer için, izolatlar her iki% 50 PSGHL meydan kültür kuyularının her ODM ön kültürler 50 ul hacmi (A ₆₂₀ ~ 10) ve başlatılmaktadır elde etmek için kontrolal A ₆₂₀ ~ 0.5 ve 72 saat inkübe edin.
6. tarama izolatları için farklı beslenme zenginlik iki test ortamı kullanın:% 60 PSGHL + ODM besinleri; % 75 PSGHL + ODM + YM besinler ve. ODM 50 g / L şeker (adım 1.3) ile kullanmak için standart olarak gücü yarısında (şekerler hariç) ODM besinleri ekleyin. belirlenmiş, 3 g / L maya ekstresi, 3 g / L malt ekstresi, 5 g / L pepton, standart gücü yarısı (şekerler hariç) YM besin ekleyin.
7. Iki test ortamı her biri için beş derin kuyu A ₆₂₀ ~ 0.5 başlangıç 1000 ul aşılamak için 72 saat% 50 PSGHL meydan ön kültürlerin 50 ul aktararak Test kültürleri aşılamak.
8. Her gün izole Örnek. etanol, glikoz ve yüksek verimlilik analiz ksiloz süpernatının elde etmek için bir mikrofüj tüpü ve santrifüj (5.533 x g, 15 dakika) için de içeriğini Pipet. Bir spektrofotometre ile ₆₂₀ 96-çukurlu mikro plakalara (200 ul / oyuk) biyokütle ölçün.
9. 30 Her set içindeolates (S. stipitis NRRL-Y-7124 için 5 set suşlar gelişmiştir) aşama aşağıdaki 11'de tarif edildiği gibi göreli performans indeksi (RPI) hesaplar ve etanol verimi (birlikte başlangıç şeker başına biriken fazla etanol) göre, her bir suş sıralamak için kullanımı, test edilmiş ve ksiloz alım oranı her iki test ortamına (ilk 96 saat başına tüketilen ksiloz konsantrasyonu).

11. Sıra Bağıl Performans Endeksi (RPI) kullanarak İlköğretim PSGHL Ekranında İzolatlarının

1. Primer taramada ardından, ekran, iki farklı deney başına besin formülasyonlan, örneğin,% 60 PSGHL% 75 PSGHL ile PSGHL ile izole 30 beş farklı deneylerde her izole sıralamak amacıyla boyutsuz göreli performans indis (RPI) hesaplar.
2. F = (XX _ort) / s: belirli bir deneyde test izolatlarının bir grup içinde izole performans sıralaması kullanılmak için istatistiksel parametresi F hesaplanır. Burada X performans parametresi gibi verim olarak, (Y)X, _ort ve S sırasıyla ortalama ve standart sapma ise X Tüm belirli bir deney içinde izole gözlemlenen veya kuru (R), tek tek her izolat için gözlendi. Normal dağılımlar için, -2
3. Her bir deneyde izole için 100/4 × oranına dayalı göreli performansını, RPI'nın _R = (2 + F _R) hesaplamak ve benzer verim dayalı göreli performansını hesaplamak, RPI'nın _Y = (2 + Bayan _Y) × 100/4 . RPI'nın değeri (en yüksekten en düşüğe) ~ 0'dan 100 persentil arasında değişmektedir. Her belirli bir hidrolizat deney içinde izole için aşağıdaki gibi daha sonra RPI ortalamaları hesaplamak: verim ve hız katkıları bu uygulama eşit ağırlık verilmiştir RPI _ort = (RPI _Y + RPI _R) / 2.
   önemi eşitsiz görüldüğü takdirde genel olarak unutmayın, verim ve hız parametreleri ağırlıklı olabilir.
4. _Genel test hidrolizatlarından n türleri arasında RPI hesaplayın: RPI _genel = Σ _{i = 1, n} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _i / n. Her 30 izolatın ve 2 kontrol deneysel sette izole düşünün. ~ 150 tek koloninin birincil sıralamasında sırasında ksiloz-zengin PSGHL adapte izolatları, _{genel olarak,} ekranın uygulanan iki PSGHL formülasyonları arasında oranları ve verim için hesaplanan RPI, yani% 60 PSGHL ve% 75 PSGHL, burada n = 2.
5. _Genel her deneyde RPI'nin dayanarak, ikincil ekrana geçmek için izolatların üst yüzdesini seçin. Bu örnekte, suşların En% 20 (yani, 150, 30 test edilmiştir) geçecek şekilde seçilir.

İkincil Ekran 12., yüksek İşleyişi Sağlam düzensizliğin Ortaya Çoklu Komple hidrolizatları (> 100 g / L Karışık Şekerler) Top İlköğretim Ekran Sanatçıları karşılaştırın

1. % 6 üzerinde azot, SGH-N1 ve N2 SGH-(kompozisyonun iki düzeyleri ile değiştirilmiştir glukan AFEX csh ve SGH üst PSGHL performans karşılaştırınson sıralama için Tablo 1) 'de olduğu gibi s. PSGHL birincil derin kuyu plaka ekranın üst sanatçılar vardı 30 izolatı Ekran Colony 5, Şekil 1 örnek benzer ve iki kontrol (üst NRRL Y-7124 ve AFEX CSH toleranslı izolat ((10 ve 11 adımlar) ).
2. daha önce olduğu gibi 1 mi ODM + 50 g / L ksiloz, derin kuyu çoğaltmak ve derin bir plaka sistemi (aşama 10.2) 'de 48 saat inkübe gliserol çizgiler bir hücre boncuk seçerek toprağı ekme başlayın. Daha sonra) ~ 10 ° ₆₂₀ elde etmek üzere 72 saat için derin oyuklu plaka sisteminde% 50 SGH meydan kültürlere ODM ön kültür, 50 ul transfer ve inkübe edilir. Şekersiz ODM + 50 g / L ksiloz (pH 5.6) ile 1: 1 sgh karıştırılarak% 50 SGH hazırlayın.
3. Izolatların her biri için, ilk test kültürü ~ 2.0 bir ₆₂₀ elde etmek için bir meydan okuma kültürün üç kuyu hücre topağı (15 dakika, 2711 x g) ile SGH-N1 ya SGH-N2 16 ml'lik bir şişe inoküle. 25 & # test kültürleri inkübe176;. C silikon sünger kapaklı, 25 ml şişelere, 180 rpm (1 "yörünge) günlük ve Numune şişeleri PSGHL ekran başına analiz edin.
4. Benzer bir şekilde, ekran adımları 12.2 ve 12.3 olarak izole ancak meydan kültür ortamı ve test kültür ortamı hazırlanmasında kullanılmak üzere, pH 5.2% 6 glukan AFEX CSH bu kez yerine SGH-N1 SGH-N2. yeterli nitrojen değişiklik yapmadan olduğu, su ile 1: 50% 'lik bir meydan okuma kültürler için, 1 seyreltilmiş% 6 AFEX CSH kullanın.
5. Tekrarlayın sonuçlarını çoğaltmak için 12.1-12.4 adımları.

13. Sıra _genel Çoklu Komple hidrolizatlarından Oranı Kullanımına RPI kullanma İkincil Ekran İzolatların Performans

1. izolatların en üst% 20 her rütbe için göreceli performans endeksleri (RPI) hesaplayın (~ 30 150 üzerinden) enzim ikincil ekranda test edilmiştir birincil ekrandan beslenme zenginliği değişen hidrolizatı formülasyonları şekerleştirilir.
2. skor herÜç enzim şekerleştirilir önceden muamele edilmiş hidrolizat formülasyonlar üzerinde gerçekleştirilen ksiloz alım hızı ve etanol verimi göre ikincil elekte test izolat AFEX CSH (i = 1 ve 2), SGH-N1 (i = 3 ve 4) ve SGH dahil olmak üzere, iki kopya halinde çalıştırmak -N2 (i = 5 ve 6).
3. Her izolat _{için, genel} RPI hesaplayın ve ayrıca birçok izolatların listesini ayıklamak için bu sıralama parametre geçerlidir: = Σ _{i = 1, N} [(RPI _Y + RPI _R) / _2] / n, burada n = 6 _genel RPI .
   NOT: Slininger ark prosedürleri takip ederek balonu kültürlerinde SGH-N2 hidrolizatları üstün izolatların kinetik gösterin ^18.

Sonuçlar

S. stipitis AFEX CSH, PSGHL ve etanol-meydan ksiloz beslenen sürekli kültürü dahil üç seçim kültürlerin kombinasyonları kullanılarak gelişti. Şekil 1 izolatların birlikte gerçekleştirilen evrim deneyleri şeması ya en etkin gerçekleştirmek için bulundu gösterir Genel olarak ya da en etkili test hidrolizatlarının seçebilir. Tablo 3, bu birçok izolatların NRRL erişim numaraları gösterir ve her suş izole edildiği zenginleştirilmiş popülasyonu elde...

Tartışmalar

Birkaç adım evrim sürecinin başarısı için kritik idi. Birincisi, başarılı bir uygulama için gerekli olan istenilen fenotip doğru nüfus evrimi götürmek uygun seçim baskıları seçmek için anahtardır. Aşağıdaki seçici gerilmeleri S. seçildi gelişimi stipitis ve istenen fenotipleri için zenginleştirme yol uygun zamanlarda uygulanır:% 12 (asetik asit ve furan aldehitler ve diğer inhibitörleri düşük seviyelerde mevcudiyetinde büyüme ve çeşitli şekerlerin fermentasyonu k...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com