RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Özet

Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır.

Özet

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

Giriş

Genomik biyomarker araştırma doğru ve güvenilir hastalık durumunu yansıtmak ve klinik olarak yararlı bir şekilde bunu. ¹ Biyomarker gelişme iyi açıklamalı doku örneklerinin retrospektif analizi güvenen moleküler korelasyonun tespit etmeyi amaçlamaktadır. Hastalıklı ve normal doku örnekleri olarak taze donmuş doku uzman biyobankalar ya da klinik arşivlerinde formalin-sabit parafine gömülü doku (FFPET) blok olarak ya depolanır. Taze dondurulmuş doku, yüksek kaliteli nükleik asitlerin ekstre sağlar ve yaygın olarak genomik biyomarker bulma çalışmalarında kullanılmıştır. ^2,3 Bununla birlikte, daha az doku örnekleri biyobankalar mevcuttur ve bu doku okuyan büyük örnekleri, sıradışı kategoriye doğru bir eğilimi getirmektedir banka dokuya daha fazla yetenekleri ile özel merkezlerde görülen hastalık ve hastaların. ⁴ FFPET, aksine, hastalıklı insan ve hayvan dokuları için varsayılan depolama yöntemidir. FFPET blokları hücresel m sürdürürkenorphology, sabitleme işlemi, çapraz bağlantılar nükleik asitlere diğer hücre bileşenleri olarak kullanılabilirler. Çapraz bağlı, RNA ve DNA geri kazanılabilir, fakat sadece bozulmuş, çok parçalı bir formları. ^5,6 Bununla birlikte, bu, DNA ve RNA fragmanları mRNA ekspresyonu, DNA hipermetilasyonu ve hedef sıralama dahil tahlillerin genişleyen tadını analizine uygundurlar. ^7,8 büyük miktarda ve araştırma için kullanılabilir FFPET çeşitliliği Bu fırsattan yararlanmak için, verimli ve güvenilir bir çıkarma protokolü için bir ihtiyaç vardır.

dokuda biyobelirteç araştırmaları büyük bir kısmı kanser üzerinde duruluyor. hastalıklı dokunun diğer türleri gibi, kanser, doku, genellikle hücre korunması ve hücre türü önemli bölgesel heterojen gösterir. biyobelirtecin araştırma moleküler özellikleri ile hastalıklı dokunun bileşenleri ilişkilendirmek için yeteneği bağlı olduğundan, bu sürecin önemli bir adımdır iyi d korunmuş ve zenginleştirilmiş doku kesin hasat olduğunuçalışılan hastalığı bulunanlarda. FFPET iki zenginleştirme teknikleri sıklıkla kullanılmaktadır: lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM), ve mikrotom kesit. LCM yüksek doku hasadı odaklı sağlayan ve heterojen dokularda spesifik, iyi korunmuş hücre tipleri izole etmek için kullanılabilir. ^9,10 Ancak LCM örneklerin büyük sayılar için alıcı engelleyici zaman pahalı ekipman gerektirir ve. Mikroskobik kesit ince kesitler FFPET bloklardan kesilen bir daha yaygın kullanılan bir süreçtir. ^11,12 Mikroskobik kesilmiş bölümleri genellikle hücre korunması heterojen doku içerir (örneğin, nekrotik vs iyi korunmuş) ve kompozisyon (örn, kanser genel dolayısıyla huylu parankimi) ve ayrı olarak incelenmiştir iyi moleküler özelliklerinin homojenizasyon neden olabilir. Böylece, ilgi konusu hücreler için zenginleştiren yüksek verimli bir yöntem için bir ihtiyaç vardır. Üçüncü bir yöntem, FFPET çekirdeklerinden nükleik asitlerin izolasyonu, bu zenginleşme sağlayan yüksek throug için uygundurprotokolleri hput ve ayrı doku çekirdeklerinden RNA ya da DNA izole etmek için başkaları tarafından kullanılmaya başlanmıştır. ^7,13,14

Yayınlanmış protokollere bir dizi FFPET (Tablo 1) nükleik asitlerin çıkarılma yöntemlerinin belirtir. Ancak, RNA ve DNA aynı dokudan çıkarılan protokolleri değil doku çekirdekleri için, mikrotom doku bölümleri için optimize edilmiştir. Doku özgüllük arttı teklif ^15,16 Benzer şekilde, yayınlanan protokolleri, ya doku çekirdek veya slayt microdissections yoluyla, prosedürleri belirtmek DNA ekstre ancak burada değil RNA. ^7,17, aynı doku iç hem DNA ve RNA, çift çıkarılması için optimize edilmiş bir protokol için gösterilmiştir. Doku çekirdekleri FFPET blok eşleştirilmektedir çıkar bölgelerine dokusu mikrodizisi (TMA) zımbalar sokulmasıyla hasat edilir. haritalama bir marker kalem ile bir mikroskop lamı açıklama ve ilgili FFPE yüzeyine ek açıklama aktarılması ile gerçekleştirilirT bloğu (Şekil 1).

Bu protokolün gelişmesine yol açmıştır Önceki çalışma çeşitli ticari olarak temin edilebilen nükleik asit emiş sistemleri bir mukayesesini de içerdi. Bu karşılaştırmada, ticari protokollere modifikasyonlar, aşağıda tarif edildiği gibi, en yüksek DNA ve RNA verimi ve kaliteyi (Selvarajah et al., Prep olarak) temin etmiştir. Doku çekirdekleri genellikle FFPET ekstraksiyon protokolleri ^11,12,14,18 kullanılan 5-10 um mikronluk kesitler daha kalındır ^{- 20} ve parafin daha değişken miktarlarda içerebilir. Bunu dengelemek için, Parafinden arındırma lamların ksilen ve etanol tedavileri tekrarlayarak ve motorlu homojenizasyon adımı (Şekil 1) tanıtarak tarafından geliştirilmiştir. Ayrıca, proteinaz K sindirimi süreleri DNA verimini artırmak için uzadığı tespit edildi. Genel olarak, bu protokol maliyet-etkin ve la hastalığın moleküler ve histopatolojik arasındaki bağlantıların kurulmasını sağlarrge, iyi karakterize popülasyonları. bütünüyle protokol özel ve pahalı ekipman için çok az ihtiyacı olan eller zaman 3 saat olmak üzere, 2 gün içinde güvenilir gerçekleştirilebilir.

Adım-adım protokol üreticinin protokol değiştirilmiş bir versiyonu olarak bundan olduğunu. ²¹ özel reaktifler, ekipman ve üreticileri için Malzemeleri / Ekipman Tablosuna bakınız.

Protokol

1. Doku Delme

1. mikroskop lamı gözden geçirin ve ince nokta kalıcı bir kalem kullanarak ilgi bölge (ler) özetlemektedir. mikroskop lamı üzerine ilgi bölgeyi kaplayacak kadar büyük parafin filmin bir bölümünü kesip. sıkıca slayt filmi yerleştirin ve kaymasını filmi tutmak için kenarları boyunca filmi sarın. ama dışında - - bölge (ler) ince nokta kalıcı bir kalem kullanarak, anahat dokunma tutarak, tüm doku ve doku içinde ilgi bölgesi (ler) özetlemektedir.
2. filmi çıkarın ve ilgili doku bloğuna transfer. (Şekil 1) saygısız veya tüm doku anahat bloğunda doku gözlenen şeklini eşleşecek şekilde çevirerek filmi yönlendirin. sıkıca kaymayı önlemek için blok yüzeyine film bölümüne basın.
3. kalıcı bir kalem ucunu kullanarak, bölge (ler) arasında anahat boyunca (~ 0.2 mm) sığ fakat görünür girintileri yapmakmenfaati arasında fark, daha sonra filmi çıkarın. Yük, ayrı 1.5 veya 2.0 ml mikrosantrifüj tüpleri içine ağartıcı,% 70 etanol ve 1 ml su.
4. ucu tüp içeren ağartıcı batırılan ise yukarı ve aşağı birkaç kez yumruk kaydırarak tarafından belirlenen 0.6 mm zımba gelen reseptörü (kırmızı) yumruk temizleyin. % 70 etanol ve su ile yukarıda yineleyin (yani ağartıcı sağlamak için kritik bir kaldırılır).
5. 3 mm derinliğe kadar ilgi bölge içinde, doku içine yumruk basın ve yumruk çekme. kalemle yumruk dışarı iterek 1.5 ya da 2 ml'lik tüp bağlama düşük içine çekirdek bırakın. -20 ° C (uzun süreli) veya kısa süreli kullanım için 4 ° C'de çekirdekleri saklayın.
6. 1.4 adıma ve sonraki bölgeler veya numune ile devam etmek için uygun yumruk temizleyin.

2. FFPE doku çekirdekleri Deparaffinize

1. Doku iç 1 ml ksilen ilave edilmesi ve 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın 1.5 ya da 2 ml'lik tüplerde Carryout Parafinden arındırma lamların. Hea50 ° C'de 3 dakika boyunca t.
2. Oda sıcaklığında (RT) ve 5 dakika boyunca buz üzerinde, maksimum hıza (21.130 x g) ve yeri tüp 2 dakika süreyle santrifüj (mumsu artık madde üzerine katılaşmaya sağlar).
3. Dikkatle ksilen tedavi bir pipet kullanarak süpernatant ile menisküs etrafında biriken parafin kaldırmak ve tekrar (2.1-2.2 adımlar).
4. 10 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde, etanol (% 100) ve girdap 1 ml ilave edilir. RT (maksimum hız) 2 dakika süreyle santrifüj ve dikkatli bir şekilde etanol atın. bir zamanlar yukarıdaki adımı tekrarlayın.

Deparafinize Damar 3. Homojenizasyon

1. Homojenizasyondan önce etanol (% 100), 700 | il çekirdekleri yeniden süspanse edin. Motorlu bir doku homojenleştirici kullanılarak ince bir doku parçacıklar halinde çekirdek öğütmek (~ orta ayara, 1 dakika). carry-over kontaminasyon en aza indirmek için her bir numune arasındaki homojenleştirici probu temizleyin.
   1. ~ Ağartıcı RNaz nötrleştirme çözeltisi ve% 70 10 ml etanol ile 15 ml tüpler doldurun. Örnek homo sonragenization, yukarıda belirtildiği üzere temizleme çözeltilerinin her homojenizer probu yıkayın. yıkama aşamasında en yüksek hızda homojenleştirici çalıştırın.
   2. doku ile prob silin ve sonda bir sonraki numune homojenize önce tamamen kurumasını bekleyin. Görme kalan doku parçaları için prob bıçakları inceleyin. Eğer bulunursa, tekrar probu temizleyin. Günlük temizlik çözümleri (çamaşır suyu, etanol ve RNaz nötralize çözeltisi) değiştirin.
2. Homojenizasyondan sonra, daha fazla% 100 etanol (~ 300 ul) eklenmesi ile 1 ml numune hacmi getirmek. 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj dikkatlice RNA ekstraksiyonu ile devam etmeden önce yaklaşık 15-20 dakika süreyle etanol ve hava kuru pelet aspire.

Proteinaz K ile 4. Sindirim

1. pelet gevşetmek için 150 ul Proteinaz K sindirimi Tampon pelet ve fiske tüp tekrar süspansiyon. ısıya dayanıklı proteinaz K 10 ul ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın (yok) Tüp vorteks. hafif bir sallama ile 15 dakika boyunca 56 ° C'de tüp içinde içeriği inkübe edin.
2. boru 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe izin verin. Tam soğutma takip eden aşamada etkin çökeltme için çok önemlidir. en yüksek hızda 15 dakika süreyle santrifüj.

DNA 5. Ayrı RNA

1. Dikkatle RNA saflaştırılması için yeni bir 1.5 ml, pelet bozmadan, süpernatant aktarın.
2. DNA saflaştırma için pelet (topak -20 ° C'de 1 gün öncesine kadar 2-8 ° C'de veya uzun süreler için için, oda sıcaklığında 2 saat süre ile muhafaza edilebilir) tutun.

6. RNA saflaştırma

1. 15 dakika boyunca 80 ° C'de RNA içeren süpernatant inkübe (bu kez fazla değil). Sonraki kısaca kapağın içinden damla toplamak için tüp santrifüj.
2. bağlama koşulları ayarlamak ve pipetleme karıştırın 320 ul Tampon RLT ekleyin. Daha sonra, 720 | il etanol (% 100), ve vorteks ekleyin.
3. transferi 62 ml toplama tüpüne yerleştirilmiş (kitinde) RNA döndürme kolonuna kurdu ve kalan içeriği kenara olabileceğiniz çökelti dahil numune 00 ul. ≥8,000 xg'de 15 sn santrifüj, flow-through atın ve toplama tüpü yeniden.
4. Aktarım ≥8,000 xg'de 15 sn için borunun kapak içinde birikebilen damlacıklar santrifüj içeren bir kolona numunenin geri kalan ve akış-through atın.
5. , ≥8,000 xg'de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 350 ul Tampon FRN ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden.
6. Yavaşça, 70 ul tampon RDD 10 ul DNaz I stok solüsyonu karışımı spin kolon zarına doğrudan ekleyin ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
7. ≥8,000 xg'de 15 sn için, döndürme kolonuna santrifüj 500 ul Tampon FRN ekleyin ve bir sonraki aşamada kullanım için akış-through kaydedin. Bir spin kolon yerleştirin küçük RNA'ların kurtarma geliştirmek içinYeni 2 ml'lik bir toplama tüpü ve döndürme kolonuna önceki adımda elde edilen akış oranı uygulanır.
8. ≥8,000 xg'de 15 sn santrifüj, flow-through atın ve bir sonraki adımda toplama tüpü yeniden. , ≥8,000 xg'de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 500 ul Tampon RPE ekle flow-through atın ve bir sonraki adımda toplama tüpü yeniden.
9. ≥8,000 xg'de 15 sn için spin kolon ve santrifüj 500 ul Tampon RPE ekleyin ve flow-through ile toplama tüpü atın.
10. Yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin 5 dakika boyunca maksimum hızda kapağı ve santrifüj açın. flow-through ile toplama tüpü atın.
11. Yeni bir 1.5 ml'lik spin sütunu yerleştirin doğrudan spin kolon zar üzerine RNaz içermeyen su 20 ul, ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca tüp inkübe edin. 1 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüje RNA elute edin. -80 ° C'de elüt RNA numunesi saklayın.

7. DNA saflaştırma

1. Proteinaz K tamponu 45 ul adım adım ilavesiyle RNA ekstraksiyonu sırasında elde edilen pelletini (400 mM Tris 7.5, 400 mM NaCI, 3 mM _MgCI2,% 4 SDS); 45 ul _H2O; ve yüksek gücü proteinaz K, 400 ug
2. 24 saat boyunca 56 ° C'de yukarıda belirtilen çözelti inkübe (tavsiye edilen) ya da gece boyunca karıştırılmıştır. Kısaca 2 çalkalama olmaksızın sıcak ve 90 ° C 'de Performincubation kapağın içerisinden damla toplama mikrosantrifüj tüpü santrifüjlenir.
3. Örnek, oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve daha sonra 4 ul RNaz A (100 mg / ml) ekleyin izin verin. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca örnek inkübe edin.
4. örnek 200 ul Tampon AL ekleyin ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır. Daha sonra,% 100 etanol içinde 200 ul ekle ve vorteks yoluyla iyice karıştırılır. ≥8,000 x g'de 1 dakika için sağlanan spin kolon, bir yerde bir 2 ml'lik bir toplama tüpü içinde, ve santrifüj Numunenin tamamı aktarın.
5. ile toplama tüpü atın-Akmasına ve yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin. , ≥8,000 xg'de 15 sn, spin kolona santrifüj 700 ul Tampon Aw1 ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden.
6. , ≥8,000 xg'de 15 sn, spin kolona santrifüj 700 ul Tampon Aw2 ekle flow-through atın ve toplama tüpü yeniden. Daha sonra, ≥8,000 xg'de 15 sn için spin kolon, santrifüj% 100 etanol 700 ul ve akış yoluyla sahip toplama tüpü atın.
7. Yeni bir 2 ml toplama tüpü spin kolon yerleştirin 5 dakika boyunca tam hızda spin kolon kapağını ve santrifüj açın. flow-through ile toplama tüpü atın.
8. yeni bir 1.5 ml'lik bir toplama tüpü içinde spin kolon yerleştirin ve ısıtılmış nükleaz içermeyen su (50 ° C) 25 ul ekle. 10 dakika boyunca 50 ° C'de sütun ve tüp inkübe edin. maksimum hızda 1 dakika için santrifüj, kolona nükleaz içermeyen su (RT) 25 ul ekle ve boyunca inkübeOda sıcaklığında 1 dakika.
9. maksimum hıza (21.130 x g) ve genomik DNA (toplam DNA, yaklaşık 50 ul) ihtiva eden hasat akış yoluyla 1 dakika için santrifüjleyin. -20 ° C'de sütun Mağaza (durumda başka bir elüsyon sonra gereklidir).

Sonuçlar

Bu protokol, doku çekirdekleri arasında DNA ve RNA geri kazanılması doku bölümleri için tasarlanmış ticari bir ekstraksiyon sisteminin modifikasyonlar için optimize edilmiş bir yöntemle temsil eder. Optimizasyon doku homojenizasyon giriş, DNA ekstraksiyonu için daha güçlü proteinaz K kullanımını ve doku sindirim süresi uzatma dahil. Grafikler ve istatistiksel analizler 2-yönlü ANOVA, lineer regresyon ve korelasyon dahil.

Proteinaz Sindirim Optimizasyonları
Ticari kit yüksek DNA verimi (Şekil 2A) ile sonuçlanan, daha kuvvetli bir proteinaz K ile ikame edilmiş bir oda sıcaklığı istikrarlı bir proteinaz K solüsyonu içermektedir. , DNA verimini artırmak için, sindirim, 2 den 24 saat kadar uzatıldı. Anlamlı bir fark iki zaman noktası arasında görüldü, ancak 24 saat sindirim sa daha tutarlı verim sağlamak için ortaya çıktıörnek olarak şunlar verilebilir. Ancak, daha fazla inkübasyon 48 saat daha DNA kurtarma geliştirmek vermedi (Şekil 2B; p = 0.74).

FFPE Prostat Kanseri Doku Örnekleri tipik DNA Kurtarma

Optimize edilmiş protokolü kullanarak, RNA ve DNA eş çıkarılan 3 ila 14 yaşındaki örnek yaş arasında değişen 333 prostat kanseri FFPET örneklerinden idi. Her örnekten, 3 doku çekirdekleri (± 0.13 mm ³ 0.95'lik ortalama toplam doku hacmi) girdi olarak kullanılmıştır. nükleik asitler moleküllerin boyut dağılımının değerlendirmelerini konsantrasyonlarını tahmin ve sağlayabilir diğer mikroakışkan bazlı jel-elektroforez yöntemleri bulunmakla birlikte, bu tür yöntemleri tekrarlanabilir nükleik asitler kantifikasyonunu vermeyin gibi flourometrically bazlı deneyler yapmak RNA ve DNA arasındaki farkı ayırt edemez. ²² Ve mikroakışkan bazlı jel-elektroforez sonuçları parçalanmış için güvenilir değildir, çünküFFPET türetilen nükleik asitler, ²³ nükleik asit verimi (detaylar için reaktif listesine bakınız) florometrik ölçüldü. Ortalama verim RNA 2.270 ng DNA (Şekil 3A) 820 ng. Bu çalışmada incelenen tüm FFPET örneklerinin yaklaşık% 90 DNA ≥100 ng RNA'nın ≥ 500 ng elde edildi. İlginçtir, FFPET numune ve nükleik asit kurtarma (Şekil 3B) yaş arasında anlamlı bir ilişki saptanmadı. (R ² = 0.39; p <0.0001) Genel olarak, RNA ve DNA verimi örnekleri arasında korelasyon DNA'dan daha fazlası gibi iki kat daha fazla bir RNA her bir örnek (Şekil 3C) geri kazanıldı, ancak.

Pilot ve optimizasyon çalışmaları prostat dokuları üzerinde yapılan gibi, bir sonraki adım arşiv doku birkaç ek türleri bu protokolün performansını araştırmaktır. ile başlayan ameliyatla çıkarıldı ve otopsi FFPET örnekleri olmak temsilBu enfeksiyonlar iyi karaciğer (1 örnek vaka 1), beyin (1 kasasından 8 örnek), mesane (2 vakada 2 örnek), ve meme (3 olgudan 3 örnek) kanserleri, protokol DNA> 100 ng vermiştir ve RNA% 90 numune (Şekil 3D). nükleik asit verimleri cerrahi dokularda daha otopsi dokularda düşük iken, temsilcisi sonuçları protokol farklı sitelerden kaynaklı kanserler arasında benzer verim ürettiğini göstermektedir.

RNA değerlendirilmesi ve DNA bütünlüğü ve Mansap Analizi onların Temsilcisi Performans

47 8 seçilen FFPET prostat kanseri örneklerinde genler ve (bir pozitif kontrol olarak) taze PC-3 prostat kanseri hücre dizisi örneğin RNA ekspresyon analizi FFPET için optimize edilmiş ticari birden fazla analit gen ekspresyon platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. PC3'de mRNA sayımları FFPET sa dan daha tipik yüksektiörnek olarak şunlar verilebilir (Şekil 4A). Bununla birlikte, tüm genlerinin göreceli ifade karşılaştırılması, FFPET prostat kanseri örnekleri RNA hem kaynakları RNA ekspresyon profili için uygun olduğunu gösteren, PC-3 RNA benzer sentezleme profilleri göstermektedir.

Bu protokol ile ekstre edilmiş genomik DNA'nın performansını göstermek için, FFPET örneklerinden bisülfitle dönüştürülmüş DNA ekstreleri metilasyonu ile çoğaltılmıştır spesifik PCR (MSP). ²⁴ insan genomunda milyonlarca kopya içinde mevcut ALU tekrar eden kısımlar, çok fazla metilatlanmış bölgelerin MSP analizi, ²⁵ genomik metilasyon kontrol olarak kullanılmıştır, ve numuneler arasında en az farklılıklar göstermektedir bekleniyordu. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, ALU MSP metilasyon seviyelerinde, farklı numuneler arasında görülen herhangi bir varyasyona az oldu. Bundan başka, GSTP1, prostat kanserinde, ancak huylu örneklerde hipermetile bilinen bir gen göre MSP deneyleri, ²⁶ herhangi bir bulgulanabilir Amplif gösterdihuylu örneklerden DNA ications. Beklendiği gibi, düşük qPCR döngüsü eşik değerleri metile GSTP1 kopya zenginleştirme gösteren kanserli dokularda DNA tespit edilmiştir. Bu protokol ile geri kazanılmış, nükleik asitlerin kullanımı ayrıca nükleik beyin (post-mortem) selim karaciğerden ve elde asitler ve iki cerrahi bir müdahale göğüs kanseri örneklerinden hazırlanan tipik alt deneylerde test edilmiştir. İkisi de, RT-qPCR bazlı ekspresyon MSP deneyleri, meme kanseri ve karaciğer FFPET iyi performans, ancak RT-PCR deneyi, RNA bozulmuştur düşündüren, ölüm sonrası beyin tümörü örnek yüksek ölçüde sentezlenmiş bir mRNA (Şekil 4C) yükseltmek için başarısız nedeniyle gecikmeli doku fiksasyonu muhtemeldir.

Şekil 1:. FFPET Örnekleri için Ekstraksiyon Usulü Genel Bakış rakam ilgi nasıl bir alanı göstermektedirdoku bloğu bir mikroskop lamı gelen histopatolojik seçimine dayalı eşleştirilir. Üç 0,6 mm doku çekirdekleri daha sonra bir araya homojenize ve daha sonra RNA ve DNA hem de çıkarma tabi biyopsi yumruk kullanarak her doku alanından elde edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

. Şekil 2: İki proteinaz K (Sıcaklık Kararlı ve Yüksek Etkili Enzimler) ve ikincisi için inkübasyon Times bir Aralığı boyunca test (A) Proteinaz K Performans gelen ng Nükleik Asitler (DNA ve RNA) verimleri / FFPET mm ³ farklı tedarikçilerden. DNA ekstraksiyon k ile birlikte sıcaklık kararlı enzimi kullanılarak temsili FFPET numunesi üzerinde gerçekleştirilmiştirBaşka bir üreticinin daha güçlü enzim karşı. DNA verimi en üst düzeye çıkarmak için en uygun Proteinaz K inkübasyon süresi belirlenmesi (B). yüksek konsantrasyonda proteinaz K sindirimi performansı 3 FFPET numuneleri kullanılarak üç farklı inkübasyon süreleri değerlendirilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın (SEM) standart hata temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:. Nükleik Asitler (DNA ve RNA) Örnek Yıllara ve Temsilci Doku Türleri karşısında Toplam İçindeki FFPET Evi / mm ³ ng verimleri (A) Toplam formalin ile fikse parafine gömülü doku nükleik asitleri kurtarıldı. sunulmuştur nükleik asitler miktarları 333 FFPET örneklerinin ekstraksiyon dayanmaktadır Uoptimize protokol şarkı. Iyileşti toplam DNA ve RNA ve FFPET örneklerinin yaş arasında (B) Korelasyon arsa. Kullanılan ekstre FFPET örnekleri 333 prostat örneklerinde eşzamanlı ekstre DNA ve RNA verimi arasındaki 2012 (C) Korelasyon yaşındaki 2000 elde edildi. DNA ve RNA verimleri arasında pozitif bir korelasyon vardır. Ek arşiv doku türlerini kullanarak protokolü (D) Gösteri. Optimize edilmiş bir protokol 14 kanseri (meme, mesane, beyin) ve normal (karaciğer) örnekleri nükleik asitlerin ekstre edilmesi için kullanılmıştır. Hata çubukları SEM temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: RNA ve DNA performans Tissu'dan Co-özümlendiAlt Uygulamalar e çekirdek. (A) mRNA FFPE prostat kanseri dokular için taze PC-3 hücre hattı, kontrol için de geçerlidir. Her bir nokta ayrı ayrı çıkarılan 3 teknik çoğaltır ortalamasını temsil eder. Taze PC-3 hücre çizgisi RNA değerler sarı bar ve FFPET dokusu değerleri ile gösterilmiştir renkli noktalar ile temsil edilmektedir. FFPET prostat kanseri örneklerinin DNA (B) metilasyon spesifik PCR. Döngü eşik değerleri 50 ng / bisülfitle dönüştürülmüş DNA reaksiyon kullanılarak, beklendiği gibi yapılan 10 numune için elde edilmiştir. Tüm FFPET örneklerinden ALU MSP deneyleri benzer döngü eşik değerleri (p> 0.67) vardı. GSTP1 MSP tahlilleri yüksek metilasyon (düşük devir eşiği) iyi huylu prostat oranla prostat kanserinde düzeyleri gösterdi. (C) ilave doku tipleri DNA ve RNA kalitesinin değerlendirilmesi. HPRT1 gen ifadesi ve alu gen metilasyon analizleri elde nükleik asitler (sırasıyla RNA ve DNA) gerçekleştirildi veyamal karaciğer (otopsi) ve beyin (otopsi) ve meme kanserleri (bütün FFPET). prostat sonuçları karşılaştırma için gösterilmiştir. Not: Benzer sonuçlar otopsi numune başarısız mRNA amplifikasyonu hariç her bir doku tipinden gözlenmiştir. Her nokta veya çubuk bir örnek temsil eder ve hata çubukları SEM temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

doku Çekirdekler
	Doku Girdi (mm3)	Ekstre Nükleik Asit	onaylama		Kalite kontrolü: DNA			Kalite kontrolü: RNA
			(Örnekleri arasında)	Numune yaşı (yıl)	Toplam verim (ng)	Fragman boyutu (bp)	PCR	Toplam verim (ng)	Fragman boyutu (bp)	PCR	NanoString
Pikor ve diğ.	43-129	DNA	Veri yok	Veri yok	Veri yok	Veri yok
Montaser-Kouhsari ve ark.	18-29,5	RNA	763	0-25				843	Veri yok
Bu kağıt	1.71	DNA ve RNA	> 350	3-12	820	100-500		2270	100-500		/ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/>
Doku kesitleri
	doku Girdi	Ekstre Nükleik Asit	onaylama		Kalite kontrolü: DNA			Kalite kontrolü: RNA
			(Örnekleri arasında)	Numune yaşı (yıl)	Toplam verim (ng)	Fragman boyutu (bp)	PCR	Toplam verim (ng)	Fragman boyutu (bp)	PCR	NanoString
Heikal ve diğ.	5 x 5 um	DNA	12	7-22	88-300	103-351
Chung ve diğ.	1 x 20 um	RNA	9	> 5				16,000- 23,000	100-200
Antica ve ark.	2 x 4 mm	RNA	18	Veri yok				Bilinmeyen (621 ng / ul)	80-202 +
Ghatak ve diğ.	5 x 5 um	DNA ve RNA	5	1	14 256	<1030		16 000	109-400 +
Hennig ve diğ.	1 x 10 um	DNA ve RNA	210	1-25	Veri yok	Veri yok		Veri yok	Veri yok
Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon
	Doku Girdi (mm2)	Ekstre Nükleik Asit	onaylama		Kalite kontrolü: DNA			Kalite kontrolü: RNA
			(Örnekleri arasında)	Numune yaşı (yıl)	Toplam verim (ng)	Fragman boyutu (bp)	PCR	Toplam verim (ng)	Fragman boyutu (bp)	PCR	NanoString
Kar ve diğ.	1-2	DNA	110	0-2	430	Veri yok

Tablo 1:. Doku çekirdekleri, bölme ve lazer yakalama microdissections için yayınlanmış olan DNA ve RNA ekstraksiyonu protokolleri karşılaştırması da içeren PCR ve Nanostring tahlilleri kullanarak bu yöntemlerin çeşitli molekül son nokta değerlendirme vardır.

Tartışmalar

ilgi doku bölgeleri arasında DNA ve RNA, başarılı bir çıkartma için doğru karot kritiktir. Bu protokol, 0.6 mm çapında çekirdek izole edilmesi için, bir doku zımbanın kullanımını tarif ve mikroskop notasyonları aktarma işlemini FFPET blokları, ilgili kayar özetlenmektedir. üreticinin protokolüne değişiklikler etkin yaklaşık protokolü amaçlanmıştır olan mikrotom bölümleri 50 kat daha kalın olan çekirdeklerden nükleik asitleri, elde etmek için gerekli oldu. çekirdek doku kesitlerinde daha fazla parafin akrabası, tekrarlanan ksilen ve etanol tedavi adımlarda çekirdek etkili parafinden arındırma içerebilir beri istendi. Post-Parafinden arındırma lamların adımların başarısı, uygun mekanik doku çekirdekleri homojenizasyon ve verimli proteinaz K sindirimi bağlıydı. proteinaz K sindirimi daha da iyileştirme yapılabilir.

Bu kayda değer olduğunu bu yöntem tanımladıhistopatoloji slaytlar mukabil tanımlandığı gibi bloğun yüzeyi üzerinde ilgili fies alanları. 3 ya da 4 mm derinliğinde olabilir çekirdek hasat dokusu gibi, bu protokol, kullanıcıların hücreleri veya dokular blok yüzeyinin altında yatıyordu ne endişe olabilir. Bu geçerli bir endişe olmasına rağmen, (referans ²⁷ gözden) birden fazla çalışmalar doku çekirdekleri sadakatle yinelenen veya üç çekirdek ilgi alanından örneklenir, özellikle patolojik doku blokları histolojik ve moleküler özellikleri temsil ettiğini göstermiştir.

Bu protokolde kabul edilen modifiye ticari çıkarma seti aynı doku hem DNA ve RNA eş zamanlı çıkarma olanak olarak, protokol değerli biyolojik malzeme tasarrufu sağlar ve aynı örnekten iki sonuçlanan nükleik asitler arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. RNA ve DNA eşzamanlı çıkarma yarıya emek ve doku tükenmesi keser ve gen İfade kesin entegre analiz sağlarsalgılamanın yanı sıra DNA'da bulunan epigenetik ve genetik özellikler. bu temsili doku çekirdeklerinden hem RNA ve DNA verimleri beri tipik sırasıyla 600 ve 300 ng aşan ve en güncel PCR ve yeni nesil dizileme uygulamaları genellikle 10-100 ng gerektirdiğinden, bu protokol ile saflaştırılmış örneklerin çoğu yeterli vermelidir birkaç alt analizler için malzeme. Bu protokol bağımsız laboratuarlarda arasında tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir (Selvarajah ve diğ., Prep olarak.). Bu protokol ile ilgili RNA RT-PCR veya popüler bir birden fazla analit platformu kullanılarak gen ekspresyon analizi için yeterli kalitede ve DNA metilasyon spesifik PCR deneylerinde iyi performans göstermiştir. Yeni nesil dizileme kurtarılmış nükleik asitlerin programı değerlendirmeyi amaçlayan ileri çalışmalara gereksinim duyulmaktadır.

Bu nedenle, çok sayıda modifikasyonlar uygun fo render ince FFPET bölümleri için tasarlanmış ticari olarak temin protokolü için yapılmıştır0.6 mm FFPET çekirdeklerinden RNA ve DNA r eş çıkarma. protokol prostat kanseri örneklerinin büyük bir kohort ve meme, beyin ve mesane kanserleri alınan örneklerin sınırlı sayıda sürekli yüksek verim gösterdi. Genel olarak, protokol büyük iyi açıklamalı doku koleksiyonları hedeflenen gen bazlı analizler yürütmek için olanak sağlamak gerekir. Önemlisi, protokol çoğu downstream uygulamalar için FFPET ilgi bölgelerin verimli odaklı örnekleme nispeten küçük eller zamanında ve yeterince yüksek verim sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'"	Bemis	RK-06720-40	Any generic paraffin film will work as a substitute
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach"	Likewise	53-2879-2	Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.
Molecular biology grade absolute ethanol	Fisher BioReagents	BP2818-500	Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute
Molecular Grade H2O	G-Biosciences	786-293	Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O
0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments	Estigen	MPO6[Yellow]	Make sure to use the red receiver punch from the set
Fine point permanent marker	Sharpie	10365796S	Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required
FFPE tissue block
Stained tissue slide corresponding to FFPE block
1.5 ml Micro-Centrifuge Tubes	Fisher BioReagents	05-408-137
2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)	Eppendorf	22431048
1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)	Eppendorf	22431021
Histology Xylene	VWR	CA 95057-822	Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute
Molecular Biology Grade 2-Propanol	Sigma	I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit	Qiagen	80234	Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution	Qiagen	80234	Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Temperature stable proteinase K	Qiagen	80234
High potency proteinase K	Invitrogen	25530-049	Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)	Molecular BioProducts	7003
RNaseA 100 mg/ml	Qiagen	19101
BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2	BD	305274
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)	Qiagen	9001271	Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute
-20 °C and -80 °C Laboratory Freezer
Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes
Digital Vortex Mixer
Pipettes and filter tips
Heating blocks or water baths
Tris Hydrochloride	Amresco	0234
Sodium Chloride	Amresco	0241
Anhydrous Magnesium Chloride	Sigma	M8266
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma	L4509
Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membrane	Pall	PN 4614
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 ml	BD Integra	305274
Hydrochloric Acid	BDH	3026
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform)	Nanostring nCounter platform, Nanostring
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit)	Invitrogen