Aerobik Granül Çamur dan Yapısal Ekstrasellüler polimerik maddelerin çıkarımı

Özet

protokol aljinat gibi hücre dışı polimerler (ALE) elde etmek için aerobik granül çamur çözünür bir metodoloji sağlar.

Özet

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na₂CO₃) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca²⁺). From the six extraction methods used, only the Na₂CO₃ extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca²⁺. The Ca²⁺-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

Giriş

Son yıllarda aerobik granül çamur (AGS) süreci başarıyla birkaç tam ölçekli atıksu arıtma tesislerinin ¹ uygulanan popüler bir biyolojik arıtma prosesi haline gelmiştir. Geleneksel aktif çamur işlemi tersine, AGS işleme mikroorganizmalar yerine yumakların ² granüller oluşturmak. Bu granüller, daha iyi tortulaşabilirlik var yüksek organik yükleme oranlarını dayanacak ve aktif çamur flocs ³ den toksisite daha yüksek toleransa sahip edebiliyoruz.

Biyofilmlerde aksine, AGS kendiliğinden herhangi bir taşıyıcı malzeme ⁴ katılımı olmadan oluşur. ^{6 -} AGS, biyofilm gibi mikroorganizmalar, öz-hareketsizleştirilmiş ⁴ olduğu bir hidrojel matris oluşturmak için yüksek hidratlı hücre dışı polimerik maddelerden önemli bir miktarda (EPS) ⁵ üretir. EPS polisakkaritler, proteinler, nükleik asitler arasında oluşan, (fosfonat kompleks karışımıho) lipidler, humik maddeler ve bazı hücreler arası polimerler ^5,7,8. Bu polimerik maddeler yoğun ve kompakt üçüncül ağ yapısı oluşturarak, vb ⁵ elektrostatik kuvvetler, hidrojen bağları, çekici iyonik kuvvetler ve / veya biyokimyasal reaksiyonların, üzerinden birbirleri ile etkileşim. Hidrojeller ^4,9 formu ve üçüncül ağ yapısının oluşumuna katkıda edebiliyoruz EPS polimerler yapısal EPS, toplam EPS bir alt kümesi olarak kabul bu açıdan bulunmaktadır.

EPS kimyasal yapısı ve granüller ⁵ fiziksel özellikler için sorumludur. Her EPS bileşiğin işlevini anlamak için çok önemlidir. ^{15 -} Çeşitli yaklaşımlar EPS ¹⁰ ayıklamak için uygulanır. Ancak, onların aşırı karmaşıklığı, tek yöntemle bütün EPS bileşenleri çıkarmak için neredeyse imkansızdır. Bugüne kadar hiçbir EPS ekstraksiyon yöntemi "tek beden herkese uyar" var. ^{20 -} Çıkartma metotunun seçimi toplam miktarı, aynı zamanda kazanılan polimer ^13,16 bileşimi sadece etkiler. çamur tipi ve faiz farklı yöntemlerin EPS bağlı olarak gereklidir.

, Jel oluşturucu polimerler ayıklanıyor özelliklerini karakterize ve birbirleri ile ve non-jel oluşturucu EPS ile etkileşimlerini inceleyen aerobik granül çamur oluşumunda EPS rolünü ortaya çıkarmak için yardımcı olacaktır. Bundan başka, jel oluşturucu polimerler, endüstriyel uygulamalarda yararlı olan biyopolimerler bulunmaktadır. Olası bir uygulama zaten kağıt ²¹ su direncini arttırmak için, bir kaplama malzemesi olarak AGS elde edilen jel-oluşturucu polimerleri kullanarak gösterilmiştir.

Bu nedenle, jel-oluşturucu EPS için özel ekstraksiyon yöntemleri, ihtiyaç vardır. Bu çalışmanın amacı, AGS gelen jel oluşturucu EPS ayıklamak için bir metodoloji geliştirmektir. Altı ekstraksiyon yöntemleri ^10-1Literatürde sıkça kullanılan 5,22, AGS adlı EPS ayıklamak için seçildi. toplam tutar ve çıkarılan EPS jel oluşturucu özelliği, her metodoloji açısından karşılaştırıldı.

Protokol

Not: AGS atık su arıtma tesisi Utrecht, Hollanda de Nereda pilot reaktör toplanmıştır. Reaktör belediye kanalizasyon ile beslendi. Taneli çamur ml / g _VSS 59,5 bir çamur hacim indeksi (AHİ _{5 dakika)} vardı. çamur aerobik çevrimin sonunda Nisan ayında örnekleri alındı. Örnekleme sonra çamur hemen laboratuara nakledilir elenmiş ve kullanılana kadar -20 ° C'de depolanmıştır.

1. EPS Ekstraksiyon

Not: 4000 x g ve 20 dakika süre ile 4 ° C'de santrifüje zerre çamur ve süpernatant süzün. ekstraksiyon için sonradan küçük top granüller toplanır. Granüllerin toplam katı (TS) ve uçucu katı maddeler (VS) standart yöntemlerle ²³ ile belirlenmiştir. granül ıslak ağırlığı arasındaki dönüşüm faktörü - pelet doğrudan alınan granül ağırlığı - ve TS çıkarma öncesinde tespit edilmiştir. Tüm ekstraksiyon üç kez yapıldı.

NOT: 3 g ıslak granules her ekstraksiyon yöntemi için kullanıldı. üç kez ölçülen TS ve VS değerleri (0.39 g, TS ve 0.34 g VS), ekstraksiyon verimini hesaplamak için kullanılmıştır.

1. Santrifüj çıkarma ¹¹
   1. bir santrifüjleme tüp içine granüller devri 3 g (ıslak ağırlık) ve minerali alınmış su ile 50 ml santrifüj tüpü doldurmak.
   2. Biraz elle santrifüj tüpü çalkalayın.
   3. Santrifüj 4,000 x g'de karışım 20 dakika boyunca 4 ° C içeren santrifüj tüpü.
   4. Bir cam beher içinde supernatant toplamak pelet atılır ve Bölüm 1.7'de tarif edildiği gibi süpernatant ile devam eder.
2. Sonication çıkarma ¹⁰
   1. bir santrifüjleme tüp içine granüller devri 3 g (ıslak ağırlık) ve minerali alınmış su ile 50 ml santrifüj tüpü doldurmak.
   2. karışıma B 40 ° C'de 2.5 dakika süreyle buz üzerinde darbeli sonikasyon uygulanır.
   3. santrifüj santrifüj4,000 x g'de karışım 20 dakika boyunca 4 ° C içeren boru.
   4. Bir cam beher içinde supernatant toplamak pelet atılır ve Bölüm 1.7'de tarif edildiği gibi süpernatant ile devam eder.
3. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekstraksiyon ¹¹
   1. 100 ml'lik bir cam şişeye granüller devri 3 g (ıslak ağırlık) ve% 2 (ağırlık / hacim) EDTA çözeltisi ile 50 ml şişe doldurun.
   2. Biraz elle şişeyi çalkalayın ve 3 saat süreyle 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
   3. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine karışımı aktarın.
   4. Santrifüj 4,000 x g'de karışım 20 dakika boyunca 4 ° C içeren santrifüj tüpü.
   5. Bir cam beher içinde supernatant toplamak pelet atılır ve Bölüm 1.7'de tarif edildiği gibi süpernatant ile devam eder.
4. Formamide - sodyum hidroksit çıkarma (NaOH) ¹³
   1. Bir 100 granüllerin devri 3 g (ıslak ağırlık)ml cam şişe demineralize su ile 50 ml şişe kadar doldurun ve.
   2. 0.3 ml% 99 formamit ekleyin.
   3. Biraz elle şişeyi çalkalayın ve 1 saat 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
   4. Granül süspansiyonuna 20 mi, 1 M NaOH ekleyin.
   5. Biraz elle şişeyi çalkalayın ve 3 saat süreyle 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
   6. iki adet 50 ml'lik santrifüj tüpüne eşit karışımı aktarın.
   7. Santrifüj 4,000 x g'de karışım 20 dakika boyunca 4 ° C içeren santrifüj tüpleri.
   8. Bir cam beher içinde supernatant toplamak pelet atılır ve Bölüm 1.7'de tarif edildiği gibi süpernatant ile devam eder.
5. Formaldehit - NaOH çıkarma ¹¹
   1. 100 ml'lik bir cam şişeye granüller devri 3 g (ıslak ağırlık) ve minerali alınmış su ile 50 ml şişe kadar doldurun.
   2. 0.3 ml% 37 formaldehit ekleyin.
   3. Biraz el ve mağaza tarafından şişe sallamak1 saat süre ile 4 ° C'de buzdolabında.
   4. Granül süspansiyonuna 20 mi, 1 M NaOH ekleyin.
   5. Biraz elle şişeyi çalkalayın ve 3 saat süreyle 4 ° C'de buzdolabında saklayın.
   6. iki adet 50 ml'lik santrifüj tüpüne eşit karışımı aktarın.
   7. Santrifüj 4,000 x g'de karışım 20 dakika boyunca 4 ° C içeren santrifüj tüpleri.
   8. Bir cam beher içinde supernatant toplamak pelet atılır ve Bölüm 1.7'de tarif edildiği gibi süpernatant ile devam eder.
6. Yüksek sıcaklık - sodyum karbonat ekstraksiyonu (Na ₂ CO ₃₎ ^9,22,24
   1. Ön ısıtma 150, 80 ° C'ye kadar bir manyetik karıştırıcı ile 1000 ml'lik bir cam beher içinde musluk suyu ml.
   2. şişesindeki ve minerali giderilmiş su ile 50 ml'ye kadar şişeye doldurmak 250 ml lik bir granül devri 3 g (ıslak ağırlık).
   3. 0.25 g Na ₂ CO ₃ susuz veya 0.67 g Na ₂ CO ₃ • 10H ekleme 2 O% 0.5 elde etmek için (a / h) _{2CO 3} konsantrasyonu, MD.
   4. su banyosu içine karışımını içeren şişe yerleştirin. buharlaşmasını önlemek için alüminyum folyo ile ayrı ayrı şişeyi ve beher cam örtün.
   5. 400 rpm'de 35 dakika ve 80 ° C'de karıştırın.
   6. 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine karışımı aktarın.
   7. Santrifüj 4,000 x g'de karışım 20 dakika boyunca 4 ° C içeren santrifüj tüpü.
   8. Süpernatant toplayın ve pelet atın.
7. Standart yöntemler ^23'e göre bütün ekstrelere TS ve VS ölçümü.
   1. ((Kesilmiş) MWCO 3,500 Da molekül ağırlığına sahip diyaliz torbası) ^11,12 süpernatant atın ve 1.000 ml ultra saf suya karşı 24 saat için dialyze. diyaliz etkisini artırmak için 12 saat sonra diyaliz suyu değiştirin.
   2. diyaliz süpernatant (1/3 civarında) makul bir kısmını aktarmakTS ve ölçüm ²³ VS bir alüminyum çanak.
      Not: bir gece boyunca 105 ° C de bir örnek kurutun. Boş alüminyum çanak ve kurutulmuş numuneyi içeren alüminyum çanak ağırlık farkı TS içeriğidir. Daha sonra 2 saat 550 ° C de bir örnek ihtiva eden aynı alüminyum tabak yakmak. Boş alüminyum çanak ve yanmış örneği içeren alüminyum çanak arasındaki ağırlık farkı kül içeriğidir. TS ve kül içeriği arasındaki fark VS içeriğidir.
   3. Her bir ekstre için, 10 ml'lik bir cam bardak diyaliz yüzer kalan kısmını aktarmak. süpernatan içindeki polimer konsantrasyonunu arttırmak için 1-2 ml'lik bir son hacme kadar, 60 ° C'de 2 gün için supernatant koyulaştırılır.

2. Aljinat gibi Ekstrasellüler Polimer (ALE) Ekstraksiyon

1. Aşama 1.7.1 göre aşama 1.6.8 'de elde edilen ekstrenin dialyze.
2. 250 ml'lik bir cam kabın içine diyaliz edilen ekstre, aktarın. Yavaşly 100 rpm'de ve oda sıcaklığında çıkarma karıştırın. asidik formda ALE elde etmek için 2.2 ± 0.05 bir son pH, 1 M hidroklorik asit (HCI) eklenirken, sürekli, bir pH elektrodu ile, pH değişiklikleri izlemek.
3. 2.2 pH ayarlandıktan sonra 4,000 x g'de 50 mi santrifüj borusu ve santrifüj içine özü transferi ve 20 dakika boyunca 4 ° C.
4. Süpernatantı atın ve jel benzeri pelet toplamak. jel benzeri pelet asidik formda ALE olduğunu.
5. pH 8.5 elde edilene kadar el ile cam bir çubuk ile yavaş yavaş jel karıştırılarak yavaşça Aşama 2.4'te elde edilen jel, 0.5 M NaOH (ya da 0.5 M potasyum hidroksit) ekleyin, sodyum (veya potasyum) ALE şeklini elde etmek için.

3. İyonik Hidrojel Formasyonu Testi

NOT: çıkarılan EPS iyonik hidrojel oluşumu özelliklerini, ²⁵ kullanılan Ca ^{2 +} iyonları ile bir boncuk oluşum testi olsaydı amacıyla kontrol etmek.

1. Adım 1.7.3 ekstrenin kalınlaşması sonra1-2 ml hacim, yavaş yavaş, bir cam çubuk ile iyice karıştırılır ve 0.5 M NaOH ile 8.5'a pH'ını ayarlamak.
2. Aşama 3.1 veya adım 2.5 sodyum ALE özü almak ve yavaş yavaş _(CaCI2) çözeltisi, kalsiyum klorür (ağırlık / hacim)% 2.5 bir Pasteur pipeti ile özü damla.
   NOT: Çıkarılan EPS özelliklerini oluşturan iyonik hidrojel jel varsa, damla şekilli (küresel) boncuklar oluşturulacaktır. Ekstre EPS özelliklerini oluşturan herhangi bir iyonik hidrojel jel varsa, ekstre _CaCI2 çözeltisi içinde dağılacaktır.

İyonik Hidrojel 4. Stabilite Testi

Not: daha AGS yapı oluşumu iyonik EPS hidrojel rolünü anlamak için, kararlılık testleri adım 3.2 toplanan Na ₂ CO ₃ ekstre iyonik hidrojel boncuklar, üzerinde gerçekleştirilmiştir.

1. _CaCI2 çözeltisi içinde 30 dakika için hidrojel boncuk tutun.
2. CaCl ₂ hidrojel boncuk çıkarmak için bir kaşık kullanın çözüm ve dört eşit kesirler boncuk ayrıldı.
3. 10 ml mağazası fraksiyon 1 4 ° C'de 4 saat boyunca su minerali alınmış.
   1.5 - ekstraksiyon yöntemleri 1.3 de tarif edildiği gibi, aşağıdaki stabilite testleri aynı şekilde gerçekleştirilmiştir.
4. 10 mi% 2 saklayın fraksiyon 2, 4 ° C'de 3 saat (ağırlık / hacim) EDTA çözeltisi.
5. 7.15 ml mağazası fraksiyon 3, 4 ° C'de 1 saat süre ile 60 ul% 99 formamid ile arıtılmış su. Daha sonra 4 ° C'de 3 saat 2.85 mL, 1 M NaOH ve mağaza fraksiyonu 3 ekleyin.
6. 7.15 ml mağazası fraksiyon 4, 4 ° C'de 1 saat süre ile 60 ul% 37 formaldehid ile arıtılmış su. Daha sonra 4 ° C'de 3 saat 2.85 mL, 1 M NaOH ve mağaza fraksiyonu 4 ekleyin.
7. Boncuklar ekstraksiyon şartlarına dayanıklı olmadığını değerlendirmek için 4.6 - 4.3 anlatılan şartlar altında depolama sırasında boncukların görebilir ayrışma varsa izleyin.

Sonuçlar

EPS çıkarma
Farklı EPS çıkarma işlemleri uygulandıktan sonra granül görünümü, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Granüllerin şekli ve jel yapısı santrifüjleme (Şekil 1a) ve EDTA çıkarma (Şekil 1c) sonra sağlamdı. Granül sonikasyonla farklı boyutlarda parçalara kırılmıştır. Bulanıklık yüksek santrifüj sonra azaldıkça sıvı fazda bulanıklık nedeniyle küçük parçalara (Şekil 1b) askıya alınmasına olabilir. Formamid ve formaldehit tek başına granül şekli ve jel yapısını değiştirerek üzerinde herhangi bir etkisi yoktu (veriler gösterilmemiştir). NaOH ilave edildikten sonra, sıvı faz sarımsı döndü. Bazı tüylü malzemeyi granüllerin yüzeyinden ayrılır ve yerleşmiş granüller (Şekil 1d ve 1e) üstüne bir katman oluşturulmuştur. Yine de, şekligranüller değişmedi. NaOH eklenmesi görünüşte EPS çözünürlüğünü geliştirilmiş, ancak jel matris yapısına zarar olamazdı. Buna karşılık, granüller tamamen Na ₂ CO ₃ çıkarma (Şekil 1f) sonra kayboldu. Bunun yerine, sol-benzeri sıvı ve küçük jöle benzeri partiküllerin bir karışımı, gerçekten de çözündürülmüştür granül jel matrisini gösteren oluşturuldu.

Şekil 1. Aerobik taneli çamur EPS çekimler. Granül her ekstraksiyon yönteminin etkisini daha iyi görselleştirme için, deneyler 25 ml cam şişelerde yapılmıştır. ekstraksiyon işleminden sonra, ekstreler asılı madde yerleşmeye izin verecek şekilde, oda sıcaklığında 1 saat süre ile tutuldu. (A) Santrifüj ekstraksiyon, (b) Sonikasyon ekstraksiyon, (c) EDTA ekstraksiyon, (d) formamid - NaOH ilavection, (e) Formaldehit - NaOH çıkarma, (f) Yüksek sıcaklık -. Na ₂ CO ₃ çıkarma , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Her bir yöntem için VS kesrine göre EPS verimi, Şekil 2'de tasvir edilmiştir. Verim _granül VS g baş harfi her _EPS VS mg sunulmuştur. Formaldehid + NaOH ile elde edilen EPS miktarı, formamid + NaOH, Na +, karıştırma ₂ CO ₃ + Isı santrifüj, sonifikasyon ve EDTA çıkarma daha yüksek idi. Alkali koşullar EPS çözünürlüğü ^26,27 geliştirmek olduğunu belirten ^{13,15 -} Bu çıkarma teknikleri için benzer sonuçlar da önceki çalışmalarda ¹¹ ile gösterilmiştir. Na ₂ CO ₃ ile kurtarılan EPS miktarı Sadece santrifüjleme ile elde edilen daha fazla 20 kat, en yüksektir. Ayrıca, Na ₂ CO ₃ çıkarıldığı toplam EPS verimi daha da birden fazla ekstraksiyon tarafından geliştirilmiş olabilir. İlk çıkarma adımı 1.6.8 (protokol bölümünde) atılır pelet kullanılarak ikinci bir çıkarma dörtlü çıkarma bile% 46 toplam verim artışı,% 28 oranında toplam verim arttı.

Şekil VS verim ve kül içeriği ile ilgili tüm ekstraksiyon yöntemleri 2. Sonuçlar. Her biri için ilk bar _granül VS g baş harfi başına _EPS VS mg VS verim temsil ekstraksiyon. İkinci çubuk çıkarılan TS kül ağırlık yüzdesini temsil eder. Hata çubukları, her ekstraksiyon tekniği için gerçekleştirilen üç ekstraksiyon standart sapmasını göstermektedir."_blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Aljinat gibi hücre dışı polimer (ALE) çıkarma
Na ₂ CO ₃ ekstre ekstre EPS'nin pH 2.2 olacak şekilde ayarlandıktan sonra, toplam VS% 63 çöktürüldü. Çökelek asidik ALE ^25'tir. Kalan fraksiyon ekstraksiyon koşulları altında çözünür hale getirilebilir olasılıkla EPS, ancak pH 2.2 bir çökelti oluşturmaz.

İyonik hidrojel oluşumu testi
Aerobik granüller bir hidrojel benzer olarak tarif edilmiştir. Granülasyon işlemi jelleştirme maddesi ^4,9,25,28 olarak glikozitler içeren bir jel oluşturucu bir fenomen olarak kabul edilmiştir. Normal olarak, Ca ^{2 +} atık en yaygın katyon biridir. Buna ek olarak, kolayca asidik polisakkaridler ile bağlanır (örneğin,Muhtemelen bir karşı-iyon olarak alginatlar ve poli-galakturonik asit), jelleşme ²⁹ aracılık etmek. Bu nedenle, bir iyonik olarak çapraz bağlanmış hidrojel sonuçlanır. Ca ^{+ 2} iyonları ilavesi aerobik çamurun granülasyonu ³⁰ hızlandırabilir görülmüştür. Bu nedenle, Ca ²⁺ -EPS (iyonik hidrojel) aerobik granül çamur jel matris yapısını oluşturmada önemli bir rol oynayabilir. Bu bağlamda, ekstre EPS olup ekstre EPS aerobik zerre çamur ⁹ jel matrisinin oluşmasına katkıda bulunan yapısal bir polimer ise, kontrol etmek için bir test olarak kullanılabilir Ca2 ⁺ iyonları ile iyonik bir hidrojel oluşturmaktadır.

Bu araştırmada, çeşitli yöntemler ile AGS (Şekil 3a) elde EPS, Na ₂ CO ₃ ile ekstre edilmiş EPS sabit iyon hidrojel boncuk (ağırlık / hacim) _CaCl2 çözeltisi% 2.5 bir damlacık şeklinde düzenlenen ve oluşan .Ayrıca, bu elde edilen sodyum ALE ek adımları (ALE polimer çıkarma, Şekil 3b) yanı sıra aynı özellik görüntülenen tarafından EPS. Ca ^{2 +} -ALE jel boncukları (Şekil 3c) renk ve morfoloji aerobik granül çamur (Şekil 3a) benzer. Görünüşe göre, Na ₂ CO ₃ yöntemi ile ekstre EPS aerobik zerre çamur jel matrisinin oluşmasına katkıda bulunur. Bu EPS bir ana bileşenidir ALE iyonik hidrojel oluşturabilen yapısal polimerlerdir.

Iyonik hidrojel Stabilite testi
Bu EPS ekstraksiyon sırasında, aerobik granüller EDTA, formaldehit + NaOH ve formamid + NaOH (Şekil 1) küresel şekillerini muhafaza gözlemlenmiştir. Ca, çıkarılan yapısal polimerler granül istikrar rol oynarsa anlamak için ^{2 +} -ALE boncuklar vardıekstraksiyon sırasında aerobik granül aynı şekilde tam olarak tedavi edildi. Yani, Ca ^{2 +} -ALE boncuk EDTA son derece stabil - İlginçtir, Ca ^{2 +} -ALE boncuklar AGS olduğu gibi benzer kararlılıkları (3f Şekil 3d) görüntülenir. Ca yüzeyinden ayrılmaktadır ALE az miktarda oluştu ^{2 +} -ALE boncuklar, üç saat süre ile (küçük kahverengi Şekil 3e, topak ve 3f), Ca ^{2 +} -ALE boncuk formaldehit içine batırılmış olan + NaOH ve formamid + NaOH , sırasıyla. ^{Ca2 +} -ALE boncuk ve aerobik granüller arasındaki stabilitesi açısından Bu benzerlik ALE AGS jel matris oluşturan önemli yapısal polimerlerin bir bölümü olduğunu gösterir.

Şekil 3. Aerobik granülleri ve çıkarılan ALE. (A) demineralize su pr granüllerior çıkarma. 4,000 x g'de santrifüj edilir ve 20 dakika boyunca 4 ° C'de ardından (paragraflar 1.6 ve 2 'ye göre özütlendi), (b) Asit ALE. iyonik hidrojel stabilite testi sonuçları. (C) Ca ^{2 +} -ALE boncuklar 4 ° C 'de 4 saat demineralize su içinde saklanır. (D) Ca2 ⁺ -ALE boncuklar 4 ° C 'de 3 saat boyunca,% 2 EDTA depolanır. (E) 4 ° C'de 4 saat boyunca formamid + NaOH içinde saklanan Ca ^{2 +} -ALE boncuklar. (F) Ca 4 ° C'de 4 saat formaldehit + NaOH saklanan ²⁺ -ALE-boncuk. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Protokol bölümüne Açıklamalar
EPS / ALE ekstraksiyonu 50 ml hacimde ve granüller 3 g tarif edilmiştir. Bu değerler rehber olarak tasarlanmıştır. yüksek granül konsantrasyonları Ekstraksiyonları çıkarılan EPS verimini azaltabilir. ALE ekstre etme esnasında, sıcaklık 30 dakika boyunca 80 ° C 'de sabit tutulmalıdır. ısıtmak için karışım için gerekli olan süre (yaklaşık 5 dakika) protokolüne dahil edilir. Ayrıca, ekstraksiyon etkinliği şişe dibinin çapı ile aynı büyüklükte bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak geliştirilmiştir. Bu EPS çıkarma teşvik iyi karıştırma özellikleri ve freze etkilere neden olur.

Daha sonra protokol bölümüne, (adımlarda 1.1-1.6 toplanan süpernatant) tüm çekimi TS ve VS verimleri belirlenmiştir. Diyaliz ekstraksiyon için kullanılan kimyasal maddeler nedeniyle olası hataları azaltmak için önceden TS ve ölçüm VS yapılması gerekmektedir. bir3.500 Da MWCO diyaliz çanta içinde EPS makromolekülleri koruyarak bu kimyasalların kaldırmak için tavsiye edilir. Diyaliz poşeti özü hacminden daha büyük bir hacme sahip olmalıdır. Ekstresinin hacmi (% 40'a varan oranda hacim artışına EDTA çıkarılması için, örneğin) diyaliz sırasında artacak çünkü bu gereklidir. Diyaliz kimyasal yok etme öncesinde ve diyalizden sonra numune pH ölçümü ile belirlenebilir. Alternatif olarak, diyaliz su iletkenlik ölçümleri iyon kaldırma ölçüde göstermektedir.

Toplam çıkarılan EPS ALE elde (1.6 adımlar ve 2) diyaliz adım isteğe bağlıdır için. Bununla birlikte, diyaliz üç faydası vardır: o yağış için gerekli HCl miktarı, o özü asit kütle transferi geliştirir ve elde edilen ALE kül içeriğini azaltır azaltır. ALE çökeltilmesi için, Extrac çok daha büyük bir hacme sahip, bir cam beher kullanılması önerilirt. Na ₂ CO ₃ normalde çıkarma aşırı doz almaktadır. Örnek köpük olarak, önce, diyaliz değil, ilk _{Na2 CO3} ile reaksiyona girecek ilave HCI, karbon dioksit oluşumu ile sonuçlanarak, özü ve sol. HCI ilavesi sırasında, boşaltma kabın alt aynı boyutta bir manyetik karıştırıcı ile yavaş yavaş karıştırılır. Bu boyut ve yavaş karıştırma bir karıştırma çubuğu da çökelti yapısını bozmadan karıştırılması ile sonuçlanacaktır. Asidik jel kümeleri özü içinde oluşturulmuş ise, beher elle hafifçe döndürülmüştür gerekmektedir. Yağış de numunedeki asit homojen bir dağılım elde edilirken özü büyük bir hacim artışına bilmek 1 M kadar bir asit konsantrasyonu ile gerçekleştirilmiştir. Daha yüksek asit konsantrasyonları bölgesel pH düşüşü ve asidik jel kümeleri oluşumu ile sonuçlanabilir. 2.0'den düşük bir pH değerine muhtemelen yapısal değişikliklere, elde edilebilir ALE miktarını azaltırdüşük bir pH değerinde polimer. 2.20 ± 0.05 nihai pH tutmak önemlidir.

Sınırlamalar
ALE ekstraksiyon yöntemi genel olarak AGS veya biyofilm gelen EPS yapısal hücre dışı polimerler ayıklamak amaçlayan ve mevcut tüm EPS ayıklamak için tasarlanmamıştır. Tüm EPS çıkarmak için birden fazla ekstraksiyon yöntemi bir kombinasyonu gereklidir. Bir çift ve dört çıkarma uygulayarak VS _EPS verim artışı ile gösterildiği gibi üstelik, tek çıkarma tüm yapısal EPS ayıklamak olmaz. ALE çıkarma ısı ve alkalin koşulları ile sürekli karıştırma birleştirerek, sert bir EPS ekstraksiyon yöntemidir. Bu nedenle, bazı hücre içi madde EPS ile ekstre edilmiştir mümkündür. Hücre lizizi, fiziksel ve kimyasal ekstraksiyon teknikleri (sonikasyon ^31,32 NaOH ^31,32 EDTA ^11,32 CER ^32, ısı ³² ve yüksek kesme hızları m kaynaklanabilir, ancak) ¹⁹ ixing, geri EPS hücre içi malzemesinin varlığının hala teyit edilmesi gereklidir. kurtarıldı EPS hücre içi malzeme analiz değildi içerip içermediğini çıkarılan EPS iyonik jel oluşturucu özelliği, bu araştırmanın ana odak noktasıdır. Gelecekteki araştırmalar çıkarılan EPS hücre içi malzeme tanımlamaya odaklanacak.

AGS hidrojel matrisi çözündürücü yapısal EPS ayıklamak için çok önemlidir
EPS formlar AGS yoğun ve kompakt hidrojel matrisi. EPS gibi hepsi değil, polisakkaritler, proteinler, nükleik asitler, (fosfo) lipidler, humik maddeler ve bazı hücreler arası polimerler ^7,5,8, organik makro moleküllerin çeşitli sınıfları içerir, ancak bir jel oluşturur. Yalnızca jel oluşturucu polimerler burada EPS yapısal polimer olarak kabul edilmektedir.

EPS ekstraksiyon amacı ilk EPS çözmek ve daha sonra çözülmüş EPS toplamaktır. Yapısal EPS (yani, T iseO) bir hidrojel oluşturan EPS ekstre hedef, AGS jel matrisi birinci çözünür olmalıdır. Jel matris çözünür Yalnızca yöntemler yapısal EPS çıkarma yeteneğine sahiptirler. ^15, Sonication ^10,14,15, EDTA ^{10 - - 12,14,15,} formaldehit + NaOH ^{10 -} NaOH ¹³ verimli yapısal izole edemedi + ¹⁵ ve formamid Bu araştırmada, bazı sık bu tür santrifüj ¹⁰ olarak EPS ekstraksiyon yöntemleri kullanılır EPS. Bu, aerobik granüllerin hidrojel matrisi, bu yöntemler ile çözünür değildi kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, 4. bölümde stabilite testleri sadece EDTA, formamid + NaOH mevcut koşullar ve formaldehit + NaOH ekstraksiyon ile yapıldı. Bu üç ekstraksiyon yapısal EPS izole yeteneğine sahip değildir, ama yine de Na ₂ CO ₃ ekstraksiyon yanı sıra yüksek VS _EPS verimi elde edilmiştir. Koşullar of Na ₂ CO ₃ çıkarma açıkça AGS matris çözündürülmüş bu ekstraksiyon yöntemi olarak uygulanmadı. Bu nedenle stabilite testi sırasında uygulanan koşullar Örnek olarak kabul edildi.

CER EPS ekstraksiyon önceki çalışmalarda burada kullanılan kimyasal çekimi daha iyi sonuçlar vermedi gibi katyon değişim reçinesi (CER), bir başka sık kullanılan EPS ekstraksiyon yöntemi ile ekstraksiyon, bu karşılaştırma için kabul edilmedi.

AGS EPS jel
Jel-oluşturucu EPS AGS hidrojel matris içerisindeki yapısal EPS olarak kabul edilir. Böyle iyonik jeller, sıcaklık kaynaklı jeller ve pH kaynaklı jelleri gibi hidrojellerin çeşitli olduğunu işaret değer. Bu çalışma sadece iyonik jelleri oluşturan EPS odaklanır. ekstre yapısal jel malzeme büyük kısmını ilgili olarak, bu, yapısal olarak EPS olması muhtemeldir. olasılık kesinlikle vardır ki EPS diğer türBu hidrojeller oluşturan farklı türde (örneğin, pH değeri neden jel ²⁸⁾ aerobik granüllerin, aynı ya da başka tür bulunmaktadır. Yine de, ne olursa olsun hidrojel ne tür EPS jel matris jel oluşturucu EPS ayıklamak için en önemli adımdır çözülmesi hedeflenmektedir.

Şu anda, çok az araştırma granül çamur yapısal EPS üzerinde yapılmıştır. Bu protokol açıklanan ALE çıkarma AGS gelen jel oluşturan EPS çıkarma yeteneğine sahiptir ve yapısal EPS karakterize etmek gelecekteki çalışmalarda kullanılacaktır. Daha fazla araştırma daha iyi granülasyon ve EPS süreci ve işlevini anlamak için AGS, yapısal EPS ve yapısal olmayan EPS yapılması gerekmektedir. mikroorganizmalar EPS kesin kompozisyonu ve nasıl EPS bileşimi çevresel değişikliklere bağlı olarak modifiye ne EPS gibi büyük miktarda üretmek neden: Özellikle şu üç puan araştırılması gerekmektedir. Algılama ve ilgili tüm bileşikleri ve bunların etkileşimleri için analizons biyofilm ve nasıl bizim için avantaj bunları kullanmak için anlamanıza yardımcı olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 ml baffled flask	Kimble	25630-250
1,000 ml glass beaker	VWR	213-1128
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer	IKA	3810000
sodium carbonate decahydrate	Merck KGaA	1063911000
50 ml centrifugation tubes	greiner bio-one	227261
Multifuge 1 S-R, centrifuge	Heraeus/Thermo Scientific	-
hydrochloric acid, 37%	Sigma-Aldrich	30721-1L-GL-D
250 ml glass beaker	VWR	213-1124
calcium chloride dihydrate	Merck KGaA	1023821000
1 ml Pasteur Pipette	Copan	201C