CD4 hazırlanması<sup&gt; +</sup&gt; Mikroskopi GD3 ve GD2 Gangliozidleri Membran İfade Analizi T hücreleri

Özet

Istirahat bölgesindeki gangliosidler ve aktive edilmiş insan naif CD4 ⁺ T hücrelerinin membran ekspresyonunu ve sınırlandırılmasını belirlemek için mikroskopla kullanılmak için bir standart antikor boyama protokolü tarif eder. Ayrıca gerçek zamanlı PCR deneyleri

Özet

Süspansiyonda saf CD4 ⁺ T hücrelerinin aktivasyonu için, burada tarif edilen yöntem ve konfokal mikroskopi analizi için lamelleri bunların yapışma deneyleri profil komplemanın sentezleme akış sitometrisi gibi, CD4 ⁺ T hücresi aktivasyonunda rol gangliosidler uzamsal lokalizasyonu ve görselleştirme izin batı blotting ya da gerçek-zamanlı PCR. akış sitometrisi ve mikroskopi yoluyla hücresel lokalizasyon yoluyla gangliosid ifadesinin ölçümü, yüksek yakınlık ve özgüllük ile anti-gangliosid antikorların kullanılması ile elde edilebilir. Bununla birlikte, süspansiyon içinde hücrelerin yeterli bir kullanım floresan veya konfokal mikroskopi edinimi için gerekli olan yapışma teşvik etmek için kültür plakaları muamele edilmesini içerir. Bu çalışmada, saf CD4 ⁺ T hücresi aktivasyonu sırasında GD3 ve GD2 gangliozid ekspresyonunu ve TCR ile ko saptanması için bir protokol açıklar. Ayrıca, gerçek-t<40,000 hücre kullanılarak ime PCR deneyleri hücre düşük sayıda ilave düşük giriş RNA kitleri gerek kalmadan gerçekleştirilebilir bu gen analiz deneyleri gösteren, GD3 ve GM2 / GD2 sintaz genlerinin belirlenmesi için tarif edilmiştir.

Giriş

CD4 ⁺ T hücreleri, antijen sağlayan hücreler ¹ tarafından aktive edildikten sonra, bunların etki edici fonksiyonları ile bağışıklık yanıtını yönlendirirler. etkinleştirme sırasında modüle hücresel mekanizmaların çalışma bağışıklık fonksiyonunun temel bir süreci içine fikir verir. Kan çevre ² hücrelerinin çok küçük bir popülasyonu temsil Ancak, saf CD4 ⁺ T hücrelerinin çalışması zor olabilir.

Floresan mikroskobu aracılığıyla çeşitli raporlar CD4 ⁺ T hücresi aktivasyonu yer alan farklı moleküller plazma membranında ³ ile ilişkili temel protein lokalizasyonu inceledik. Gangliositler sialik asit içeren glikosfingolipidler ve onlar yaygın böyle bağışıklık hücreleri gibi bol, diğer hücreler sinir hücreleri incelenmiştir rağmen, aynı zamanda biyolojik ilgili fonksiyonları ^4,5 ile gangliositler ifade eder. Biz daha önce tha bildirdiST8Sia 1 (GD3 sentaz) ve GM2 / GD2 sentaz sıyalıltransferaz α2,8 bir düzenlenmesi görülür, insan naif CD4 ⁺ T hücrelerinin aktivasyonu sırasında bulunan t, yani GD2 önemli yüzey neoexpression ve GD3 gangliozide ⁶ düzenlenişini uyarmaktadır. bağışıklık hücrelerinde GD3, GD2 ve gangliosidler daha başka çalışma, bağışıklık fonksiyonunun bir protein bazlı kısmi görünümü güzelleştirmek için gereklidir.

Genel olarak, gangliosid ifade çalışması, ince tabaka kromatografisi (TLC), ⁷ gibi teknikler dayanan, ancak bu teknik, biyolojik analizi sınırlayıcı plazma membranı veya hücre içi bölümlerinde gangliosidler uzamsal lokalizasyonu izin vermez.

Bu çalışmada, anti-CD3 / anti-CD28 aktivasyonundan sonra, insan naif CD4 ⁺ T hücreleri ve PBMC'de GD3 ve GD2 antikor aracılı tanımlama ve lokalizasyonu için bir protokol açıklamaktadır. Bu protokolü i ilelenfositlerin küçük boyutlu (9 mm) dikkate alınarak, yüksek kaliteli görüntüler ⁶ satın alınmasından sonra, süspansiyon hücrelerin düşük sayıda gangliosidler geni ve moleküler ifadesini analiz etmek de mümkündür.

Protokol

Sağlıklı erkek vericilerden alınan periferik kan aydınlatılmış onam ve Centro de INVESTIGACION en DINAMICA Celular- Universidad Autonoma del Estado de Morelos Biyoetik Komitesi onayı ile elde edilmiştir.

1. İzolasyon ve insan naif CD4 ⁺ T hücrelerinin aktivasyonu

1. bilgilendirilmiş rıza ile Sağlıklı insan donörlerden elde edilen periferal kan 2 mL kan ve steril PBS-EDTA, 2 ml seyreltin (1x Fosfat tamponlu tuz (PBS), 2 mM EDTA, pH 7.4) eklenmiştir. Daha önce tarif edildiği gibi ⁸ 1.077 yoğunlukta sukroz çözeltisi 3 ml üzerine yavaşça seyreltilir kan ekleyin.
   Not: yoğunluğundaki farklar nedeniyle santrifüj sırasında Diferansiyel geçiş eritrositler tamamen çöktürmek için neden olur ve daha az yoğun bir mononükleer hücre tabakası, yukarıda oluşturacaktır. Periferik kan 2 mi cevap verecek sonra yaklaşık 0.5 x 10 ⁶ naif CD4 ⁺ T hücrelerinin hale getirecekadımlar.
2. Resim arası 21 ° C (30 mm ayarlanmış bir açıyla yuvarlak tabanlı borular için kullanımı rotor) 250 x g'de santrifüjleyin 30 dakika periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) gradyanı üretir. Santrifüj işleminden sonra PBMC'ler açık beyaz bir halka olarak gözlemlenebilir. bir pipet PBMC'lerin toplamak ve yıkama için steril bir tüpe transfer.
3. 10 dakika boyunca 250 x g'de PBS-EDTA çözeltisi ile üç yıkamadan sonra, saf CD4 ⁺ T hücrelerinin saflaştırılması geçin. Sıralama metodları veya saflaştırma kitleri çeşitli tipleri bu amaçla kullanılabilir. Tercihen, saflaştırma için> 1 x 10 ⁷ PBMC'ler kullanın.
   1. Manyetik boncuklar ile negatif seleksiyon tarafından naif CD4 ⁺ T hücreleri arındırmak. Anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR ve CD235a (glikoforin A) antikorları ile negatif seçim gerçekleştirin. f ile CD4 + CD45RA + hücrelerinin belirlenmesi ile saflık yüzdesi değerlendirilmesiDüşük sitometri.
      Not: İsteğe bağlı olarak, bir gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 monosit yapışmasını teşvik etmek ve naif CD4 ⁺ T hücresi saflaştırılmadan devam etmek için takviye edilen ortam, 10 ml, 1 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir yoğunluğa sahip CO ₂ PBMC'lerin inkübasyonundan geçin. Periferik kandan naif CD4 ⁺ T hücrelerinin etkili bir şekilde geri ölçüde saflaştırma sistemine bağlıdır.
4. 5 ug / ml anti CD3 monoklonal antikor ile PBS göz başına 250 ul ilave edilerek 24-iyi hücre kültür plakaları hazırlayın ve 37 ° C'de en az 2 saat süreyle inkübe edin.
   Not: 96 kuyucuklu levhalar kullanılabilir naif CD4 ⁺ T hücrelerinden daha az sayıda kullanıldığında (örneğin, 2 x 10 -1 x 10 ^{5 4).}
5. 24 de ya da 96 gözlü levhalar anti CD3 antikoru seyreltme çıkarın ve iki kez steril 1 x PBS kullanarak plakaları yıkayın.
6. + Saflık>% 95 ile naif CD4 ⁺ T hücreleri (CD4 sulandırmakFetal sığır serumu% 3 ile takviye edilmiş, gelişmiş RPMI 1640 ortamı içinde 1 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir yoğunluğa CD45RA +) (veya RPMI serumu% 10), 2 mM glutamin ve antibiyotikler (1 U / ml penisilin, 1 ile desteklenmiş ug / ml streptomisin).
   Not: Gangliozidleri yerelleştirme ölçülerek gerekiyorsa aşağıda tarif edildiği gibi, seyreltme ve uyarılması için aynı protokolü uygulayın.
7. Anti CD3 kaplı oyuklara 24 plaka olmayan kaplı oyuklara (kontrol hücreleri) hücre seyreltme 500 ul ekle. Seçenek olarak ise, 96 gözlü bir levhanın gözleri hücre seyreltme 100 ul ilave edin.
8. Anti CD28 antikoru 1 ug / ml ekleyerek, anti CD3 kaplı kuyucuklara naif CD4 ⁺ T hücrelerinin uyarılması koşulları doldurun.
9. Anti CD28 antikorlarının ilavesi olmadan olmayan kaplanmış kuyucuklara kontrol olarak dinlenme CD4 ⁺ T hücreleri tutun. 37 ° 'lik standart koşullar altında 72 saat için 0 dinlenme ve aktive CD4 ⁺ T hücresi inkübeC ve% 5 _CO2.
10. 37 ° C'de inkübe naif CD4 ⁺ T hücreleri olarak CD69 erken aktivasyon işaretleme (16 saat sonra aktivasyon) ya da CD25 geç aktivasyon işaretleme (48 saat sonra etkinleştirme) ekspresyonu akış sitometresi ile değerlendirilmesi ve aktive edilmiş uygun bir aktivasyon kontrol etmek için ve% 5 yokluğunda veya anti CD3 / CD28 antikorları ^9,10 mevcudiyetinde _CO2.

2. İstirahat ve bağlılık Olmadan Naif CD4 ⁺ T hücreleri

1. en az 15 dakika süre ile otoklavlama ve UV ışığı maruz bırakılarak 12 mm yuvarlak lamelleri sterilize edin.
2. Steril 24 oyuklu hücre kültür plakalarında yer lamelleri.
   Not: 1'den daha x 10 ⁵ hücre olan kültürler için, lamel hücre kaybını önlemek üzere uyarlanmış küçük kuyu slayt odaları kullanılması tercih edilir.
3. Kat lamelleri poli-L-lisin, 200 ul (veya sürgülü bölmesi) (MA 150-300 kDa),% 0.1 (ağırlık / hacim) çözeltisi ve r, 5 dakika boyunca inkübeoom sıcaklığında (RT), oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca çıkarın ve kurutulur.
4. Dikkatli bir şekilde karıştırın ve 24 oyuklu plakalar istirahat ve aktif naif CD4 ⁺ T hücreleri toplamak. Hücre sayımı ve gerekirse poli-L-lizin kaplı kapak 1 x 10 ⁵ hücre transferi taze desteklenen ortamda ile ayarlayın. 37 ^o C'de 6 saat minimum ve% 5 CO ₂ hücreleri inkübe.

3. Naif CD4 ⁺ T Hücreleri Toplama ve İstirahat Fiksasyon Olmadan

1. Dikkatle kültürlü dinlenme ve aktif naif CD4 ⁺ T hücrelerinde bulunan ortamı çıkarın.
2. RT steril PBS'nin 500 ul yavaş yavaş yapın.
   Not: kuyu çözümleri dikkatli toplama ve çıkarma lamel hücreleri çıkmasını engeller.
3. PBS atın ve iyice kültür ortamı çıkarmak için başka bir 500 ul PBS ekleyin.
4. 500 ul süzüldü% 4 paraformaldehid ilave (filt hücreleri saptamakrasyon mikroskopi analizi ile müdahale) ve (tercih edilen) veya gece boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir olabilir mikro kaldırır.
   Dikkat: Paraformaldehit toksik ve uçucu bir bileşiktir. Bir insan kanserojen olduğu bilinmektedir. Uygun bir güvenlik protokolü ile dikkatlice kullanın.
5. Fiksatif çıkarın ve oda sıcaklığında PBS ile en az iki kez yıkayın.
6. bir sonraki adıma devam veya boyama kadar birkaç gün 4 ° C'de 500 ul PBS ile plaka kuyuları korumak.
   Not: Bu işlem sırasında Sterilite mikroorganizma büyümesini önlemeye yardımcı olur.

4. Boyama, Konfokal Mikroskopi Montaj ve Görselleştirme

1. kuyulardan PBS kaldırmak. Soğuk bloke edici tampon 500 ul ekle (1X PBS,% 0.5 Standart kalite sığır serum albümini,% 1 fetal inek serumu, pH 7.4) eklenmiştir. Buz üzerinde 20 dakika süreyle inkübe edin.
2. dikkatlice engelleme tamponu çıkarın ve primer antikorlar ekleyin (anti GD3 klon R24, GD2 klon 14G2a),PE-konjuge anti CD25 ve APC-konjuge anti TCR ve 2.5 ug / ml bloklama tamponu içerisinde seyreltilmiş kontrol izotipleri.
3. Buz üzerinde 2 saat veya gece boyunca 4 ° C inkübe edin.
   Not: Yavaş yörünge ajitasyon tercih edilir.
4. dikkatlice antikor çıkarın ve PBS yavaşça 500 ul ekleyin. İki kez tekrarlayın.
5. İkincil antikorlar 0.1 ug / ml bloklama tamponu içinde seyreltilmiş (R24, anti GD3, Alexa Fluor 14G2a karşı GD2 488-konjuge veya Alexa Fluor 647-bağlı anti IgG2a için FITC ile birleşik anti-IgG3) ekleyin.
6. çalkalamadan karanlıkta buz üzerinde 1 saat süreyle inkübe edin.
7. 4.4'de tarif edildiği gibi) PBS içinde üç kez yıkanır. Örneklerin dehidratasyon önlemek için yeterli PBS ile tutun.
8. 0.1 ug / ml, PBS içinde seyreltilmiş Hoechst 333.258 leke ekleyin.
9. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ve çıkarın. PBS içinde üç kez yıkanır.
10. bir kağıt havlu üzerinde slaytlar yerleştirin ve montaj çözeltisi (PBS içinde% 50 gliserol) veya ticari monte çözeltisinin 20 uls solma ve numunelerden söndürme önlemek için.
11. Dikkatlice ince cımbız ile lamel pick up ve montaj çözümü üzerine yerleştirin. Hücreler bağlandıkları lamel yan çözeltisi ile temas içinde olduğundan emin olun. oje ile lamelleri Seal ve floresan veya konfokal mikroskopi kullanılarak analiz.

RNA izolasyonu 5.

1. Anti CD3 antikoru (5 ug / ml) kaplı 96 oyuklu plakalar hazırlamak. Uyaran tamamlamak için 4 x 10 ⁴ naif CD4 ⁺ T hücre / oyuk anti CD28 antikoru (1 ug / ml) ile takviyeli kültür ortamında 100 ul inkübe edin. 0 ila 72 saat boyunca _CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5.
2. Farklı sonrası aktivasyon süreleri sonra bir mikrosantrifüj tüp içine hücreleri yerleştirin.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'de 500 ul PBS ve santrifüj ekleyin.
4. Süpernatantı ve 1 ml Trizol reaktifi ekleyin.
5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin ve en örnek devam -8076, en az 24 saat bekletilmiştir. gerektiğinde RNA izolasyonu ile devam edin.
   Not: en az 24 saat boyunca -80 ° C'de örnek bırakılması RNA verimini geliştirir. Ayrıca, el eldiven kullanımı RNases RNA bozulmasını önlemek için gereklidir.
6. Bir su banyosu içinde 2 dakika için 37 ° C'de inkübe edilerek örnek Defrost.
7. 200 ul kloroform ilave edin ve 30 sn (vorteks RNA agresif karışmasını önlemek için) boyunca elle kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
8. 4 ° C'de 12,000 x g'de santrifüjleyin 15 dakika.
9. Yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine, sulu faz yeniden elde.
10. 500 ul izopropanol ekleyin ve tüpü üç kez ters çevirin.
11. 4 ° C'de 12,000 x g'de 10 dakika süre ile 10 dakika oda sıcaklığında ve santrifüj inkübe edin.
12. tersine çevirerek süpernatant atın.
13. 4 ° C'de 12,000 x g'de buz soğukluğundaki% 75 etanol ve santrifüj 10 dakika için 1 ml ilave edilir.
14. Tamamen süpernatantı atmak ve açık tüpün kapağını bırakarak RNA pelet kurulayın.
    Değile: Bu noktada pelet açıkça görülebilir değildir. Yine de devam edin.
15. moleküler sınıf eden 20 ul pelletini. Nanodrop kullanılarak 260 nm ve 280 nm absorbans ölçümü ile konsantrasyon ve nükleik asitlerin saflık hesaplayın.
16. alışılmış herhangi bir ters transkriptaz kiti kullanılarak ve imalatçının protokolü izlenerek cDNA sentezi için dikkatli bir şekilde devam ediniz.
    Not: Yaklaşık 0.5-2 ug RNA, 4 x 10 ⁴ naif CD4 ⁺ T hücrelerinden elde edilir. cDNA, RNA, 100 ng sentezlenmiş ve düşük RNA giriş kitleri gerek kalmadan, gerçek zamanlı PCR reaksiyonlarında kullanılabilir.

Sonuçlar

Bu yazıda anlatılan protokol kültürlü kaliteli ve yapıştırılır dinlenme ve aktif insan naif CD4 ⁺ T hücreleri (Şekil 1) işler. Aktive edilmiş CD4 ⁺ T hücreleri durumda (Şekil 1A) kıyasla karakteristik bir proliferatif profil (Şekil 1B) göstermektedir. CD25 Geç aktivasyon işaretleme konfokal mikroskopi (Şekil 1C) tarafından gözlemlenen 72 saatte etkin aktivasyonunu değerlendi...

Tartışmalar

Açıklanan ^protokol, CD4 ⁺ T hücreleri ya da küçük bir hücre sayısı başlayarak, diğer bağışıklık hücreleri (örneğin, ekspresyonu analiz edilmiştir, Şekil 5) hücre süspansiyonlarında gangliosidler veya protein lokalize etmek için de kullanılabilir. Çünkü T hücreleri ve yapışmaz özellikleri küçük boyutu, kötü bilgi veya düşük kalitede floresan mikroskobik görüntüleri sonuçların elde edilmesi hücreleri doğru yapıştırılır de?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7