Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Özet

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Özet

Akciğer, karaciğer ve kemik gibi ikincil sitelere Metastaz yaklaşık 90% ¹ mortalite oranı travmatik bir olaydır. Bu sitelerin, akciğer nedeniyle vücudun hassas doğası ve uygun fizyolojisi sürdürülmesinde hayati rol içindeki kapalı konumuna intravital optik görüntüleme kullanarak değerlendirmek en zor olandır. Klinik yöntemler (pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve bilgisayarlı tomografi (BT)) bu doku noninvaziv görüntülerini sağlayabilen olsa da, tek bir piksel ile en erken ekim olayları görselleştirmek için gerekli çözünürlük, eksikliği yaklaşık bin hücrelerinden oluşan. Sadece bir tümör hücresinin geldikten sonra olaylar hayatta kalma ve daha sonraki büyüme için deterministik olan metastatik akciğer tohumlama postülanın Güncel modelleri. Bu tek hücreli çözünürlükte ² ile gerçek zamanlı intravital görüntüleme araçları tohumlama cel fenotipleri tanımlamak için gerekli olduğu anlamına gelirls bu modelleri test ve. Akciğer yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme çeşitli eks vivo preparatlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir birlikte, bu deneyler, tipik haliyle tek bir zaman noktası deneyler ve (nedeniyle önemli ölçüde değişmiş ortam sıcaklığı, bolluğu, sitokinler, vb eşya ve olası hatalı sonuçlara duyarlı ) göğüs boşluğuna ve dolaşım sistemi ³ çıkarıldıktan kaynaklanan. Son çalışmalar bir vakum ancak görüntüleme penceresi ^2,4,5 stabilize kullanarak mümkün sağlam akciğerin o zaman atlamalı intravital optik görüntüleme olduğunu göstermiştir, tipik görüntüleme süreleri yaklaşık 6 saat ile sınırlı kalmıştır. Burada 12 saatlik bir süre boyunca böyle bir pencere kullanılarak akciğer uzun süreli intravital zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol açıklar. Bu yöntem kullanılarak elde edilen zaman atlama görüntü sıralarını akciğer görselleştirme ve hücre-hücre etkileşimleri kantitatif membran dinamikleri ve vasküler perfüzyon sağlar. Biz daha dAkciğer mikrovasküler emsalsiz net bir görünüm verir bir görüntü işleme tekniği Escribe.

Giriş

Yüksek çözünürlüklü intravital optik görüntüleme tek hücreli ve alt-hücresel parametreler ölçülmüş ve sayısal olarak izin birçok biyolojik süreçleri anlamak için çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. Kanser araştırmalarında, tümör stromal hücrelerin intravital görüntüleme hayvanda sadece mevcut bir çok mikro-çevresel etkileşimleri ^6-11 keşfine yol açmıştır.

In vivo tek bir hücre çözünürlüğü, optik görüntüleme kullanılarak göğüs kanserinde intravasation ve tümör hücrelerinin yayılması ile bağlantılı mikroçevrelerde keşiflerine da prognoz ve göğüs kanseri hastalarında ^12-16 tedaviye yanıt için yeni işaretleri yol açmıştır. bozulmamış iç hayati organlara içinde derin görüntülemek için mevcut en iyi görüntüleme teknolojileri tüm organ mükemmel manzarasına sahiptir ve klinik belirti bile önce patolojileri ortaya çıkarabilir klinik yöntemler (MRI, PET CT) 'dir. Bunlar edemiyoruz, however nedeniyle tek bir hücre çözünürlükte onların eksikliği tümör ilerlemesini sürüş metastaz erken aşamaları ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için. Zamanla akciğer metastazı bu modaliteleri görünür, onlar iyi kurulmuş ve artıyor. Onlar çok daha erken, daha önce geliş ve hayatta kalma erken adımları görüntüleme, ¹⁹ beklenenden daha gelmesi yaygın tümör akciğere ulaşması ya ¹⁷ hayatta olmayan veya başlangıçta atıl ¹⁸ kalır hücreleri ve gözlem% 90 için çok önemli hale gelmesi tahmini göz önüne alındığında uzak bölgelerde metastatik tohumlama ve tümör büyümesinin nüks süreci anlamak.

Akciğerde bu gözlemleri Sahne ancak son derece zor olduğu kanıtlanmıştır; görüntüleme çalışmalarının büyük çoğunluğu yalnızca tek zaman noktalarında akciğer içine bir görünüm vermek ex vivo veya eksplant hazırlıkları ^20-23 kullanmışlardır. Bu hazırlıklar yararlı bilgiler sağlamakla birlikteım, onlar mikroçevresinin çeşitli bileşenleri arasında meydana gelen etkileşimlere, sebep-sonuç ilişkileri ve dinamikleri tam bir anlayış vermeyin. Uygun bir dolaşım sistemi (ve homeostasis eşlik eden dengesizlik) ve vücudun bağışıklık sisteminin geri kalanından kesilmesi eksikliği arzulu bu hazırlıkların in vivo sağlam dokuda oluşturmak sonuçlara doğrulamak için yapar.

Birçok grup Wearn ve Alman plevra tabakası ²⁴ açığa cerrahi olarak ilk ve Terry implante edilebilir görüntüleme penceresi ²⁵ kullanan ilk olmak sağlam akciğer ^2,4,5,24-33 intravital görüntüleme gerçekleştirdik.

Akciğerde Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ölçüde akciğer sürekli hareket tarafından engellenmektedir ve çeşitli teknikler bu sınırlamayı aşmak için geliştirilmiştir. Wagner ve Filley ²⁷ köpek akciğer doğal hareket okuduve Wagner doku ²⁸ hareketsiz onun pencere cerrahi hazırlık vakum kullanılan iken nispeten sabit bölge üzerindeki implante pencereyi bulmak için cerrahi protokol tasarlanmış. Bronş sıkıştırma, sıralı apne ve kapı görüntüleme, örneklemeyi edinimi, akciğer lobu ve vakum ³⁴ yapışması: O zamandan beri, çeşitli teknikler görüntüsüne dahil akciğer faydalanılmıştır. Bunların her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve hiç kimse teknik başka ^34'e kadar üstün ortaya çıkmıştır. Örneğin, bronş sıkma ve ardışık apne akciğer gazların normal alışverişini değiştirebilir ve atelektazi neden olabilir. Geçitli görüntüleme ve oversampled edinimi bu dezavantajları muzdarip ama yüksek hızda veya özel görüntüleme cihazları yaygın olarak erişilebilir değil gerekmez. Sonunda akciğer hem yapıştırma ve vakum tekniği yukarıda belirtilen sakıncaları hem önlemek, ancak bakım tak değilse kesme kuvveti kaynaklı yaralanma görülebiliren. Son yıllarda, vakum penceresi minyatürize edilmiş ve konfokal ve multiphoton mikroskopi ^4,5,33 ve mükemmel yüksek çözünürlüklü görüntü kullanılarak farelerde kullanılmak üzere adapte elde edilmiştir ^2. Tablo 1, bu zengin geçmişini özetleyen ve yeni tarif o kağıtları özeti intravital akciğer görüntüleme pencereleri kullanımında gelişmeler.

Bu protokol mümkün olan en yüksek hücre içi çözünürlük ile canlı, sağlam akciğer görüntü metastaz genişletilmiş time-lapse multiphoton intravital mikroskopi kullanımını tarif etmektedir. Görüntüler yüksek sayısal açıklık objektif lens ve çoklu photomultiplier tüp (PMT) dedektörleri ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak en fazla 12 saat boyunca elde edilir. Transgenik fare modelleri flüoresan yüksek molekül ağırlıklı dekstran ve floresan protein transfekte edilmiş tümör hücreleri (damar ve tümör hücreleri respectivel etiket ile floresan etiket yerel makrofajlara kullanılırY). floresan etiketli hücrelerin bu seçim tümör hücre endotelyal hücre-makrofaj etkileşimleri ve dinamikleri görselleştirme sağlar iken, bu protokol floresan veya floresan olmayan fare herhangi suşu için çalışacaktır. Kazanılmasından sonra, artık sürüklenme hareketi (varsa) etiketsiz dolaşan kan hücrelerinin neden yanıp sönen ortadan kaldırmak için ^35,36 ve özel makrolar zaman ortalama damar kanalı eklentisi Fiji kullanılarak elimine edilir.

Bu protokol, görüntüleme metastaz odaklanırken, teknikler akciğer yüksek çözünürlüklü tek hücreli bir görüntüleme ile gözlemlenebilir diğer biyolojik süreçlerde uygulanabilir.

Protokol

Bu protokol açıklanan tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Albert Einstein College of tarafından önceden onay da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır.

1. Yaratma floresan etiketli Fare Modeli ve Tümör Hücreleri

1. PBS, 100 ml BSA 0.1 g karıştırılarak% 0.1 (a / h) inek serumu albümini / fosfat tamponlu tuzlu su (BSA / PBS) tamponu 100 ml hazırlayın.
2. dengeli transfeksiyon floresan işaretli tümör hücrelerinin hazırlanması.
   NOT: Burada E0771-LG hücreleri damardan ebeveyn E0771 hücreleri ³⁸ ile enjekte C57BL / 6 fare akciğer geliştirilen metastatik tümörler izole edildi E0771 fare meme adenokarsinoma hücreleri ³⁷ derece metastatik türevi kullanın.
   1. Transfeksiyondan 24 saat önce, levha 1 x 10 Antibiyotik, 2 ml bir 60 mm doku kültürü tabağına ⁵ EO771-LG hücreleritlc bilgilerini% 10 FBS (fetal inek serumu) DMEM (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) ve 37 ° C 'de inkübe etmek ve% 5 _CO2.
   2. Transfeksiyon zamanda, düşük serum ortamında 190 ul ilave edilmeden önce 30 dakika boyunca transfeksiyon reaktifi 10 ul floresan protein vektörünün 2 ug inkübe edin.
   3. Yıkama EO771-LG Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su (D-PBS) ile hücreler bir kez yavaşça transfeksiyon karışımı ekleyin.
   4. 6 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe edin.
   5. 2 gün bitmiş DMEM, 2 ml (% 10 FBS, 1 mM piruvat, 100 U / ml penisilin / ml streptomisin, 100 ug) transfekte hücreler ve kültür yıkanır.
   6. Steril PBS ve 2 ml hücreleri yıkayın% 0.25 tripsin-EDTA, 500 ul ve 37 ° C'de 2 dakika boyunca inkübe edin.
   7. hücre süspansiyonu toplayın ve tam DMEM en az 1 hacmi ile karıştırın ve 280 x g aşağı doğru döndürün.
   8. tam DMEM 1 ml hücrelerin tekrar ve içine hücre kültürü genişletmek10 cm doku kültürü çanak.
   9. her üç günde bir ortam değiştirme bir hafta bitmiş DMEM ve kültür 8 ml G418 seçici antibiyotiği 700 ug / ml ekleyerek transfekte edilmiş hücrelerin seçimi başlatın.
3. Floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) ^39,40 ile G418 içinde seçimi altında olmuştur transfekte edilmiş hücrelerin flüoresan nüfus zenginleştirmektedir.
   1. 5 ml PBS ile hücreleri yıkanır ve 1.5 ml% 0.25 tripsin ekleyin.
   2. 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin ve tam DMEM en az bir hacim ile karıştırın.
   3. hücre süspansiyonu toplayın ve 280 xg'de aşağı spin ve steril% 0.1 1 mL (w / v) BSA / PBS tampon hücreleri yeniden askıya.
   4. 40 mikron örgü ile hücre süspansiyonu Filtre ve sıralama için% 0.1 BSA / PBS tamponu ile 1 ml ses seviyesini ayarlamak.
   5. FACS sıralayıcı ⁴¹ kullanılarak floresan spektrum göre% 10 parlak nüfus FACS-sıralayın.
   6. bir hafta u Kültür sıralanmış hücrelernder seçimi (komple DMEM 700 ug / ml G418).
   7. sitometrisi kez daha adımları 1.3.6 1.3.1 tekrarlayarak akışı ile floresan işaretli hücrelerin yeniden seçin.
   8. (Adım 1.3.1-1.3.4) tarif edildiği gibi bir seçim, trypsinize, filtre ve bir ikinci tur sonra% 0.1 BSA / PBS içinde hücrelerin yeniden askıya. FACS ayırıcıyla 96 gözlü plakalara ayırma tek bir hücre için 2 x 10 ⁶ hücre / ml konsantrasyon ayarlayın.
   9. toplanması için tam DMEM 100 ul 3-5 96 oyuklu plakalar hazırlamak. , Sıraladıktan sonra hayatta kalma geliştirmek EO771-LG hücreleri ⁴² yetiştirilmiştir yemekler süzülmüş kültür ortamının 100 ul ekleyin.
   10. 96 gözlü plakalara hücreleri sıraladıktan sonra, 2 gün boyunca kültür hücreleri dönüş (37 ° C,% 5 _CO2).
   11. 5x büyütme tersine bir mikroskop altında incelenmesi ile olarak tek klonlar ile kuyu tanımlar.
   12. Trypsinize ve yaşayabilir klonlar genişletmek ve yedekleme için hücreleri dondurma.
       1. gr ile kuyu yıkayınsteril PBS 100 ul klonlar sayesinde. h tripsin / ağ% 0.25 50 ul ilave edin ve 37 ° C'de 2 dakika kuluçkalayın. bitmiş DMEM, 50 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca 280 x g'de döndürülür ve steril bir V-tabanlı ya da yuvarlak tabanlı 96 oyuklu plakaya transfer.
       2. Süspanse 700 ug / ml G418 tam DMEM 100 ul hücre 12 oyuklu plakalarda her klon plaka. akana kadar G418 ve kültürü ile tam DMEM 400 ul ekleyin.
       3. , 500 ul PBS ile kuyu yıkayın% 0.25 tripsin, 100 ul ve 37 ° C'de 2 dakika kuluçkalayın. tam DMEM 100 ul ekleyin ve 280 x g'de 5 dakika aşağı doğru döndürün. birbirine karışana kadar 6 kuyulu plakalarda, G418 ve plaka hücrelerle tam DMEM 100 ul hücrelerin tekrar.
       4. birleşmiş kez trypsinize hücreler, aşağı spin ve FBS% 10 DMSO içinde tekrar süspansiyon hücre stokları dondurmak için.
       5. metastatik potansiyelin değerlendirilmesi için 100 mm doku kültürü çanakları içinde onları kaplama ile kültür içinde hücre süspansiyonları 1/10 tutun.
4. Seçilen klonların metastatik potansiyelini test.
   1. Tripsinize ve 2,5 ml x 10 ⁶ hücre / lik bir konsantrasyon tuz içinde hücrelerin yeniden askıya ve kuyruk damarı yoluyla damardan C57BL / 6 farelerine 200 ul enjekte edilir.
   2. Daha önce ²³ açıklandığı gibi 2 hafta sonra, akciğer dokusu toplamak ve yüzey sayısı veya stereolojik yöntemle ⁴³ ile tümör yükünü ölçmek. Intravital görüntüleme için yüksek metastaz potansiyeline sahip klonlar seçin.
5. MacBlue muhabiri fareler ⁴⁴ (mavi floresan proteini (OBP) ifadesini (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP ¹⁶⁾ sürüş miyeloid spesifik promotör) kaldırın.
   NOT: Genellikle, 8 ve 12 hafta arasında fareler kullanılır, ancak erken 7 olarak ve olabildiğince geç 20 kadar hafta da çalışmak için test edilmiştir fareler.

2. multiphoton Mikroskop Seti yukarı ve Görüntüleme Hazırlık

NOT: Bu protokol, her m gerçekleştirilebilir birlikteultiphoton mikroskop, bu protokolde gösterilen veri elde etmek için kullanılan sistem detaylı ⁴⁵ daha önce tarif edilmiştir.

1. iki foton lazerler ve en az bir saat öncesinde istenen görüntüleme süresi dedektörler de dahil olmak üzere tüm mikroskop ve lazer bileşenleri açın.
2. okunur ameliyattan hemen önce, hemen mikroskop önce ışın yolu optik güç ölçer başkanı yerleştirerek mikroskop ışık girdi gücünü ölçmek ve 880 nm maksimum ışık yoğunluğu kadar lazer uç boşluğu ayna düğmeleri ayarlamak optik güç metre.

3. Vakum Sistemi kurma

1. Siyanoakrilat ile görüntüleme penceresi (Company Şekil 1) içine lamel Tutkal. Tamamen kuru yapıştırıcı için en az 4 saat bırakın.
   NOT: Bu adım, vaktinden önce gerçekleştirilmelidir.
2. küçük açıklıktan ilk satırında 100 ul pipet kesin ve ince v kesilmemiş ucunuacuum hortumu.
3. Şekil 1 ve Ek Şekil 2'ye göre yeni bir elektrik bağlantı sistemi.
4. üzerinde vakum ve bloke açık uçlu, <3 inHg için vakum regülatörü ayarlayın.
   Not: vakum seviyesinde son ayarı, in vivo olarak damar gözlemlenerek yapılacaktır.
5. görüntüleme plakası ile uzak wicked olmaktan objektif lens daldırma ortamı önlemek için görüntüleme plakanın alt petrol gres ince bir tabaka sürün.
6. Mikroskop sahnede görüntüleme plaka koyun.
   NOT: Özel görüntüleme plakası (Company Şekil 3) 1/8 bir sayfadır "kalın alüminyum hem de sahne eklemek alana sığacak ve görüntüleme penceresini tutmak için merkezi bir delik ile karşı işlenmiş.
7. aşağı lamel ile görüntüleme plakasına vakum penceresini yerleştirin.
8. Sterilize tüm yüzeyleri ve aletleri görüntüleme sahne plakası dahil ve görüntüleme kazanmak% 70 etanol ile Dow.
9. Vakum penceresine pipet kesilen ucunu ve görüntüleme plakasına hortum aşağı bantlayın.
10. görüntüleme penceresine objektif yakın getirin ve objektif ve lamel arasındaki su büyük damla yerleştirin.
11. Vakum penceresinin merkez açılmasını engelliyor ve objektif ve lamel arasındaki su damlası aspire almaz doğrulayarak lamel hiçbir sızıntı olmadığından emin olun.
    NOT: penceresinin üzerine yerleştirilen bir eski stil bilgisayar faresi top merkezi açılmasını engelliyor için yararlıdır.

4. Cerrahi

1. Steril cerrahi zemin hazırlayın.
   1. kolayca ulaşılabilecek tüm enstrümanları yerleştirin. Cerrahi alan ve% 70 etanol ile cerrahi aletler dahil tüm yüzeyleri ve aletleri sterilize edin.
2. Bir çift düğüm ile burç üzerinde, kateter ¼ inç 2-0 sütür 3 inç uzunluğunda kravat.
3. Kuyruk ven kateter fol hazırlayınHarney ark. ⁴⁶ tarafından yayınlanan protokolü lowing.
4. ~ 5 dakika sonra kuyruk damarından kan akımını arttırmak için kateter yardımı için bir enfraruj (IR) bir ısı lambası kullanılarak kafesine hayvan ısıtın. Bir ısı lambası veya bir ısınma pad kullanarak cerrahi prosedür boyunca fizyolojik sıcaklıklarda ısıtılan hayvan tutmak için tavsiye edilir.
5. % 5 izofluran ile hayvan anestezisi ve bir ayak tutam yanıt olduğunu doğrulayın.
6. hayvanın gözleri oftalmik merhem sürün.
7. hayvanın sol kanattan gelen saç kaldırmak için 10-30 saniye tüy dökücü losyonu uygulayın; arka ¼ için göğüs orta hat ve sadece göğüs kafesi altında aksilladan.
8. herhangi bir aşırı losyon temizleyin ve% 70 alkol ile maruz kalan deri sterilize edin.
9. Kuyruk veni kateteri için PBS ile doldurulmuş steril bir şırınga takın ve Harney et at tarafından yayınlanmıştır protokol izlenerek yerine yerleştirin ve bant. ^46. bantla sıkıca iğne kendisine yapıştırılır ve kuyruk ve bant arasındaki boşlukta serbest değildir emin olun.
10. Das et al. ⁴⁷ veya DuPage ve arkadaşları tarafından yayınlanan protokolünü takip etmek için fare entübe. ⁴⁸
11. ventilatör açın ve min başına 135 nefes ve izofluran-oksijen karışımının 200 ul tedarik ayarlayın.
12. ventilatöre trakeal kateter bağlayın.
13. Cerrahi alana fareyi hareket ettirin. Kateter çıkarmak için değil aşırı özen gösterin.
14. Ön dişlerin altında fare burun etrafında 2-0 dikiş kravat.
15. burnu kateteri bantlayın.
16. Cerrahi alanın dışında tutmak için kateter sol ön ayakları bantlayın.
17. % 2.5 bakım seviyesine izofluran anestezisi indirin ve bir ayak tutam yanıt olduğunu doğrulayın.
18. Keskin bir makas kullanarak, sol göğüs duvarı üzerinde derinin 1 cm ² çıkarın.
19. Kaldırma tO yağ yastığı meme ve koter kalemle açıkta kan damarları dağlamak.
20. keskin bir makas ile keserek yağ yastığı rezeke.
21. keskin bir makas ile keserek göğüs kafesi kas tabakası aşağı kaldırın. ön ayakları dibinde aksiller ven çalışan kesmemeye özen gösterin.
22. Yakala ve ^6. kaburga kaldırmak için forseps kullanabilir. sığ bir açıda keskin bir makas kullanarak (~ 5 °) deride açılma kenarına yakın kaburga kesti. maruz akciğer dokusunun dokunmamaya aşırı özen gösterin.
23. Arka arkaya dört kaburga kaldırarak tüm akciğer lobun maruz göğüs duvarından açıklığı genişletmek.
    Not: kalbi önlemek için sternum en az 5 mm uzakta açılış tutun.
24. Dikkatle kuyruk ve trakeal kateter tutarak fareyi kaldırın ve mikroskop görüntüleme aşamasına fareyi hareket ettirin.
25. Vakum off ile PBS ile vakum pencerenin odasını doldurun.
26. fareyi ters çevirin ve maruz pozisyonVakum görüntüleme penceresi üzerine akciğer.
27. Yavaş yavaş küresel vanası kullanılarak cıva yaklaşık 3-5 inç vakum açın.
28. Yan Şekil 2'de gösterilen aşamada plaka fare ve bandın göğüs iki kez ikiye katlanmış dokuma kağıdından yapılmış bir yasaklama demetini yerleştirin.
29. Hayvanın üst uyluk pulse oksimetre uyluk sensörünü Klip ve yazılımını başlatın.
30. Sahnede çevre odasına yerleştirin ve fizyolojik bir sıcaklıkta fare tutmak için ısı açmak.
31. anestezi korumak ve kan akışını korumak için 1-1.5% izofluran düzeyini azaltır.

5. Intravital Görüntüleme

1. lamel yakın 25 x 0.95 Sayısal açıklık (NA) objektif lens getirmek ve aralarındaki su büyük damla ekleyin.
2. Epifloresans modunu kullanarak, FITC kanalı görüntüleyebilir ve odak noktası haline akciğer dokusunun getirmek.
3. ameliyat öncesi yapılan değilse, benKuyruk veni kateteri vasıtasıyla nject tümör hücreleri.
   1. Kuyruk ven kateter PBS şırınga ayırın.
   2. Tümör hücresi süspansiyonu (PBS en fazla 2 x 10 ⁷ hücre / ml) 100 ul steril bir şırınga yerleştirin.
      NOT: Bu adım farklı zaman noktalarında akciğer kanser hücresi varış incelemek için önceden yapılabilir.
   3. Kuyruk ven kateter üzerine tümör hücreleri ile şırınga bağlayın.
   4. Yavaş yavaş kuyruk damar içine tümör hücrelerini enjekte edilir.
   5. Kuyruk ven kateter tümör hücreleri şırınga ayırın.
   6. Kuyruk ven kateteri PBS şırınga bağlayın.
      NOT: enjeksiyonundan sonra oküler üzerinden dekstran sinyalden tümör hücrelerini ayırt etmek zorlaşır olarak dekstran enjekte etmeden önce tümör hücrelerinin tüm yerleri belirleyin.
4. görüntü tümör hücrelerinin bulun
   1. Bireysel tümör hücrelerini görüntülenmesi için, tüm tümör hücrelerini bulmak ve inci ile konumlarını kayıtYazılımın e çoklu paneli.
      1. mikroskop oküler tümör hücrelerini gözlemleyerek görüntünün bakış tüm alanları bulun.
      2. Yazılımda, Multi-Nokta butonuna tıklayarak çoklu paneline geçiş ve Add pozisyonu butonuna tıklayarak hücrenin konumunu saklamak.
   2. mozaik görüntüleme için, mozaik kaynağını bulmak ve görüntüleme koordinatlarını ayarlamak
      1. yapının sol üst köşesinde bir pozisyon bulmak Çekilecek.
      2. sahne denetleyicisi "Sıfır" düğmesine basarak sahneye Sıfır x, y ve z koordinatlarını.
      3. "Load" butonuna tıklayıp listeyi seçerek mozaik koordinatların uygun listesini yükleyin.
         NOT: görünümünün 500 mikron alanının% 20 örtüşme ile 2 x 2 mozaik için bir örnek liste olur: Poz.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Poz. 3 = (0400), Poz. 4 = (400.400).
5. şırıngayı w kaldırve kuyruk ven kateteri PBS i dekstran içeren şırınga ile değiştirin.
6. Yavaş yavaş çizgiyi temizlemek için steril PBS 50 ul enjekte ardından 20 mg kuyruk ven kateter yoluyla fare içine PBS içinde çözünmüş / ml 155 kDa rodamin-dekstran 100 ul kadar enjekte edilir. hattına herhangi bir kabarcıkları tanıtmak etmeyin. fareye uygulanan toplam hacmi 4 ml / kg / saat aşmayacak şekilde gerektiğinde dekstran kanseri hücre enjeksiyonundan sonra en az bir saat enjekte edilir.
7. görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
   1. multiphoton moduna mikroskop geçin.
   2. Zamanlama Sinyaller düğmesini tıklayarak ve Zoom Faktörü alanını güncelleyerek 2X faktöre zoom ayarlayın.
   3. Lazer gücü ayarlamak için ~% 10 (~ numune 10-15 mW) 10 Tsunami Güç kaydırıcısını ayarlayarak sonra Dedektörler ve Lazer düğmesini tıklayarak ve.
8. Resim Her bir yer tümör hücrelerinin varlığını tespit etmek ve vascu akışını ve bütünlüğünü görselleştirmeklature.
   NOT: Gemiler tamamen akan eritrositler ile perfüze görünmelidir ve floresan dekstran ekstravasküler alanlara sızıntı olmadan gemilerin içinde bulunan edilmelidir. Yaklaşık 10-20 tümör hücreleri vakum penceresinin açık diyafram içinde olması beklenir.
9. Her yerin başlangıç ​​derinliğini ayarlayın yansıması.
   1. Her konum için, görüntü tümör hücresinin üst dilim sahne denetleyicisi odak düğmesini çevirerek z konumunu ayarlayın.
   2. görüş alanının merkezinde hücreyi yerleştirin.
   3. , Çoklu butonuna tıklayın vurgulayın ve çoklu listesinde hücrenin depolanan konumunu değiştirmek için Sil düğmesine, ardından Ekle tıklayın görüş alanının pozisyona tıklayınız.
   4. Görsel her pozisyonda tümör hücresinin göreceli parlaklığı gözlemlemek.
10. Çoklu paneli Kaydet düğmesine tıklayarak hücrelerin her yeni konumları kaydetBir dosya adı belirtmek d.
11. Bireysel tümör hücrelerinin görüntüleme için, yaklaşık eşdeğer parlaklık üç hücreleri almak ve Sil düğmesine tıklayarak ardından listede bulundukları yere tıklayarak ve çoklu listeden tüm diğer konumları silin.
12. Dedektörler ve Lazer butonuna tıklayın ve sinyaller doygunluk altında olduğu yeşil ve kırmızı kanalları ⁴⁵ yani PMT kazancı sürgü ayarlayın.
13. Makrofajlar camgöbeği görünmesi böylece mavi kanal ⁴⁵ için kaydırma çubuğunu ayarlayın.
    NOT: Herhangi bir ikinci harmonik sinyali sadece mavi kanalda görünecektir ve kanal çıkarma prosedürünü takip ederek mavi makrofajlar ayrılabilir önce ⁴⁵ nitelendirdi.
14. 0 mikron z-yığın başlangıç ​​derinliği ve sırasıyla yere z sahne hareketli ve Başlat tıklayıp Bitiş düğmeleri ile 24 mikron son derinliğini ayarlayın.
    NOT: Bu derinliği içinde hücreler en iyi sinyale ile görüntülendi olacakGürültü ve çözünürlük.
15. 3 mikron z adım boyutunu ayarlayın.
16. Parametreleri aşağıdaki görüntüleme parametreleri daha önce ^45,49 tarif ayarlayın.
    1. Bireysel tümör hücrelerinin görüntüleme için, Zamanlama Sinyalleri düğmesini tıklatın ve sonra (1.5x yakınlaştırma faktörüne eşdeğeri) zum faktörü alanında, çerçeve ortalama alanına 3 giriniz ve Time-Lapse düğmesine tıklayın ve 10 girin içine 4 V girmek Time-lapse alanına.
       NOT: Bu ayarlar 1 çerçeve her 3 saniyede kazanacaklardır.
    2. mozaik görüntüleme için, Zamanlama Sinyalleri düğmesini tıklatın ve (4X yakınlaştırma faktörüne eşdeğer) 1,5 V yakınlaştırma faktörünü girin, çerçeve ortalamalar sayısında 3 girin ve Time-Lapse düğmesine tıklayın ve zaman-içine 10 girin zaman gecikmesi alanını lapse.
       NOT: Bu ayarlar 1 çerçeve her 3 saniyede kazanacaklardır.
17. kendi düğmeleri tıklayarak çoklu, z-yığını ve t-lapse görüntüleme modları etkinleştirin.
18. görüntüler elde etmek için kayıt düğmesine basın.
    DEĞİLE: Akciğer dokusu çok hassas ve foto-karşı duyarlıdır. diğer alanlarda zaman atlamalı görüntüleme kan akımı görüntülü alanda durduktan sonra, lazer büyük olasılıkla ise çok yüksek ve sonraki görüntüleme daha düşük güçte yapılmalıdır.
19. Her 30-45 dk, yavaş yavaş hayvanın hidrasyon korumak için PBS veya serum fizyolojik 50 ul enjekte edilir.

6. Ötenazi

1. % 5 izofluran artırın.
2. nefes ve sahne hayvan kaldırmak çözüldükten sonra 30 saniye kadar% 5 izofluran altında hayvan tutun.
3. tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin.

7. Görüntü Analizi

1. Tek hücre görüntüleme deneyleri için:
   1. Fiji içine görüntüleri yüklemek ve bir hyperstack olarak biçimlendirmek.
   2. Hyperstack her z-dilim için, zaman atlamalı film oynatmaya ve artık xy hareketi arayın. Artık xy hareket bulunursa, için yığına StackReg ³⁶ denilen eklentiyi uygulamakhareketi ortadan kaldırır.
2. mozaik görüntüleme deneyleri için:
3. Fiji içine görüntüleri yüklemek ve dizin dosya baz adı, mozaik x ve y alanların sayısı ve sayısı gibi görüntüleri hakkında Mozaik Dikiş makro (Company kod dosyası Mozaik Dikiş) ve Bilgi girmeyi açarak onları bir araya dikiş dilimleri ve zaman noktalarının.
   NOT: Java dizinleri nasıl yorumladığını nedeniyle, klasör adları alt ayırıcı olarak iki ters eğik çizgi olması gerekir. Yerleşik eklentisi İkili Dikiş sınırlamalardan dolayı, taban dosya adları herhangi bir tire içermemelidir.
4. damarsal sınırları net bir görünüm elde etmek için, tek bir görüntü halinde bir araya kan kanalı için zaman noktalarında tüm ortalama ve daha sonra diğer kanalların filmin her kare için arka plan olarak bu görseli çoğaltırlar.
   Not: Bu sadece Kan ortalama gerçekleştirin makro çalıştırarak yapılır (İlave kod dosyası Kan ortalama gerçekleştirin).

Sonuçlar

Bu yöntem ile elde edilebilir sonuçlar tipini göstermek için, ameliyat öncesi zaman noktaları değişen MacBlue fareler ⁴⁴ kuyruk venine floresan protein yonca ile etiketlenmiş E0771-LG, tümör hücreleri enjekte ettik. Ameliyattan sonra, 155 kD rodamin etiketli dekstran damarlar ve zaman atlamalı görüntüleme yapıldı işaretlemek için IV enjekte edildi.

Fareler 24 saat sonrası enjeksiyon görüntüle...

Tartışmalar

Bu tür proteinler ve antikorlar gibi floresan etiketli fonksiyonel etiketleri ile kombine in vivo optik görüntüleme Yüksek çözünürlüklü metastatik kaskad anlayışımızı büyük oranda arttırmıştır. Bu, doğrudan görselleştirme ve tek hücreli ve tümör hücrelerinde alt-hücresel parametrelerin, konakçı hücreler ve bunların mikro-ölçümünü sağladı. Primer tümörün içindeki bu görüntüleme büyüme işgali ya da yayma ^6,7 birinin destekleyici ayrık mikroç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg Vacuum	McMaster Carr	4172K12	Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male Pipe	McMaster Carr	5346K13	Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 ml	Corning Life Sciences Glass	5360-50	Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.	Ted Pella, Inc.	260368	Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in.	Exel International	26746	Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0	VWR	95056-992	String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 oz	Hendel Corp.	LOC1647358	Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. Length	McMaster Carr	5155T12	Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length	McMaster Carr	5181K24	Thick Tubing
Depillatory Lotion	Nair	-
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPE	Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/1	Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305128	Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs	Fisher Scientific	867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube ID	McMaster Carr	5117k51	Connectors between tubes
One-Hole Rubber Stoppers	Fisher Scientific	14-135F	Stopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µl	Denville Scientific Inc.	P1125	Pipette Tip
Laboratory tape	Fisher Scientific	159015R
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	Opthalmic Ointment
Gemini Cautery Kit	Harvard Apparatus	726067	Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length	Roboz Surgical	RS-5135	Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm	Roboz Surgical	RS-5912	Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt	Roboz Surgical	RS-5980	Blunt Scissors
Wipes	Fisher Scientific	06-666-A	Harness
PhysioSuite System	Kent Scientific	PhysioSuite	Vitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip Tip	BD	309659	Syringe
Cyano acrylate	Staples	LOC1647358	Cover Slip Adhesive
Petroleum Jelly	Fisher Scientific	19-086291	Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mm	Harvard Apparatus	734118	Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter	Kent Scientific		Pulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane)	Henry Schein Animal Health	50033	250 ml
Oxygen	TechAir	OX TM
1x PBS	Life Technologies	10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 In	Grainger	3CGJ7	Vacuum Valve
Small Animal Ventilator	Harvard Apparatus	683	Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher Scientific	11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice	Jackson Laboratory	026051
Multiphoton Microscope	Olympus	Fluoview FV1000	Alternative to custom built scope
Environmental Enclosure	Precision Plastics	Chamber for FV1000	Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136
Laser Power Meter	Coherent	FieldMaxIITOP
Laser Power Meter Head	Coherent	PM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein Vector	Addgene	40259
G418 Sulfate Selective Antibiotic	ThermoFisher Scientific	10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter	Beckman Coulter	XDP
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-052-Cl
40 µm Mesh	Falcon	352235
96 Well Plate	Costar	3599
60 mm Culture Dish	Corning	430196
10 cm Culture Dish	Corning	353003
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x	Corning	21-031-CV
C57BL/6J Mouse	Jackson Laboratory	000664
Kim Wipes	Fisher Scientific	06-666-A