Tedavi Kan Retina Bariyer ihlali ve Potansiyel İlaçlar değerlendirilmesi için bir Akut Retina Modeli

Özet

Düşük maliyetli, kullanımı kolay ve güçlü bir sistem histamin tarafından uyarılan kan retina bariyer ihlali iyileştirecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için kurulmuştur. Kan damarı sızıntı, Müller hücre aktivasyonu ve nöron sürekliliği bir potansiyel ilaç, Lipoksin A4 hasarı yanıtını ve ters değerlendirmek için kullanılır.

Özet

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

Giriş

Artan miktarda kanıt vücut kan retina bariyerinin (BRB) ^1-5 ve kan beyin bariyeri (KBB) ^6,7 olan benzerliği varlığını destekler. BBB Uzlaşma sıkıca böyle deliryum ¹⁰ olarak nedensel ya da Alzheimer hastalığı (AH) gibi kronik nörodejeneratif hastalıklar tanısal belirteç olarak ^8,9 ve akut koşulları ile bağlantılı olmuştur. potansiyel ilaç hedefleri için bu patolojilerin ve keşifler içine mekanistik anlayışlar genellikle beynin sınırlı erişilebilirlik ve ağ karışıklık tarafından engellenmektedir. Bu, in vivo görüntüleme ^11, beyin Organotipik kültürü ^12, birincil hücre kültürleri ^13,14 ve ko-kültür sistemleri ¹⁵ gibi alternatifler oluşturulmuştur. Ancak bu modellerin çoğu hücreleri tanımlamak için özel araçlar, uzun deneysel dönemleri veya birden fazla belirteçler gerektirir. Fonksiyonel ve yapısal BBB ile BRB arasındaki benzerlikler yanı sıra dy arasında bir korelasyoniki sfunctions ^16-19 iddia edilmiştir. Buna ek olarak, daha kolay erişim, iyi tanımlanmış hücre tipleri ve tabakalı yapı beyne bir pencere olarak iyi karakterize edilmiş retina izin vermiştir. BBB ve BRB yapısal ve işlevsel kimlikler detaylı karşılaştırılması gerekmektedir. Bununla birlikte, retina hastalıkları, özellikle de BRB ihlali da sıkı bir şekilde diyabet ^18-19 ve AD ^21,22 dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesinin ile ilişkilendirilmiştir. Bu durumda, bir BRB disfonksiyon sistemi mekanizmasını tanımlamak için değil, aynı zamanda, potansiyel ilaç taranması için sadece kurmak ilgi çekicidir. Bu raporda, basit bir akut retinal kültürünü kullanarak bir protokol sağlayan BRB disfonksiyonu gelişti ve sunulmuştur.

Artmış BBB geçirgenliği ve AD-benzeri patolojik değişiklikler histamin, bir pro-inflamatuar arabulucu ¹² ile inkübe bir beyin Organotipik kültürü kurulmuştur. Bu nedenle, sunulan sistemde, histamin İçi olduBRB disfonksiyonu ikna etmek için ex vivo retina kültürüne ied. Böyle Mus musculus ve Bos Boğa gibi çeşitli türlerden gelen retinaları, test edilmiştir. Nedeniyle ticari kullanılabilirliği ve insan dokusuna benzediği için, taze domuz gözbebekleri burada bildirilen veri sağlamak için kullanılmıştır. Histamin ve / veya diğer ilaçlar ile inkübe edildikten sonra, retinalar immünoglobülin G (IgG), kan ana bileşenden biri olarak bir kaç protein ¹² için immün değerlendirme için işleme alınmıştır; Glial fibriller asidik protein (GFAP), glial aktivasyon için iyi bilinen bir işaretleyici; ve mikrotübül-ilişkili protein 2 (MAP2), mikrotübül montaj için gerekli bir nörona özgü sitoskeletal proteini. Bundan başka, retinanın tabakalı yapı gibi genişliği ve süreklilik değişiklikler olarak Müller hücrelerinin ve gangliyon hücreleri proseslerinin ayrıntılı bir analizini sağlar. Böylece birkaç ek parametreler sonuçlarını değerlendirmek için kullanılabilirBRB ihlali erken bir aşamada ve aynı zamanda potansiyel tedavilerin ters etkilerini değerlendirmek için.

kan damarlarının sızıntı (KZ), glial hücrelerin aktivasyonu ve nöronal hücrelerin hasar tepki: Bu protokol, ekranlı ilaçların potansiyel ters etkileri üç açıdan değerlendirilir. Çeşitli ölçümü yöntemleri, örneğin, ifade seviyesi immün bir süreç ve bir donanım filtresi tarafından gösterilen nöronal süreçlerin sürekliliği genişliği ölçüm yoğunluğu ile gösterilen, kullanılmaktadır. Daha iyi yöntemi göstermek için ve sonuçları yorumlamaya yardımcı olmak için, Lipoksin A4 (LXA4), endojen inflamatuar hasarına yanıt ve endotel disfonksiyonu ²³ hafifletici sentezlenen bir bileşik, gösteri amaçlı seçilmiştir.

Protokol

Tüm protokoller geçerli nereye Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi politikalarına uygun yürütülmüştür.

1. Hazırlık

1. % 75 ile sabitleme ortamı hazırlamak Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM),% 25 Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS). kullanılana kadar -20 ° C'de, iyi kısım ve mağaza karıştırın.
2. Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlanması ve otoklavda sterilize edilir. Oda sıcaklığında çözüm saklayın. Deney (oyuk başına 5 mi) daha önce 37 ° C'ye kadar PBS ısıtın.
3. % 10,% 20 ve PBS içinde% 30 sukroz hazırlayın. ayrı sterilizasyon için ayrı 0.22 mikron filtre üzerinden tüm çözümleri filtre. 4 ° C'de çözüm kaydedin.
4. 90 mM'lik bir konsantrasyona kadar PBS içinde histamin stok çözelti hazırlayın. 0.22 uM filtre üzerinde filtre edilerek çözelti sterilize edin. Kısım ve -80 ° C'da, çözelti kaydedin. Birden fazla donma-ve-çözülme döngüleri kaçının.
5. deneyden önce PBS içinde taze% 4 paraformaldehid (PFA) yapın. Buz üzerine yerleştirin.
   Dikkat: Davlumbaz PFA tutun ve uygun koruyucu ekipman giyin.
6. stabilizasyon orta (retinanın başına 20 ml) çözülme. 100 U / ml bir son konsantrasyona kadar Penisilin-Streptomisin ekleyin. Deney öncesi bir inkübatörde 37 ° C'ye kadar ortam (retinanın başına 15 mi) sıcak bölümü. buz üzerinde orta kalanı bırakın.
7. buz üzerinde HBSS (retinanın başına 10 ml) koyun.

2. Retina Organotipik Kültür

1. Bir doku kültürü kaputu örnekleri aktarın. lensin etrafında keserek Göz yuvası açın. Bir fırça yardımıyla hafifçe retina üzerine çekerek olmadan vitreus mizah kaldırın. Yavaşça optik diski ortaya çıkarmak için bir fırça ile kesilmiş kenarından retina ayırın. optik bir ustura ile sinir ve retina serbest ağır.
2. Petri kabı içine retina aktarın ve dikkatle soğuk HBSS kullanarak bir kez retina durulayın. i üzerinde HBSS örnek yerleştirince. Adım 2.1 ve bu adımı tekrarlayarak gerektiği kadar retina parçalara ayır.
3. simetrik bir jilet ile ikiye retina kesti. Yavaşça sabitleme ortamının 3 ml 6 yuvalı bir plaka örnekleri transferi ile sabitleştirilir. % 5 _CO2 içeren bir atmosfer ile bir inkübatör içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca dengede izin verin.
4. Adım 2.3 de inkübasyon sırasında aşağıdaki reaktifler hazırlayın: sıcak ortamda istenen konsantrasyona (450 uM) histamin stok solüsyonu sulandırınız. 250 ng / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar bir ortamda (argon altında saklanan) LXA4 çözülür.
   Not: LXA4 etkisini ölçerken, diğer yarısı LXA4 ile histamin kullanılır ise, tek bir retina yarısı tek başına histamin kullanılır.
5. dikkatli bir şekilde sabitleme ortamı aspire ve her bir (oyuk başına 3 mi) hazırlanan orta ekleyin. % 5 _CO2 içeren bir atmosfer ile bir kuluçka makinesi içinde, 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
6. durulamabir zamanlar sıcak, steril PBS örnekler.

3. immün için Örnekleri hazırlayın

1. plakalardan aspire PBS. % 4 PFA (oyuk başına 3 mi) ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir.
2. Çabuk PFA aspire. bir zamanlar PBS kullanarak örnekleri durulayın. % 10 sakaroza örnekleri (oyuk başına 5 mi) aktarın ve 4 ° C'de 2 saat ila 4 inkübe edilir.
3. % 30 sukroz (oyuk başına 5 mi) örnekleri aktarın ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. Çalışma donma orta yapmak için% 20 sukroz, iki parça ticari dondurma orta bir bölümünü karıştırın. kabarcıklar kaybolur hava kadar 4 ° C gecede veya daha uzun bırakın.
4. Çalışma dondurma ortamı örnekleri aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika için dengeleme sağlar. dikdörtgenler içine her retina (5 mm kabaca 3 mm) Trim.
5. Dikkatle silindirik bir kap (yaklaşık 1 cm çapında x 2 cm yükseklik) dev içerdiği çalışan dondurma ortama örnekleri aktarmakAlüminyum folyodan ised. retina dilimleri ve sıvı nitrojen içinde bunları dondurmak (Kesit üzerine retinanın bir kesitini sağlamaya yönelik) dik olduğundan emin olun. kullanılana kadar -80 ° C 'de bloklar kaydedin.
6. Bölüm her 14 mikron kalınlığında dilimler halinde bir kriyostat blok ve cam slaytlar bölümleri monte edin. kullanılana kadar -80 ° C 'de slaytlar saklayın.

4. immün

1. bir kez% 5 sakaroz fosfat tamponu (SPB, PBS içinde% 5 sukroz, pH 7.4) ile bölümleri yıkayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 10 normal keçi serumu ve% 0.5 Triton X-100 ile% 5 SPB) blokaj tamponunda bölümleri inkübe edilerek spesifik olmayan bağlanma yerlerini bloke.
2. Uygun primer antikor ile (slaytlar üzerinde) bölümleri inkübe (1'de seyreltilmiş GFAP ya MAP2'nin: 500 bloklama tamponu içinde) 1 saat boyunca. çözüm aspire. % 5 SPB içinde üç kez yıkayın. endojen IgG boyama için, bu adımı atlayın.
3. İlgili secon ile bölümleri inkübe1 saat: dary antikorlar (bloke edici tampon içinde 800 Cyanine3 / FITC konjüge edilmiş eşek anti-fare / anti-tavşan IgG, 1 seyreltilmiş).
4. iyice% 5 SPB üç kez bölümleri yıkayın. orta montaj DAPI içeren ve lamelleri ile kaplama onları monte edilerek mikroskopi için örnekler hazırlayın.
5. Gruplar arasında, vb kalma süresi, lazer yoğunluğu, kazanç değeri olarak aynı parametreleri altında 20X merceğinden bir lazer konfokal mikroskop, yakalama görüntüleri kullanma. 488/525 nm olarak 561/785 nm olarak (Cyanine3 algılamak için) kırmızı kanal için, 408/447 nm olarak (DAPI tespit etmek) ve yeşil kanal için (FITC algılamak için) mavi kanal için uyarma / emisyon dalga boylarını ayarlamak .

5. Görüntü Analizi

1. Aşağıdaki kriterlere ^12'ye göre sızdıran kan damarlarının yüzdesini ölçmek: sayısında bölümün düzlemi içinde endotel hücre çekirdekleri ile sadece kan damarları dahil; o ag gösterirse bir kan damarı sızan düşününkabı çevreleyen immün radient.
2. ifade seviyesini belirlemek için, ilgi alanları seçmek ve görüntü analizi yazılımı kullanılarak ortalama gri değeri ölçmek.
3. sürecin genişliğini ölçmek için, süreçler (örneğin dış çekirdek katmanı, onl) farklı olan bölümün bir alanı seçin. Sonra bu süreçler görünür ve sürekli olan bir optik alanı seçin. Mikroskobik ayarına göre ölçek çıtayı süreci boyunca bir çizgi çizin ve ölçümü yapmak.
4. sürecin devamlılığını analiz etmek için, ilgi seçkin bölgeleri, komşuluk varyans ile her pikseli değiştirerek Görüntüdeki kenarları artırır varyans denilen filtre uygulamak, otomatik olarak, kontrast ve parlaklık ayarı satırları saymak tarafından sayımı normale Konum.
5. İki kuyruklu Student t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlara hesaplayın. * P <0.05; ** P <0.01; *** P <0.001. Plot Mean olarak sonuç SEM ±.

Sonuçlar

Biz histamin tarafından uyarılan BRB ihlal karşı koruyabilecek potansiyel tedaviler değerlendirmek için düşük maliyetli, zaman verimli ve kolay kullanımlı bir sistem sunuyoruz. IgG kontrol retina (Şekil 1A) damarlar içinde kısıtlı, ancak modelin başarıyla kuruldu doğrulayan histamin maruz (Şekil 1B) üzerine kan damarlarının, dışarı sızdırıyor.

LXA4 sunulan sistemde...

Tartışmalar

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	11965-092
HBSS	Life Technologies	14170-112
Sucrose	J.T.Baker	4072-05
Histamine	Sigma	H7125-1G
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710
Freezing Media	Triangle Biomedical Sciences	TFM-5
Normal Goat Serum	Rockland	D104-00-0050
Triton X-100	Sigma	T8787
GFAP Antibody	Millipore	AB5804
MAP2 Antibody	EMD Millipore	MAB3418
FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	711-095-152
Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	715-165-150
mounting medium containing DAPI	Vector Laboratories, Inc.	H-1200
Laser Confocal Microscope	Nikon	Eclipse Ti microscope
ImageJ	National Institutes of Health	1.45s