Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Özet

Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.

Özet

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

Giriş

Efficient separation of a cell population of choice from other cells enables studies of the population that may not be possible otherwise. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a method to enrich an interesting cell population with high purity. ^1,2 Different cell types usually express unique molecules, or a unique combination of several molecules, on the plasma membrane that can distinguish one cell population from another. Upon binding of these cell surface molecules by specific fluorescence-conjugated antibodies, a detecting machine called flow cytometer/sorter is able to excite and detect the light signals of different fluorescent dyes that represent different molecule markers on the cells at the single cell level. The combined information consisting of either the presence of a light signal (representing positive expression of the corresponding surface molecule) or the absence of a light signal (representing negative expression of a molecule) defines the phenotype of the cell. After passing through the detector, cells with the same phenotype of interest are diverted towards a designated collecting tube based on electrical charge.

FACS is broadly applied in various studies as long as the population to be enriched is labeled with fluorescence.^3-7 It has been used to separate immunoglobulin (Ig)A-coated bacteria from non-IgA coated bacteria in the gut microbiota ⁸ and sort genetically engineered cell populations expressing fluorescent proteins. ⁹ Importantly, it has the capacity to separate more than one population simultaneously, which not only saves time and reagents but also allows for more sophisticated study designs. ¹⁰ However, FACS also has its limitations. If a population of interest is very rare (less than 1%), the sorting efficiency may be reduced, causing significant cell loss. In addition, some antibody binding may activate intracellular signal transduction that induces functional changes of the sorted cell population. ¹¹ Therefore, the phenotype used for sorting should be selected carefully.

Other methods exist besides FACS that are also based on cell surface markers for the enrichment of specific cell populations, such as magnetic-activated cell sorting (MCS). ¹² Similar to FACS, magnetic beads-conjugated antibodies can target specific cell surface molecules. Upon antibody-antigen interaction, magnetic beads-coated cells can be separated from non-coated cells after passing through a magnetic field. However, only a limited number of molecules can be targeted in MCS, as magnetic beads are, unlike various fluorescent colors in FACS, undistinguishable. It is thus difficult for MCS to define a cell phenotype with a complicated combination of surface markers. ^13,14 In addition, MCS is also able to cause unintended activation of target cells.

In our studies of a mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE), ¹⁵ we intended to purify plasmacytoid dendritic cells (pDC) to investigate their functional changes with disease progression. We first used MCS to enrich pDC from the bone marrow by targeting PDCA-1, a molecule highly and uniquely expressed on murine pDC at steady state. ¹⁶ However, the cell purity was unexpectedly low, likely due to the upregulation of PDCA-1 on other cell populations in an inflammatory environment such as SLE.¹⁶ Ultimately, we have used FACS with a combination of four surface markers (CD11c, CD11b, B220 and PDCA-1) to separate high-purity pDC as CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+ population. Murine pDC has another specific surface marker Siglec-H. We decided not to use Siglec-H, as antibody binding of this molecule represses the function of pDC to produce IFNα. ¹¹

Protokol

NOT: MRL / Mp-Fas ^lpr lupus eğilimli fareler yetiştirilen ve Virginia Tech (Hayvan Refahı Güvencesi sayısı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) gereklerine itibaren belirli bir patojen içermeyen tesiste muhafaza edildi (MRL / lpr): A3208-01). Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri IACUC protokolü # 12-062 altında gerçekleştirilmiştir.

1. Hücre Kültürü Orta ve Sıralama Tampon

1. Tüm hücre kültürü ortamı (C 10),% 10 fetal sığır serumu, 1 mM sodyum piruvat,% 1, 100 MEM temel olmayan amino asitler, 10 mM HEPES, 55 uM 2-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş RPMI 1640 ile hazırlayın 100 U / ml penisilin-streptomisin.
2. ayırma tamponu hazırlayın 10 mM HEPES ile desteklenmiş 1 x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile (dolu HBSS), 2.5 mg / ml sığır serumu albümini,0,05 mM _MgCl2 ve 0.2 U / ml DNaz I

2. Fare diseksiyonu

1. 4 ml C10 içeren iki 6 cm çapında yemekleri hazırlayın. buz üzerinde yemekleri yerleştirin.
2. CO ₂ inhalasyon yoluyla fare Euthanize.
3. dalak hasat ve buz üzerinde C10 ile bir tabak içinde tutmak.
   1. diseksiyon plaka üzerinde yukarı bakacak şekilde karın fare aşağı pin. % 70 etanol püskürtülerek vücudu sterilize edin.
   2. Cildi kesin ve altında boyun pubis eklemi ventral orta hat boyunca kas duvarından cilt ayırmak.
   3. Ayak bileği ilk kesi arka bacak boyunca cildi kesin.
   4. arka yüzlerine cilt pin ve diyafram ilk kesi yerden kenarlarında kas duvarı kesti.
   5. kafanın sağ tarafında kas duvarı geri pin.
   6. ince bağırsak altında ve mide yanında farenin sağ tarafta dalak bulun. inci bir ucunu Pick upe dalak ve mide ayırın.
4. femur ve tibia da dahil olmak üzere, her iki arka bacaklarda kesip, ve mümkün olduğunca tüm kasları kaldırın.
   1. kan damarları önlemek için çalışıyoruz, keskin bir makas ile ayak bileği pelvik / kalça ekleminden arka bacak boyunca kasları kesti.
   2. Kemik iliği içeriğinin maruz kalmadan pelvis / kalça eklemi ve ayak bileği / ayak eklem keserek arka uzuv ayırmak.
   3. tekrar tekrar jilet ile çizilme ve ortak noktalarda kasları keserek kemikler üzerinde temiz kalan kaslar.
5. buz üzerinde 4 ml C10 içeren 6 cm çanak kemikleri tutun. Bir sonraki fare diseksiyon geçin.

3. splenosit yalıtımı

1. Resim kırmızı renkli görünür olana kadar 4 mi C10 ihtiva eden çanak üzerine 70 mikron hücre süzgecinden karşı şırınga pistonu yavaşça dalak homojenize edilir.
2. süzgeç a ile çanak içine ilave 6 ml C10 eklend sonra 15 ml konik tüp toplam 10 ml hücre süspansiyonu aktarın.
3. 5 dakika, 4 ° C, 800 xg'de konik tüp santrifüjleyin.
4. Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 2 ml 1 x kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu içinde hücre pelletini. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
5. İnkübasyondan sonra, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında santrifüj konik tüp.
6. Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 1 ml C10 hücre pelletini. herhangi bir büyük kümeleri (ölü hücreler) atın ve daha sonra buz üzerinde tüp tutun.
   NOT: Birçok küçük kümeleri varsa, bir kez hücre süspansiyonu filtre 70 mikron hücre süzgeç kullanın.
7. otomatik bir hücre sayacı tripan mavisi ile hücre sayısı.

4. Kemik iliği Hücre İzolasyonu

1. bir havan içine 4 mi C10 kemik aktarın ve toplam 10 mi C10 lik bir hacim oluşturmak için 6 ml C10 ekleyin.
2. ap kullanarak harç yavaşça kemikleri çatlakestle.
3. C10 içine kemik iliği serbest bırakmak için tokmak ile hafifçe karıştırın.
4. 70 mikron hücre süzgecinden buz üzerinde bir 50 ml konik tüp içine kemik iliği içeren 10 ml C10 aktarın. hala kemikleri içeren harcın içine 10 ml taze C10 ekleyin.
   NOT: Pipet kırmızı kümeleri görülebilir ise süzgecinden geçirmeden önce kemik iliği yukarı ve aşağı birkaç kez içeren solüsyon.
5. Tekrarlayın kez 4.4'e 4.2 adımları tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, kemikler, beyaz görünmelidir.
6. 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 50 ml konik tüp santrifüjleyin. Öte yandan oda sıcaklığında bir 15 mL konik santrifüj tüpü içinde 5 ml Ready-to-use yoğunluk gradyan hazırlarlar.
7. Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 10 ml C10 hücre pelletini.
8. Yavaş yavaş iki faz arasındaki net arayüzü koruyarak, 5 ml yoğunluk gradyan ortamının üstüne 10 ml hücre süspansiyonu katman. Daha sonra 30 dakikada için 1.363 g 15 ml konik tüp santrifüj0 (Fren KAPALI) olarak ayarlanmış hızlanma 9 olarak set ve yavaşlama ile RT (20 ° C).
9. Santrifüj işleminden sonra, dikkatle üst 8 ml solüsyon kaldırmak ve yeni bir 15 ml konik tüp içine arabirimi (mononükleer hücrelerin tabakası) 2 ml buffy coat toplamak.
10. Kemik iliği tek çekirdekli hücreleri, kap ihtiva eden 15 ml konik tüp, 12 ml buz soğukluğunda C10 ekleyin ve daha sonra iyice karıştırın, 10 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında santrifüj tüpü birkaç kez ters çevirin.

FACS 5. Hücre Yüzey Boyama

1. örnek boyama
   1. anti-fare CD16 / 32 antikor çözeltisi (İN 1-100 seyreltme HBSS-dolu / ml son konsantrasyon 5 ug) hazırlayın.
   2. Adım 4.10 santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire ve tek çekirdekli hücreler üzerindeki Fc reseptörü bloke etme 100 ul anti-fare CD16 / 32 antikor çözeltisi hücre pelletini. 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   3. (Karınca floresan konjuge antikor karışım hazırlayınI-fare CD11c-PE 1:40 seyrelti, anti-fare CD11 b-APC-Cy7 1:80 seyrelti, anti-fare PUKÖ 1-FITC 1:40 seyreltme ve anti-fare B220-V500 HBSS- bölgesindeki 1:40 seyreltme örnek başına 100 ul nihai hacim) üretici tarafından tavsiye edildiği gibi, tam.
      NOT: Kullanmadan önce antikorlar titre önemlidir.
   4. Aşama 5.1.2 içinde 10 dakika inkübe edildikten sonra, anti-fare CD16 / 32 bağlanmamış kaldırmak için 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 4 mi buzla soğutulmuş HBSS dolu ve santrifüj ekleyin.
   5. Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 100 ul floresan konjuge antikor karışımı içinde hücre pelletini. karanlıkta 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
   6. 15 dakika inkübasyondan sonra, bağlanmamış floresans-konjuge antikor kaldırmak için 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 4 mi buzla soğutulmuş HBSS dolu ve santrifüj ekleyin.
   7. FACS yükleme solüsyonu (HBSS-tam 500 ng / ml DAPI) hazırlayın.
   8. Aşama 5.1.6 santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire 500 mikron hücre pelletiniL FACS yükleme çözümü. 12 x 75 mm yuvarlak tabanlı tüpü (FACS tüpü) içine hücre süspansiyonu aktarın ve 1 saat içinde sıralama kadar karanlıkta buz üzerinde tüp tutun.
2. Tazminat boyanma
   1. PE, APC-Cy7, FITC, V500, DAPI veya boyasız olarak etiket 6 FACS tüpleri. 1 x 10 ⁶ hücre / FACS tüplere boru ve en kısım splenositler, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g'de 4 mi HBSS-Tam ile yıkayın.
      NOT: ölü hücrelerden canlı hücreleri ayırt etmek floresan boya, DAPI, DNA-bağlayıcı. DAPI Ölü hücrelerin plazma zarına (fakat canlı hücre) ve bağlama kromozom DNA geçebilir.
   2. Süpernatantı aspire ve 100 ul HBSS-tam hücre pelletini.
   3. anti-fare CD19-PE 1:40 seyrelti, anti-fare CD11 b-APC-Cy7 1:80 seyrelti, anti-fare PUKÖ 1-FITC 1:40 seyreltme ya: her bir karşılık gelen FACS tüpü içinde, aşağıdaki antikorların birisi ekleme manufa tarafından tavsiye edildiği gibi anti-fare B220-V500 01:40 seyreltmecturer. Oldukları gibi 5 ^inci (DAPI) ve ^6. (boyasız) FACS tüpler bırakın. sallayarak iyice karıştırın ve 15 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde tüm FACS tüpleri kuluçkaya yatmaktadır.
   4. İnkübasyondan sonra, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında, her bir tüp ve santrifüj içine FACS tüpler 4 mi buz gibi soğuk HBSS dolu ekleyin.
   5. Santrifüj işleminden sonra, süpernatan aspire ve 500 ul buz hücre pelletini 500 ul FACS yükleme çözeltisi içinde tekrar süspansiyon haline getirilir DAPI işaretli tüp, pellet haricinde soğuk HBSS dolu yeniden süspanse edin. sıralama kadar karanlıkta buz üzerinde 6 tüpleri tutarak.

6. Hücre Sıralayıcısı üzerinde sıralama

NOT: sitometresindeki ve yazılım prosedürü sıralama Operasyonu şirket tarafından sağlanan ayrıntılı bir talimat ile standardize edilmiştir. Kısaca, biz 20 psi 100 mikron nozul, 5 arasında ayarlanabilir hedef hücre konsantrasyonunu kullanmak - ml başına 10 milyon ve% 70 ya da daha yüksek verimlilik ayarlamak (yani, çatışmalar 30 yaşın altında tutulan%).

1. 100 U / ml penisilin-streptomisin içeren 500 ul FBS / tüp ile toplanması FACS tüpü hazırlayın.
2. Adım 5.2 den tek leke kompanzasyon tüpleri kullanılarak hücre sıralayıcı tazminat parametrelerini ayarlayın.
   1. Her florasan yoğunluğu için negatif bir kapı ayarlama boyanmamış bir tüp içinde 10,000 hücre kaydedin.
   2. Her floresan yoğunluğu için pozitif kapısı ayarlamak için diğer tek leke tazminat tüplerde 10.000 hücreleri kaydedin.
      NOT: Yazılım otomatik olarak tazminat parametrelerini hesaplar.
3. 3000 hücrelerini kaydederek sıralı hücre popülasyonlarının kapılarını ayarlamak için adım 5.1 bir örnek kullanın. el görünüşe göre diğer noktalardan ayrı noktalar grubu olarak X ve Y ekseni grafik geçit hedef hücre popülasyonunun parametre olarak floresan yoğunluğunu kullanılması.
   NOT: Bu yolluk seti araştırmacıların ihtiyaçlarına göre esnek ve keyfidir. Araştırmacılar, bir ya da daha fazla belirteçler dayalı yüksek saflıkta bekliyorsanız, kapı hareketyüksek gelen floresan yoğunluğuna göre.
4. Bir koleksiyon tüp yükleyin ve hedef hücre popülasyonunu sıralamak başlar.
5. Tüm örnek tüpleri yapılır kadar sıraladıktan sonra buz üzerinde toplama tüpü tutun.
6. 4 ml, sınıra kadar toplama tüpüne buz C10 ekleyin ve karıştırın ters.
7. 5 dakika, 4 ° C için 800 xg'de toplama tüpü Santrifüj ve sonra el değmemiş hücre pelet ile yaklaşık 200 ul bırakarak süpernatant aspire.
8. hücre pelletini tekrar süspansiyon ve 1,5 ml santrifüj tüpüne Tüm hücre süspansiyonu transfer 1 ml buz gibi soğuk C10 ekleyin.
9. Santrifüj bakir hücre peleti 100 ul bırakarak 1.5 mi, 5 dakika, 4 ° C, 800 x g hızında boru ve süpernatan aspire.
10. kullanılana kadar buz üzerinde sıralanmış hücre popülasyonlarının saklayın.

Sonuçlar

Biz yüksek saflıkta kemik iliği PDC zenginleştirmek amaçladık ve IFNa üretme kabiliyetleri konusunda pDC fonksiyonel değişiklikleri incelemek için genç ve yaşlılık hem MRL / lpr lupus eğilimli farelerin diğer hücre türleri etkisi olmadan. Kullanılan ilk arıtma stratejisi Şekil 1'de görüldüğü gibi zenginleştirme sonra sadece% 7,75 saflıkta yol açtı, MCS, oldu. MCS ile karşılaştırıldığında, FACS% 96.4 gibi yüksek saflıkta PDC zen...

Tartışmalar

The protocol described in this manuscript is for high purity enrichment of live pDC that retain the ability to produce IFNα. The applications of this protocol include, but are not limited to, purification of pDC and/or any other mononuclear cells from the bone marrow of MRL/lpr and any other mouse strains for studies of cellular and molecular functions. Several critical steps in this protocol are to ensure high viability and purity of the sorted pDC. The first key step is the release of bone marrow from bones. To mi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco by life technologies	11875-093
Fetal bovine serum	HyClone	SH30396.03
Sodium pyruvate	gibco by life technologies	11360-070
MEM non-essential amino acids	gibco by life technologies	11140-050
HEPES	gibco by life technologies	15630-080
2-mercaptoethanol	gibco by life technologies	21985-023
L-glutamine	gibco by life technologies	25030-164
Penicillin-Streptomycin	gibco by life technologies	15140-122
1x Hank’s Balanced Salt Solution	gibco by life technologies	14175-079
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
MgCl2	SIGMA	M8266
DNase I	SIGMA	D4527
Red blood cell (RBC) lysis buffer	eBioscience	00-4300-54
Density gradient medium	GE Healthcare	17-1440-02	Ficoll-Paque Plus
anti-mouse CD19-PE	BD Pharmingen	553786
anti-mouse CD11c-PE	eBioscience	12-0114-82
anti-mouse CD11b-APC-CY7	BD Pharmingen	557657
anti-mouse PDCA-1-FITC	eBioscience	11-3172-81
anti-mouse B220-V500	BD Pharmingen	561226
DAPI	invitrogen	D3571
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec	130-092-786
BD FACSAria I flow cytometer	BD Biosciences	643178
BD FACS Diva version 6	BD Biosciences