JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, bir etkinlik bazlı prob hazırlanmasını ve kullanımını tarif (ARN14686, undek-10-inil-N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat) saptanması ve ölçülmesi için izin verir proinflamatuar enzimi N -acylethanolamine asit amidaz aktif formu (NAAA), hem in vitro ve ex vivo.

Özet

Aktivite bazlı protein profili (ABPP) enzimin aktif sitesi hedef kimyasal sistemlerinin kullanımı ile kompleks proteomun daki bir enzimin tanımlanması için bir yöntemdir. sonda içine bir raportör etiketi-jel floresans tarama protein blot, floresan mikroskobu ya da sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile etiketlenmiş enzim algılanmasına olanak verir. Burada, hazırlanması ve bileşik ARN14686 kullanımını seçici enzim N -acylethanolamine asit amidaz (NAAA) tanıdığı bir tıklama kimya faaliyet tabanlı prob (CC-ABP) açıklar. NAAA örneğin palmitoiletanolamidi (PEA) ve oleoylethanolamide (OEA) gibi endojen peroksizom proliferatör ile aktive olan reseptör (PPAR) -alfa agonistleri devre dışı bırakarak iltihabı teşvik eden bir sistein hidrolazdır. NAAA lizozom asidik pH autoproteolysis ile aktive edilen bir aktif olmayan, tam uzunlukta bir proenzim olarak sentezlenir. Lokalizasyon çalışmaları hNAAA ağırlıklı B-lenfositlerinde ve, makrofajlar ve diğer monosit türevli hücrelerde eksprese olduğu gösterilmiştir ave. Biz ARN14686 tespit ve protein blot ve floresan mikroskobu ile kemirgen dokularında aktif NAAA ex vivo olarak ölçmek için kullanılabilir şeklinin örneklerini sağlar.

Giriş

Yaygın tüfek analizi 1,2, maya için sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi platformları içeren ekspresyonu, etkileşimler ve işlevleri proteinlerin araştırmak için yöntem kullanılan iki hibrid yöntemler 3,4 ve in vitro deneyler, bu olmasıyla sınırlıdır kendi doğal yapısında proteinlerinin aktivitesini değerlendirmek mümkün. Etkinlik bazlı protein profilleme (ABPP) bu boşluğu doldurmak için kullanılabilir. Bu yaklaşımda, küçük moleküllü kovalent hedef saptama için izin veren bir raportör gruba konjuge edilmiş bir ilgi enzimin aktif bölgesine bağlanabilen probes. Tıklama kimyası (CC) kullanarak, muhabir prob entegre edilebilir veya hedef nişan 5,6 oluştuktan sonra sokulabilir. İkinci prosedür, suc biyo-dik reaksiyonlar vasıtasıyla haberci reaktif bir dizi modifiye edilebilir bir terminal alkin veya azid gibi uygun kimyasal gruplar ihtiva eden sondalannın kullanılmasını gerektirirCu (I) H [3 + 2] siklo-7-9 ya da Staudinger ligasyon 10,11 Hüsgen, paladyum.

Son zamanlarda, in vitro ilk ABP gibi sistein hidrolaz, NAAA 12 in vivo tespiti bileşik ARN14686 tarif. NAAA antienflamatuar nükleer reseptör PPAR-alfa 13-15 endojen agonistleri olan oleoylethanolamide (OEA) ve palmitoiletanolamidi (PEA) de dahil olmak üzere doymuş ve tekli doymamış FAES, hidrolitik devreden katalize eder. NAAA ağırlıklı doğal bağışıklık tepkisinin düzenlenmesinde önemli bir rol öne hem de B-lenfositleri 14,16 olarak, makrofajlar ve diğer monosit türevli hücre olarak ifade edilir. Enzim, bir aktif olmayan formda endoplazmik retikulum içinde sentezlenir ve otoproteolitik mekanizması 17 hücrenin asidik bölümlerinde aktive edilir. Otoproteolitik klevaj (C13 Yeni N-terminal sisteini üretirFare ve sıçanlarda 1, insanlarda 126P), bu FAE için nükleofil sorumlu 18,19 hidrolizidir. NAAA aktivitesinin farmakolojik inhibisyonu FAEler 16,20,21 artmış hücresel seviyedeki lehine FAE sentezini / yıkımını dengesini değiştirir. Çeşitli β-lakton ve β-laktam türevleri, yüksek bir potansiyel ve seçicilik 16,22-26 ile NAAA aktivitesini inhibe ettiği gösterilmiştir. Bu inhibitörler, katalitik sistein 16,27,28 S -acylation olarak hareket eder.

(- [(S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat 4-cyclohexylbutyl- K) 16 bileşiği, ARN14686 sistemik aktif serin türevi β-laktam NAAA inhibitörünün kimyasal yapısı, ARN726 göre tasarlanmıştır. ARN726 4-bütil-sikloheksil grubu, bir azid taşıyan raportör etiketi ile müteakip CC konjügasyonu için bir terminal alkin etiket taşıyan bir C9 doymuş alifatik zinciri ile ikame edilmiştir. Biz minimall için iki adımlı bir ABP tasarımı seçtiy böylece NAAA için prob afinite koruyarak, orijinal iskele yapısını değiştirebilir. Ayrıca, hacimli etiketlerin giriş kaçınarak, bir sonda, bir doğrudan ABP daha canlılarda tedavi için daha uygun olabilir. ARN14686 yüksek etki ile NAAA inhibe enzim 12 katalitik sistein ile kovalent bir katılma ürünü oluşturmak suretiyle (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC50 = 13 nM). canlı farelerde deneyler prob NAAA akciğerlerde ifade yakalama seçici olduğunu göstermiştir. Yüksek prob konsantrasyonunu (in vitro 10 uM, 10 mg / damar içi, iv mi) 12 kullanılarak, asit seramıdaz, NAAA ile 33-34% özdeşlik paylaşan başka sistein amidaz, aynı zamanda, düşük afiniteli bir hedef olarak tespit edilmiştir. Ayrıca, tam Freund adjuvanı (CFA) 29 uygulanmasından sonra iltihaplı sıçan dokularında aktif NAAA varlığını incelemek için ARN14686 kullandık.

Burada, Preparati için bir protokol anahatARN14686 (Şekil 1) ve NAAA aktivasyonu ex vivo soruşturma onun uygulaması üzerinde. Bir örnek olarak, CFA tatbikatından sonra sıçan pençelerde NAAA görselleştirmek için deneysel bir prosedürü açıklar. Bu deneyde, protein sondanın IV enjeksiyonundan sonra pençe dokusundan ekstre edilir ve ABP-etiketli proteom biyotin-azid ile CC tabi tutulur. Biyotinile örnekleri streptavidin boncuk kullanılarak zenginleştirilmiş ve protein lekeler yapılmaktadır. Başka bir uygulamada, prob ile tedavi edilen farelerden alınan fare akciğerlerinde floresan mikroskobu aktif NAAA lokalizasyonunu tarif etmektedir. Bu durumda, dokunun kesit bölümleri ve rodamin ilave edilmesi için CC tabi tutulur. Bir iş akışı şeması Şekil 2'de gösterilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Dikkat: Bütün kimyasal reaksiyonlar havalandırılan bir duman başlığı ve bir laboratuar kaplama, eldiven ve koruyucu gözlüklerin kullanımı ile yapılmalıdır. reaksiyonlar da bir azot ortamında gerçekleştirilmelidir.

Etik açıklama: hayvanları da içeren Bizim prosedürleri Deneysel ve diğer bilimsel amaçlar (DM 116.192) ve Avrupa Ekonomik Topluluğu düzenlemeler için kullanılan hayvanların korunması konusunda İtalyan düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilir (OJ EC L 358/1 1986/12/18 ).

NOT: sentezi [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] amonyum asetat, büyük ölçekli verimlerle tarif edilmiştir, ancak bu aşağı doğru kolayca ölçeklendirilebilir (N-Cbz-L-serin, 50 g) eklenmiştir.

1. sentezi

NOT: Sentez Reaksiyon şeması için Şekil 1'e bakınız.

  1. 2-piridil undek-10-inil karbonat hazırlanması ve undek-10-inil 2-oksopiridin-1-karboksilat
    1. 50 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, undec- 350 mg çözülürkuru diklorometan 3.5 ml, 10-in-1-ol elde edilir.
    2. 1.1.1 çözeltiye, 4-dimetilaminopiridin (DMAP) ve 2-dipiridilkarbonat (DPC) 530 mg 25 mg ekleyin. 16 saat oda sıcaklığında (RT) karıştırın.
    3. 20 mL diklorometan ekleyin.
    4. bir ayırma hunisi içine karışımı aktarın. Su 15 ml ekleyin sallayın ve iki faz ayrılması için izin verir.
    5. , Musluğunu açın organik faz (alt) toplamak ve sonra stopcock kapatın. Doymuş NaHCO 3 çözeltisi 15 ml ilave edilir. ayırma hunisi çalkalayın ve iki faz ayıralım. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın.
    6. Na 2 SO 4 Organik tabaka, yuvarlak dipli bir şişeye (dara önce) içine pamuk üzerinde filtre edildi ve indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar buharlaştırılır.
    7. şişeyi tartılır ve 2-piridil undek-10-inil karbonat ve undek-10-inil, 1.7 bir oranda 2-oksopiridin-1-karboksilat bir karışımı olan bir yağ, 600 mg elde edilir: 1.
      1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ana bileşen δ = 8.39 (dd, J = 5.0, 2.0, 1 H), 7.98 (td, J = 7.9, 2.0, 1 H), 7.40 (ddd, J = 7.2, 4.9, 0.9, 1 H), 7.30 (d, J = 8.2, 1 H), 4.22 (t, J = 6.6, 2H), 2.73 (t, J = 2.4, 1 H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1.76 - 1.62 (m, 2H), 1,50-1,23 (m, 12H).
      1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) küçük bileşen δ = 7.74 (dd, J = 7.2, 1.9, 1 H), 7.47 (dd, J = 6.7, 2.3, 1 H), 6.44 (d, J = 9.4, 1 H), 6,30-6,25 (m, 1 H), 4.35 (t, J = 6.5, 2H), 2.72 (t, J = 2.4, 1 H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
    8. daha fazla ayırma veya saflaştırma yapılmadan bir yağ kullanın.
  2. [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] amonyum asetat hazırlanması
    1. Benzil N - [(S) -1- (hidroksimetil) -2 - [(4-metoksifenil) amino] -2-oxoethil] karbamat.
      1. 4 L'lik yuvarlak dipli bir şişede tetrahidrofuran 1.5 L diklorometan 0.5 L p -anisidine arasında 141.5 g çözülür.
      2. Bir buz banyosu içinde 0 ° C'ye kadar çözelti soğutulur.
      3. N-Cbz-L-serin 50.0 g ekleyin ve N 43.9 g S - (3-dimetilaminopropil) - etilkarbodiimid hidroklorid.
      4. 30 dakika boyunca 0 ° C 'de manyetik bir çubuk ile karıştırın.
      5. buz banyosunda solüsyonun çıkarın ve 16 saat oda sıcaklığında, bir manyetik çubuk ile karıştırıldı.
      6. indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında solventler buharlaştınn.
      7. Bir spatula ile karıştırıldı, 1 sikloheksan / etil asetat ve süzün: 1, 400 ml ilave edilir.
      8. Adımı yineleyin 1.2.1.7 iki kez daha.
      9. Etil asetat, 500 ml sakızsı artığı içinde çözündürülür ve (2 kez), doymuş NaHCO 3 çözeltisi 400 ml 0.1 M HCI çözeltisi (10 kez), 400 ml ile yıkanır, ve tuzlu su ile, 400 ml.
      10. Organik tabaka kurutulurSO 4 Na 2, (dara ilk), yuvarlak dipli bir şişeye pamuktan çözelti filtre edildi ve indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar buharlaştırılmak.
      11. şişeyi tartılır ve beyaz bir katı madde 61,4 g.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 9.86 (bs, 1 H), 7.52 (d, 2H, J = 9.0Hz), 7.42-7.25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5.06 (d, 1 H, J = 12.9 Hz), 5.02 (d, 1 H, J = 12.9 Hz), 4.98 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1 H), 3.72 (s, 3H), 3.70-3.57 (m, 2H).
    2. Benzil N - [(S) -1- (4-metoksifenil) -2-okso-azetidin-3-il] karbamat.
      1. N 58.6 g çözülür - [(S) -1- (hidroksimetil) -2 - [(4-metoksifenil) amino] -2-okso-etil] karbamat, N, N-dimetilformamid içinde 1.6 L.
      2. bir buz banyosu ile 0 ° C'ye kadar çözelti soğutulur.
      3. 1,1'-sulfonyldiimidazole 50.6 g ekleyin ve 30 dakika için bir manyetik çubuk ile karıştırıldı.
      4. Bu solüsyon soğumayakısımlar halinde -20 ° bir buz / NaCI banyosunda C ve sodyum hidrit (mineral yağ içinde% 60) 10.2 g ekleyin.
      5. 1 saat boyunca -20 ° C 'de karıştırınız, sonra 2 ml metanol ve 1 L su ile söndürün.
      6. Vakum, çökelti filtre 200 ml su ile yıkanır ve vakum altında kurutulur.
      7. beyaz bir katı 42.2 g.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.08 (d, 1 H, J = 8.5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7.30 (d, 2H, J = 8.9Hz), 6.95 (d , 2H, J = 8.9Hz), 5.06 (s, 2H), 4.86 (ddd, 1 H, J = 8.5, 5.6, 2.6 Hz), 3.90 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 3.73 (s, 3H) , 3.55 (dd, 1 H, J = 5.6, 2.6 Hz).
    3. Benzil N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat.
      1. Benzil N- 9.0 g Askıya - [(S) -1- (4-metoksifenil) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat 500 ml asetonitril ve 400 ml su içinde.
      2. Bir buz banyosu içinde 0 ° C'ye kadar çözelti soğutulur.
      3. ceri 45.4 gr ekleCı amonyum nitrat kısım kısım 45 dakika boyunca ve 15 dakika boyunca 0 ° C 'de manyetik bir çubuk ile karıştırıldı.
      4. Dikkatle doymuş NaHCO 3 çözeltisi 500 ml ilave edilir, ve daha sonra etil asetat ile 500 ml ekleyin.
      5. çökelti filtre edin ve etil asetat ve 200 ml ile yıkanır.
      6. İki fazlı çözelti ayınn ve etil asetat, 200 ml (3 kez), sulu tabaka yıkayın.
      7. Na 2 SO 4 Organik tabaka, bir iki atomlu silika pedi içinden aktif kömür 5 g, filtre eklemek, ve düşük basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar buharlaştırılır.
      8. dietil eter ekleyin ve bir spatula ile karıştırılmıştır.
      9. Katı filtre edin ve kirli beyaz bir katı madde 4.85 g.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7.97 (d, 1 H, J = 8.7 Hz), 7.94 (bs, 1 H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5.05 (s, 2H), 4.67 (ddd, 1 H, J = 8.7, 5.4, 2.7 Hz), 3.40 (t, 1 H, J = 5.4 Hz,), 3.09 (dd, 1 H, J = 5.4, 2.7 Hz).
    4. [(S) -2-oxoazetidin-3-il] -amonyum asetatın hazırlanması.
      1. Etil asetat 245 ml asetik asit 0.93 ml içinde çözülür. Bu işaretle "çözümü yakalama."
      2. Etanol içinde 298 ml [(R) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat - benzil- N 3.28 g çözündürülür.
      3. sikloheksadien 14.1 ml ve karbon üzerinde% 10 Paladyum 3.27 g ekleyin.
      4. 12 saat boyunca oda sıcaklığında süspansiyon karıştırılır, ve daha sonra silisli toprak pedinden geçirilerek filtre. tuzaklama solüsyonu doğrudan akıtılarak sıvı dökün.
      5. 35 ° C'nin altında tutularak, indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında çözücüyü buharlaştınn.
      6. tetrahidrofuran ile elde edilen katı toz haline getirin ve beyaz bir katı, 1.72 g.
        1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 7.68 (bs, 1 H), 3.99 (ddd, 1 H, J = 5.2, 2.4, 1.2 Hz), 3.32 (t, 1 H, J = 5.2Hz), 2.79 (dd, 1H, J = 5.2, 2.4 Hz), 1.90 (s, 3H).
  3. Hazırlanması undek-10-inil-N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat
    1. 10 ml'lik bir yuvarlak tabanlı şişe içinde, kuru diklorometan ve 2 ml [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] amonyum asetat, 60 mg çözülür.
    2. Bir buz banyosu içinde 0 ° C'ye soğutulur ve çözelti N 81 ul, N-diizopropiletilamin damla damla ilave edin.
    3. Kuru diklorometan ve 2 ml undek-10-inil 2-oksopiridin-1-karboksilat ihtiva eden ham bir karışım içinde 350 mg çözülür çözeltisine ekleyin ve 15 st için oda sıcaklığında karıştırılmıştır. indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar solvent buharlaşır.
    4. Kolon kromatografisiyle (silis jel), otomatik bir kolon kromatografisi cihazı kullanılarak saflaştınlır:
      1. Silis jel üzerine absorbe örnek sikloheksan ile sütun dengeye ve kartuşa örnek yüklemek.
      2. 0 ila 0: 100 ila sikloheksan / etil asetat ile elüte 100 ve test tüpleri üzerinde tepe toplar.
      3. indirgenmiş basınç altında (rotasyon buharlaştırıcısı) altında kuruyana kadar bileşiğe tekabül eden fraksiyonların çözücü buharlaştırılmakta ve beyaz bir katı, 40 mg elde edilir.

CC Reaktiflerin 2. Hazırlık

  1. Etiket-azit Moleküllerin 5 mM'lik bir stok çözeltisinin hazırlanması
    1. dimetil sülfoksit, 0.5 ml (DMSO) içinde azid PEG3-Fluor 545 1.5 mg eritin. -20 ° C'de 0.5 ml mikrosantrifüj tüplerine alikotları ve mağaza sağlayın.
    2. DMSO, 0.5 ml azid PEG3-Biotin 1.1 mg çözülür. -20 ° C'de 0.5 ml mikrosantrifüj tüplerine alikotları ve mağaza sağlayın.
  2. Tris, 50 mM stok çözeltisinin hazırlanması (2-karboksietil) fosfin (TCEP)
    1. 1 ml su içinde TCEP 14.3 mg eritin ve taze her zaman bunu yapmak.
  3. CuSO 4 50 mM Çözeltisinin Hazırlanması · 5H 2 O
    1. Cam bir şişe içinde, 12 çözülür1 ml su içinde CuSO 4 · 5H 2 O .48 mg. en fazla bir ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza ediniz.
  4. Tris 83.5 mM stok çözeltisinin hazırlanması: [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA)
    1. Cam bir şişe içinde, DMSO 200 ul TBTA 8,85 mg çözülür. en fazla bir ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza ediniz.
  5. (Kullanımdan hemen önce) TbTa hazırlanması 1.7 mM Çalışan Çözüm
    1. Bir cam şişeye 83.5 mM TBTA 20 ul ekle ve DMSO 180 ml seyreltin.
    2. Tert-butanol ve vorteks 800 ul ekleyin.

CFA ile tedavi Sıçanların Pençe Dokusunda 3. NAAA İfade Analizi

NOT: erkek Sprague-Dawley sıçanları, 175-200 g ağırlığında ve hayvanların etik kullanımı için kurallarına uygun olarak tüm işlemleri gerçekleştirmek. Evin 12 saat aydınlık / karanlık döngüsünde havalandırılan kafeslerde sıçan ve onlara yiyecek ve su ücretsiz erişim sağlar. CF protokolü içinBir tedavi, 7 gün CFA uygulamasından sonra Bonezzi ve ark., 29 kullanın hayvanlar tarafından yayınlanan makalesine bakın.

  1. ARN14686 intravenöz olarak uygulanması
    1. araç (% 15 PEG ve% 15 Tween tuzlu su çözeltisi) içinde ARN14686 eritin. Sıçan ağırlığı (doz 3 mg / kg, enjeksiyon hacmi 5 ml / kg) 'e uygun bir çözücü konsantrasyonunun, hesaplayın.
    2. Üç saf üç CFA ile tedavi edilen sıçanlarda IV enjeksiyonu ile devam edin. uygun bir plastik emniyet cihazı, her sıçan yerleştirin. Daha sonra, damar genişlemesini sağlamak için 2-4 dakika için ılık suda sıçan kuyruğu yerleştirin ve kuyruk damarından bileşiği iv enjekte edilir.
    3. Sadece taşıyıcı ile yapılan üç sıçan (naif CFA ile muamele edilmiş), iv enjekte edilir.
  2. Paw Toplama ve Diseksiyon
    1. Sonda veya araç uygulamasından sonra CO 2 inhalasyon 4 saat ile sıçan Kurban ve bir neşter kullanılarak diz eklemi üzerinde onları 0.5 cm keserek onların pençeleri toplamak.
    2. Dikkatle makas destekli diseksiyon ile deri kaldırmak ve kemik onları kazıma yumuşak dokuları teşrih. kemikleri atın ve pençeleri yumuşak dokuları toplamak. -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza ek bileşen dondurularak örnekleri.
  3. Pençe Homojenizasyon ve lizozomal protein hazırlanması
    NOT: CC reaksiyonu inhibe gibi, deterjanlar ve amin içeren tamponlar kullanmaktan kaçının.
    1. Fosfat tamponlu tuz (PBS, pH 7.4) ve bir proteaz inhibitör kokteyli (Malzeme / Reaktif Tablo) 4 ml 320 mM sukroz bunları (bölüm 3.2.1 de tarif edildiği gibi elde edilmiştir) 3 sıçandan pençe doku birleştirin ve homojen; yüksek performanslı dağıtma aracı kullanmak (Malzeme / Reaktif Tablo).
    2. 4 ° C'de 1,000 x g'de 20 dakika boyunca doku Homojenat santrifüje tabi tutulur; süpernatant kaydedin.
    3. Ekle 2 PBS içinde 320 mM sükroz ml doku topağı, proteaz inhibitör kokteyli veBir kez daha homojenleştirin.
    4. 4 ° C'de 1,000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj ve adım 3.3.2 den birine süpernatant ekleyin.
    5. 4 ° C'de 12,000 x g'de 30 dakika boyunca toplanan yüzey maddeleri santrifüjleyin.
    6. PBS iki hacim pelet ve tekrar süspansiyon tartılır (yani, pelet, her 100 mg, 200 ul). 1.5 ml'lik bir toplama tüpüne transfer edildi ve 1 saat için -80 ° C'de dondurun.
    7. örnekleri çözülme ve -80 ° C'de 1 saat boyunca tekrar dondurma.
    8. dondurma / eritme devri iki kez daha tekrarlayın.
      Not: Bu adım proteinini çözünür hale getirmek üzere tasarlanmıştır. gerektiğinde gece boyunca dondurun.
    9. 4 ° C'de 100,000 x g'de 1 saat boyunca santrifüje. çözünür lizozomal protein içeren süpernatant toplayın ve pelet atın. -80 ° C'de saklayın veya hemen protein ölçümü ile devam edin.
    10. Bir BCA protein tahlili 30 ticari kit kullanılarak protein içeriği ölçmek (bakınız Materyal / Reaktif Tablo ), üretici talimatlarına göre.
    11. kullanılana kadar -80 ° C'de örnekleri saklayın.
  4. Azid PEG3-biotin ile CC
    NOT: CC ve streptavidin boncuk zenginleştirme (3.4-3.6 adımlar) protokolü hafifçe Speers ve Cravatt 31 tarafından yayınlanan protokolü modifiye edilmiştir.
    1. probe- ve araç ile tedavi edilmiş farelerde (naif CFA ile tedavi edilen sıçan) lızozomal proteinlerinin 500 ul (PBS içinde 1 mg / ml) hazırlayın.
    2. Streptavidin agaroz,% 50 bulamaç 40 ul ön temizlemeden örnekler 4 ° C 'de, 1 saat boyunca (kullanımdan önce 1 ml PBS ile üç kere yıkama). 4 ° C'de 1000 x g'de, 4 dakika için santrifüj ve üstteki sıvı kısmı alınır.
    3. Azid PEG3-biotin ve vorteks bir 5 mM stok 11.3 ul ekle.
    4. taze hazırlanmış TCEP ve vorteks 50 mM stok 11.3 ul ekleyin.
    5. 50 mM CuSO 4 11.3 ul 1.7 mM TBTA yeni hazırlanmış çalışma çözeltisi karışımlar 34 ul · 5H 2 O stok.
    6. Bir önceden karıştırılmış TBTA / CuSO 4 · 5H 2 O çözeltisi ve vorteks 45.3 ml ekleyin.
    7. 2 saat boyunca 25 ° C'de reaksiyon inkübe (daha uzun bir enkübasyon süresi, tepkime etkilemez). Bu aşamada protein yağış dikkat edin. inkübasyondan ilk saat sonra karıştırın.
  5. Aşırı CC Reaktiflerin çıkarılması
    1. 4 ° C'de 6500 x g'de, 4 dakika boyunca santrifüj örnekler ve supernatant çıkarın.
    2. sonication (bir sonda sonikatör ile 5 sn) tarafından soğuk metanol ve tekrar süspansiyon 750 ul ekleyin.
    3. 4 ° C'de 6500 x g'de, 4 dakika için numune santrifüj ve bir şırınga ve bir iğne kullanılarak supernatant çıkarın.
    4. (Sonication gerekli değildir) iki kez adımı tekrarlayın 3.5.2.
    5. Son yıkamadan sonra, 5 saniye için, protein pellet ve sonikasyon 3x PBS içinde sodyum dodesil sülfat (SDS),% 2.5 325 ul ekle.
    6. 65 ° C'de 5 dakika boyunca numune ısıtın ve sonikasyonkazanç.
    7. Oda sıcaklığında 6500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj ve süpernatantı kaydedin.
    8. % 0.5 SDS seyreltilmesi için PBS 1.4 ml ilave edilir. -20 ° C'de saklayın veya streptavidin zenginleştirme ile devam edin.
  6. streptavidin Zenginleştirme
    1. PBS ile 4.2 ml'ye aşama 3.5.8 'de elde edilen numunelerin hacmi getirmek. bir kesim sonu ucu kullanılarak streptavidin agaroza% 50'lik bir bulamacın 40 ul ekle (kullanımdan önce 1 ml PBS ile üç kere yıkama).
    2. rotasyonlu oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya bırakılır ve daha sonra 1,400 x g'de 2 dakika süre ile santrifüjlenir.
    3. Boncuk pelet ve sütun dönmeye ml bir 1 boncuk aktarmak için artık süpernatant kullanmak kurutma olmadan süpernatantı (Malzeme / Reaktif Tablo).
    4. % 1 (PBS içinde), SDS 3x 1 ml (PBS içinde) 6 M üre, 3x 1 ml PBS içinde 4x 1 mL yerçekimi ile yıkayın.
    5. PBS kullanımı 2x 500 ul, oda sıcaklığında 1400 x g'de 2 dakika süre ile 1.5 ml tüp ve santrifüj boncuk aktarmak. Yavaşça bir şırınga ve iğne ile süpernatant aspire.
    6. 95 ° C'de 32, 15 dakika, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca yıkama tamponu 25 ul (6 M üre, 2 M tioüre,% 2 SDS, 6 mM biyotin, PBS içinde tümü) eklenerek reçineye bağlı proteinler Zehir.
  7. protein Blot
    1. (: 9 ml 0,5 ml 1 M Tris-HCI pH 6.8, 5 ml% 20 SDS, 5 mg Bromofenol mavisi, 3 ml gliserol, ve H2O 9 ml) ekleyin 6x Laemmli tamponu 5 ul ekle kullanımdan hemen önce,% 5 β-mersaptoetanol eklenir. Kısaca bir% 4-12 poliakrilamid jel içine elde edilen süpernatant reçine ve yük 25 ul pelet 2.000 xg'de örnekleri santrifüj.
    2. Imalatçının talimatlarına 33 uygun bir kurutma zar üzerinde jel elektroforezi ve protein transferini gerçekleştirir.
    3. Bir bloke edici tampon, 10 ml 1 saat boyunca kurutma membran Doymuş% 0.1 Tween-20 ihtiva eden (Materyal / Reaktif Tablo).bu arka plan artırabilir olarak, süt kullanmaktan kaçının.
    4. % 0.05 Tween-20, PBS içinde 10 ml zarın yıkanması ve fluoresan streptavidin 10 ul oda sıcaklığında tamponu artı% 0.1 Tween-20 de 1 saat bloke 10 ml (Malzeme / Reaktif tabloya bakınız).
    5. bir kez PBS ile tek başına (10 dk), PBS içinde% 0.05 Tween-20 ile 4 kez yıkayın.
    6. Bir görüntü tarayıcı kullanın (Malzeme / Reaktif Tablo). Enstrüman ve bağlı bilgisayarda açın. hazır olana kadar bekleyin.
    7. satın alma programını başlatın ve floresan modunu seçin. membran alanını seçin ve kaydedilen dosyalar için hedef klasörü seçin.
    8. Aşağıdaki toplama parametreleri ayarlayın: 680 nm uyarma uzunluğu, BPFR700 filtresi, (kanal 2), ve 25 mikron piksel boyutu 1.000 V photomultiplier tüp (PMT) değeri. görüntü kazanır.

Floresan Micros tarafından Fare Akciğerler katalitik olarak aktif NAAA 4. Yerelleştirmekopya

NOT: 8 ila 10 haftalık fareler erkek ve hayvanların etik kullanımı için kurallarına uygun olarak tüm işlemleri gerçekleştirmek. House 12 saat ışık / karanlık döngüsünde havalandırılan kafeslerde fareler ve onlara yiyecek ve su ücretsiz erişim sağlar.

  1. Farelerde ARN14686 intravenöz olarak uygulanması
    1. araca ARN14686 çözülür:% 15 PEG ve% 15 Tween-20 tuzlu su çözeltisi. Fare ağırlığı (doz 3 mg / kg, enjeksiyon hacmi 5 ml / kg) 'e uygun bir çözücü konsantrasyonunun, hesaplayın.
    2. 3 farelerin iv enjeksiyonu ile devam edin. Uygun bir plastik tutma cihazına her fare yerleştirin. Daha sonra, damar genişlemesini sağlar ve kuyruk damarından bileşiği iv enjekte 2-4 dakika için ılık suda fare kuyruğu yerleştirin.
    3. Sadece araç ile 3 fareler iv enjekte edilir.
  2. Akciğer Toplama ve Dilim Hazırlık
    Uyarı: Davlumbaz dikkatle paraformaldehid Kulp, ve eldiven giymek!
    1. chlo ile fareler anesteziral hidrat (/ kg, 400 mg) eklenmiştir. Bir ayak tutam anestezi onaylayın. aşağıdaki gibi bir transcardial perfüzyon gerçekleştirin:
      1. Yüzeysel makasla ventral deri kesme ve torakal ve periton zarı yüzeyleri açığa.
      2. Yüzeysel sadece xiphoid süreci altında, makasla periton membran kesti ve diyafram ve visseral organları maruz kalmaktadır. önemli damarsal lacerate için dikkatli olun.
      3. bir lateral diğerine diyaframın keserek göğüs boşluğu açın.
      4. otomatik bir şırınga pompasına bağlanan 25 G iğne takın ve fosfat tamponu içinde 60 mi% 4 PFA (0.1 M, pH 7.4) ve ardından% 0.9 tuzlu su çözeltisi 20 ml demlenmeye.
    2. perfüzyon tamamlandıktan sonra, forseps kullanarak kalbi çekin ve dikkatlice dışarı incelemek. forseps ile trakea kavrayın ve makas kullanılarak içinden tamamen kesti. Yavaşça yukarıya doğru trakea römorkör ve göğüs kafesine gelen akciğerleri kaldırın. için doku teşrihsoldan sağa akciğer ayırın.
    3. Postfix'i soğuk 2-metilbütan 1 saat dondurularak örnekleri için paraformaldehid% 4 doku ve -80 ° C'de saklayın.
    4. Bir Kriyostat kullanarak 40 mikron bölümleri toplayın slaytlarda hemen takar (bir her beşinci) ve aşağıda ayrıntılı olarak immünohistokimya için onları süreci.
  3. Doku Dilimleri Permeabilization ve Engelleme
    1. PBS (5 dakika boyunca 2x) ile yıkanır ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100, PBS ile geçirgenliği.
    2. PBS (5 dakika boyunca 2x) ile yıkanır ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 3 sığır serum albümini (BSA) ile bloke eder.
    3. PBS (5 dakika boyunca 2x) ile yıkayın ve CC ile devam edin.
  4. Doku Dilimleri Azid-PEG3-Fluor 545 CC
    1. 1 ml çözelti için bölüm 2'de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır CC reaktifleri karıştırarak bir solüsyon hazırlanır, ekleyin: Azid-PEG3-Fluor 545 (5 mM stok) 2 ul, TCEP 20 ul (taze 50 mM stoc hazırlanank) TbTa içinde 58,8 ul (taze) CuSO 4 · PBS 2 O (50 mM stok) 5H, ve 900 ul 20 ul 1.7 mM çalışma çözeltisi hazırlanır.
    2. bölüm 4.2 göre hazırlanmıştır doku dilimleri, CC karışımı yaklaşık 400 ul ekleyin. CC karışımı seçilen hacmi dilimleri karşılamak için yeterli olduğunu dikkat edin. ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
    3. PBS (5 dakika için 1x), soğuk metanol (5 dakika süre ile 1 x), PBS içinde% 1 Tween-20 ve 0.5 mM EDTA (2 dakika için 3 x) içindeki bir çözeltisi ve PBS (5 dakika için 1 x) ile yıkanır.
    4. Hava kuru, DAPI ile antifade mountant bir damla ekleyin (bkz Malzeme / Reaktif Tablosu) kapak fişleri (kabarcık oluşumunu kaçınarak) ile yakın ve cila ile mühür. analize kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.
  5. Görüntü edinme
    1. 546 nm ve 450 nm uyarma lazer ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanmak için aşağıdaki (Malzeme / Reaktif Tabloya bakınız)Kullanım kılavuzu.
    2. NA = 1.40 ile 60X objektif lens seçmek göz mercekleri ile slayt önizleme emin ve ilgi alanına odaklanmak için.
    3. Numune ve ekipmanları özelliklerine göre satın alma parametrelerini belirler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

ARN14686 NAAA önleyicisi ARN726 skafold göre tasarlanmıştır. ARN726 4-bütil-sikloheksil grubu, bir C9 doymuş alifatik zincirdir, bir terminal alkin etiketi (Şekil 1) taşıyan ile ikame edilmiştir. alkin etiketi bir flüorofor ya da CC yoluyla biyotin molekülü eklemek için iki aşamalı bir etiketleme prosedürü kullanımını sağlamak amacıyla tanıtıldı. Bu özellik, in vitro ve in vivo olarak NAAA prob için çok yönlü bir araç AR...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Enzim aktivitesi ince RNA transkripsiyonu, protein sentezi, protein translokasyon, post-translasyonel modifikasyon ve protein-protein etkileşimi dahil olmak üzere farklı seviyelerde düzenlenir. Genellikle, enzim ifadesi tek başına faaliyeti hesaba katmaz. ABPP kendi doğal yapısında proteinlerin aktivitesi çalışma için geliştirilmiştir. İki özellik gereklidir: kovalent olarak ilgi bir enzim ve bir raportör etiketi aktif sitesine bağlanan kimyasal bir sonda prob etiketli enzim tespit etmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1’-sulfonyldiimidazole Sigma Aldrich367818Harmful
2-dipyridylcarbonateFluorochem11331Harmful
2-MethylbutanSigma AldrichM32631Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridineSigma Aldrich107700Toxic
Acetic acidSigma Aldrich695092Flammable, Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich34998Flammable, Toxic
Activated charcoalSigma Aldrich161551
Ammonium chlorideSigma AldrichA9434Harmful
Azide-PEG3-BiotinJena BiosciencesCLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545Jena BiosciencesCLK-AZ109
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23227
Bio-spin columnsBiorad732-6204
BiotinSigma AldrichB4501
Blocking bufferLi-Cor Biosciences927-40000
β-mercaptoethanolSigma AldrichM6250Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA)Sigma AldrichA7030
Bromophenol blueSigma AldrichB0126
Bruker Avance III 400Bruker
CeliteSigma Aldrich419931Health hazard
Ceric ammonium nitrate Sigma Aldrich22249Oxidizing, Harmful
Chloral hydrateSigma AldrichC8383Higly toxic
CuSO4.5H2O Sigma Aldrich209198Toxic
CyclohexadieneSigma Aldrich125415Flammable, Health hazard
CyclohexaneSigma Aldrich34855Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
DichloromethaneSigma Aldrich34856Harmful, Health hazard
Diethyl etherSigma Aldrich296082Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Acros Organics348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6)Sigma Aldrich175943
EthanolSigma Aldrich2860Flammable, Harmful
Ethyl acetateSigma Aldrich34858Flammable, Harmful
GlycerolSigma AldrichG5516
Irdye 680-LT StreptavidinLi-Cor Biosciences925-68031
IRDye680-LT Streptavidin Licor925-68031Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
MethanolSigma Aldrich34966Highly toxic
MethanolSigma Aldrich34860Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma AldrichE7750Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamineSigma AldrichD125806Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamideSigma Aldrich227056Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-SerineFluorochemM03053Harmful
Nikon A1 confocal microscopyNikonRead the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelThermo Fisher ScientificNP0335BOX
Palladium on carbonSigma Aldrich330108
p-anisidineSigma AldrichA88255Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehydesigma Aldrich441244Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol) Sigma AldrichP3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI Thermo Fisher ScientificP36931Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktailSigma AldrichP8340
Sodium bicarbonateSigma AldrichS6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma AldrichL3771Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride Sigma Aldrich452912Flammable
Sodium sulfateSigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 immage scannerFUJIFILMRead  the user manual
Streptavidin agaroseThermo Fisher Scientific20349
SucroseSigma AldrichS7903
Tert-butanolSigma Aldrich360538Toxic, flammable
TetrahydrofuranSigma Aldrich186562Flammable, Harmful, Health hazard
ThioureaAcros Organics424542500Toxic, warm at 50 °C to dissolve
TrisSigma AldrichRDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)Sigma AldrichC4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)Sigma Aldrich678937
Triton-x100Sigma AldrichX100Toxic
Tween-20Sigma AldrichP9416
Tween-80Sigma AldrichP1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizerIKA
Undec-10-yn-1-olFluorochem13739Harmful
UreaSigma AldrichU5378Toxic, warm at 50 °C to dissolve

Referanslar

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 117faaliyet tabanl protein profillemefaaliyet tabanl probkimya t klay n K acylethanolamine Asit amidazinflamasyonfloresan mikroskopiIn situ Yerelle tirme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır