Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Özet

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Özet

Uygun nöronal gelişim ve fonksiyon gelişen ve yetişkin beyin ön koşuldur. Bununla birlikte, kompleks nöronal ağların son derece kontrollü oluşumu ve bakım altında yatan mekanizmaları tam bugüne kadar anlaşılamamıştır. Sağlıkta ve hastalıkta nöronlar ile ilgili açık sorular insan ile ilgili patolojiler, örneğin, Alzheimer hastalığı ve Şizofreni soruşturma temel gelişmeyi anlamaktan çeşitli ve kapsamlıdır. Nöronların en ayrıntılı analizi, in vitro olarak yapılabilir. Ancak, nöronlar hücreleri talep ve uzun vadeli hayatta kalmak için astrositlerin ek desteğe ihtiyacı vardır. Bu hücresel heterojenlik nöron ve astrositlerin analizini incelemek amacıyla çelişmektedir. Fiziksel olarak ederken, aynı burada kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam paylaşan saf birincil nöronlar ve astrositler, uzun süreli birlikte yetiştirme için izin veren bir hücre kültürü tahlil mevcutayrıldı. Bu ayarda, kültürler en fazla dört hafta boyunca hayatta ve tahlil nöron glia etkileşimine ilişkin araştırmaların bir çeşitlilik için uygundur.

Giriş

Geçtiğimiz yıllar içinde, nöroglia fonksiyonunun genel yorumlama nöronal fonksiyonu ¹ ile ilgili aktif bir düzenleyici rolüne yönelik bir sadece destekleyici bir atıf dönüşmüştür. Çünkü sağlık ve hastalık ² beyin homeostazisi üzerindeki belirgin etkisi, astrositler bilimsel topluluk için özel bir öneme sahiptir. Son birkaç yıl içinde, çalışmalar çeşitliliği in vivo ve in vitro ³ nöron-glia etkileşimlerine odaklanmıştır. Ancak, kültür sistemlerinin çoğu, her iki hücre tiplerinin ayrı bir analiz için ve ilgili secretomes arasında izin vermez.

Çeşitli yaklaşımlar uzun ömürlü sağkalım ve fizyolojik ilgili nöronal ağ geliştirme ^4-6 ulaşmak için nöronların ve glia doğrudan kültürleştirilmeye istifade eder. Fiziksel olarak ⁷ ayrı iki hücre tipleri tutarken mevcut protokol aynı hedefleri ulaşır. conditione karşılaştırıldığındad orta sistemimiz nöronlar ve astrositler arasındaki çift yönlü iletişimi çalışma sağlar, ^8,9 yaklaşır. Hücreler paylaşılan ortam içinde olgunlaşmak ise salgılanan sinyal molekülleri ekspresyonu izlenebilir. Astrositler ve böylece sinir hücresi büyümesini düzenleyen, sitokinler, büyüme faktörleri ve hücre dışı matris moleküllerinin ^10,11 gibi çözünür faktörlerin, serbest ve ^7,12 fonksiyonu olarak fırsat ilişkindir. Nedenle, in vitro olarak, retinal bez hücrelerin trombospondin eklenmesi sinaps ¹³ oluşumunu uyardığını ortaya konmuştur. Bununla birlikte, diğer henüz bilinmeyen faktörler ¹³ fonksiyonel sinaps oluşturmak için gereklidir. Ayrıca, astrositler tarafından yayımlanan moleküller nöron glia etkileşimleri temelini anlamak için tespit edilmelidir.

Fare ve sıçan primer nöron ve astrositler ekimi önce ^14-16 tarif edilmiştir. buradadolaylı kokültürünün yaklaşımla hem hücre tipleri birleştirmek için zarif ve çok yönlü bir araç sunuyoruz. iki kültür fiziksel ama aynı ortam, nöronlar, astrositler ve çözünür moleküllerin etkisi, dövme ayrılmış olması nedeniyle, ayrıca bu şekilde nöron glia etkileşim çalışmaları için güçlü bir araç sunar analiz edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

fareler ile deneyler hayvancılığın Nörobilim kurallarına Alman Hukuku ve Alman Derneği ile uyumluydu. Ruhr-University Bochum hayvan bakımı ve kullanım komiteleri uygun izinleri verdiniz.

1. Hazırlık ve Kortikal Astrositler Yetiştiriciliği

Not: nöronlar hazırlanır önce astrosit kültürleri birleşen mono tabakaları haline gerektiği gibi, sonraki adımlara geçmeden önce protokolü en az 7 gün, bu adımları tamamlayın. Primer astrosit doğum sonrası gün (P) 0-3 etrafında fare yavrular elde edilen karışık bir glial kültürlerden elde edilir. T75 şişesi başına üç beyinleri (6 korteks) kullanılmalıdır.

1. steril koşullar altında,% 10 h / h at serumu ve% 0.1 hacim / hacim gentamisin içeren Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) ilave etmek suretiyle astrosit hazırlarlar. 2 hafta boyunca 4 ° C 'de orta saklayın.
2. Coat 3x T75 wi şişeleri% 6 hacim / hacim _CO2 varlığında 37 ° C'de en az 1 saat boyunca, (hücre kültürü dereceli su içinde PDL) 10 ug / ml poli-D-lizin Th. Kaplamadan sonra, bağlanmamış katyonları çıkaracaklardır, ve 9 ml astrosit orta eklemek için fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez şişeler yıkayın.
3. beyin hazırlanması için, (bağımsız olarak kullanılacak beyin sayısı), 10 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) bir 15 ml tüp 1x 10 santimetrelik bir petri tabağına ve 1 mL HBSS 1x ekle. cerrahi makas, 2 ince forseps bir çift ve işlem için ulaşılabilecek bir Dürbünü tutun.
4. cerrahi makas ile hızlı bir şekilde 3 yavrular başını kesmek ve boş 10 cm çanak başkanları toplamak.
   1. binoküler altında korteks hazırlanmasını gerçekleştirin. İki ince forseps kullanarak, göz hizasına doğru boyun yukarı başlayarak, orta hatta kafatası dorsal cilt kaldırın. Bundan sonra, onun kan damarları ile beyin kafatası altında görülebilir.
   2. forseps bir çift ile rostral sonunda baş düzeltmek ve arka sonunda başlayarak, kafatasının orta hat insizyon. Daha sonra, beyin açığa hakkı ve kafatasının sol yarısını off klibi.
   3. forseps ucu kapatın ve beyin altında ventral konumlandırmak. Kafatasının dışında beyin kaldırın ve HBSS dolu 10 cm Petri kabı içine aktarın. Tüm beyinleri tabağı içinde toplandı kadar kalan örnek ile aynı şekilde devam ediniz.
5. beyinleri topladıktan sonra, bir makas gibi forseps bir çift kullanarak arka beyin kapalı kısma korteks ayrılması ile başlar. forseps bir çift ile iki hemisfer arasında bir orta hat kesi gerçekleştirin. Dikkatli bir forseps ile beyin düzeltmek ve Ortabeyin kesti ve ikinci forseps kullanarak koku ampuller kortikal yarısı ile sonuna kadar.
6. forseps bir çift bir kortikal yarısını düzeltmek ve f bunları ayırarak hemispheres gelen meninksler soymayanal kenar rom ve daha sonra ikinci bir forseps kullanarak kortikal yüzeyinden çekerek.
7. çanak aşağı doğru yönlendirilmiş yüzeyi ile kortikal yarısını çevirin; dikkatle incelemek ve forseps bir çift kullanarak hilal şeklinde hipokampus kaldırın. Tek bir korteksi taşımak için bir kapalı forseps kullanılarak konik 15 ml tüp içine tek korteks aktarın.
8. Steril laminer akış kaputu tüm korteks, geçiş toplama ve kortikal doku ayrışması için hazırlıklarını başladıktan sonra.
9. 2 ml reaksiyon tüpüne 1 ml DMEM ilave edin ve h papain (30 birim) w /% 0.1 ekleyin. Bir açıklık çözeltisi (yaklaşık 3 dk) gelişene kadar 37 ° C'de bir su banyosu içinde süspansiyon inkübe edin. 0.24 mg / ml L-sistein ve 20 ug / ml DNAz ekleyin ve yavaşça çalkalayın.
   Not: sindirim, enzim çözeltisi, yaklaşık 1 ml gereklidir.
10. ilave edilmeden önce 1 ml steril bir çözelti elde etmek için filtre (0.22 um gözenek boyutu)kortikal doku. (Bir su banyosu içinde, örneğin,) 37 ° C'de 1 saat - 30 dakika boyunca inkübe _edin.
    NOT: 1.11 Adımları - 1.14 kritik ve 15 dakika içinde tamamlanmalıdır.
11. Sindirim reaksiyonu sonlandırmak için, 1 ml astrosit ortamı ilave edin ve dikkatli bir şekilde 1 mL pipet kullanılarak sindirilmiş doku Karışım. toz haline için, hafifçe böylece aspirasyon ve kortikal doku süspansiyonu ekstrüzyon, pipet pistonu hareket ettirin.
12. Doku, tek bir hücre süspansiyonu içine ayrışmış sonra, 216 x g'de 5 dakika boyunca 5 ml astrosit orta ve santrifüj ekleyin.
13. Elde edilen pelet dikkatlice süpernatant aspirat ve 1 mL astrosit ortamda hücrelerin tekrar süspansiyon.
14. 9 ml astrosit ortamı (1.2) ile doldurulan T75 balonlarına hücre süspansiyonları ekleyin.
15. % 6 hacim / hacim _CO2 varlığında, bir inkübatörde 37 ° C'de inkübe hücreleri. 4 gün sonra, (ilk tam orta değişikliği gerçekleştirmek10 mL) eklenmiştir. 3 D - Daha sonra, kültür ortamı, her 2 değiştirin.
16. Hücreler konfluent tek tabaka oluşmuş varsa 7 gün sonra kontrol edin. Kültürün tam izdiham ulaşılana kadar 3 gün - Değilse, başka bir 2 için bekleyin.
    NOT: Astrositler büyük düzleştirilmiş hücre gövdeleri görüntülemek şişenin dibinde lokalize ve önemli hücresel süreçleri ortaya çıkmaz. Onlar tek tabakalı ¹⁷ üstünde bulunan küçük faz-kontrast parlak progenitör hücreler ve mikroglia farklıdır.
17. sırayla progenitör hücrelerin kurtulmak ve saf astrosit kültürü elde, bir orbital çalkalayıcı üzerinde T75 şişeler yerleştirmek ve 250 rpm'de kültürleri O / N sallamak. Sıcaklık, 37 ° C arasında ve şişeye filtre _CO2 buharlaşmasını önlemek için laboratuar tipi film ile kapatılmış olduğundan ayarlanmış olduğundan emin _olun.
18. Sonraki gün, Elimina 20 uM sitosin-1-β-D-arabinofuranosid (AraC) ile doldurulan 10 ml taze kültür ortamı aspire orta ekleyinte kalıntı bölünen hücreler.
    Not: 2 araC inkübasyon - 37 ° C'de inkübatör içinde 3 gün,% 6 _CO2 saf astrosit kültürü ile sonuçlanacaktır.
19. ışık mikroskobu altında görsel inceleme ile astrosit kültürlerinin saflığı izleyin. Artık faz-kontrast parlak progenitör hücrelerin ve mikroglia hala astrositik tek tabakalı ¹⁷ üstünde bulunuyorsa, tekrar 1.18 ve 1.19 adımları (adım 1.16 bakınız).
    Not: konfluent ve saf astrosit mono tabakalar bir sonraki aşamaya geçmeden önce inkübatör içerisine 14 D (37 ° C,% 6 hacim / hacim _CO2) muhafaza edilebilir. orta yarısı her 3 d değiştirin. Bu hücreler depolama prosedürü yoluyla nöronal destekleyici özelliklerini kaybeder olarak, toplamak, dondurma ve astrositler çözülme etmeyin.

Dolaylı kokültürü 2. hazırlanması Astrositler

Not: 48-72 saat cel nöronların transfer astrositler hazırlamadan öncel-kültür ekleri. Genel olarak, tek bir T75 şişesi bir preparat elde nöron hücreleri desteklemek için yeterli hücre sayısını verir.

1. 24-iyi-tabak içine gerektiği kadar ekler yerleştirin. Ceket, 37 ° C'de yaklaşık 1 saat boyunca 10 ug / ml PDL (hücre kültürü dereceli su içinde çözülmüş) ile birlikte her bir delik,% 6 hacim / hacim _CO2. İnkübasyondan sonra, PBS ile iki kez uçlar yıkayın. Bu arada, astrositler hazırlanması devam edin.
   Not: astrosit hücre süspansiyonu kullanıma hazır olana kadar, PBS ile doldurulmuş uçlar tutulabilir.
2. (AraC) ile astrosit orta aspire ve kalan serum kaldırılır sağlamak için 10 ml PBS ile bir kez kültür yıkayın.
3. Şişelere% 0.05 tripsin-EDTA (etilendiamintetraasetik asit), 3 ml ilave edilir ve yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C'de,% 6 hacim / hacim _CO2 de trypsinization hücreleri inkübe edin.
4. Bir mikroskop ve facilita kullanarak görsel muayene ile hücre dekolmanı kontrolMasaüstünde karşı matara yan dokunarak hücrelerin dekolmanı te.
   NOT: 2.5 Adımları - 2.8 kritik ve 15 içinde bitmiş olmalıdır - 20 dakika.
5. Tripsinizasyonu takiben hafifçe 7 ml astrosit orta hücrelerin yeniden askıya ve 15 ml tüp hücre süspansiyonu aktarın. 216 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
6. Süpernatantı dikkatlice aspire ve 1 mL astrosit ortamında hücre pelletini.
7. Bir sayma odacığı kullanarak hücreleri sayın.
8. 500 uL astrosit ortam maddesi ile 24 oyuklu plaka deliklerinin taban doldurun ve her bir ekin içine 500 uL astrosit ortamı içinde 25,000 hücre transfer edin. 37 ° C'de,% 6 hacim / hacim _CO2 de kültür inkübe edin.
   NOT: 42 Sonra - 72 saat kültürleri yaklaşık% 100 izdiham ulaşacaktır. Bu aşamada kültür saflığı ¹¹ immunositokimya ile doğrulanabilir. konfluen kültürlerin geçmeden kadar 7 gün boyunca muhafaza edilebilirSonraki adım. orta yarısı her 3 d değiştirin.

Birincil hippokampal nöronlar 3. hazırlanması

Not: Birincil fare hipokampal nöronları E15.5 elde edilmelidir - zamanlanmış gebe farelerin E16 embriyoların.

1. W /% 0.6 nöron ortamı (10 mM sodyum piruvat ile MEM,% 0.1 w / v ovalbümin,% 2 hacim / hacim olarak B27 ortamı takviyesi ve% 0.1 v / v gentamisin (steril filtre edildi)), ve hazırlama ortamı (HBSS hazırlanması h glukoz ve 10 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazin etansülfonik asit)). Pre-sıcak ve önceden dengeye 37 ° C'de,% 6 hacim / hacim _CO2 filtre şişelerinde nöron orta.
2. 24 kuyulu plakalara ait kuyucuklar içerisine cam lamelleri (12 mm çapında) yerleştirilir (hücre kültürü ekler ile kullanım için çentiklenir özel lamelleri kullanımı).
   1. 37 ° C'de su (hücre kültürü dereceli) 15 ug / mL poli-DL-ornitin ile en az 1 saat boyunca kaplayın. sağlamak için oyuk başına en az 500 ul kullanınlamelleri tamamen kaplıdır. PBS ile iki kez kuyu yıkayın. hücreleri kaplama kadar kuyu PBS bırakın. kuyu kurumaz emin olun.
3. Hippocampi incelemek için, hazırlık ortamı ile doldurulmuş 3x 10 cm yemekleri ve 1 mL hazırlık ortamı ile 1x 2 ml tüp hazırlayın. makas ve 2 ince forseps hazırlayın.
4. , Servikal dislokasyon ile hamile fare Kurban% 70 v / v etanol ile yıkanarak karın sterilize ve keskin bir makas kullanarak karın açın. makasla dikkatlice boncuklu rahim tüketim ve hazırlık ortamı ile doldurulmuş 1x 10 cm çanak içine organı aktarın.
5. Sonra, rahim embriyolar kaldırmak. Dikkatle rahim insizyon ve 2 forseps kullanarak embriyolar zarar vermeden amniyon çıkarın. Bundan sonra, bir makas ile her bir embriyo başını kesmek ve hazırlık ortamı ile birlikte ikinci bir 10 cm çanak içine başlarını aktarın.
6. HAZIRLIK benzer kafaları hazırlanması (devam edin1.7) - asyon 1.4 tarif.
   1. forseps bir çift ile baş hareketsiz ve Neuraxis dik Beyin yakın boyun bölgesinde kafatası ve cilt, insizyon. böylece beyin açığa kafatası ve kaplama cilt hem kaldırın ve baş rostral sonuna doğru yumuşak kafatası kap bükmek için forseps ikinci bir çift kullanın.
   2. 2 forseps yardımıyla, kafatası boşluğunda beyin ayırın. Bu forseps, 1 yakın çift yapmak ve koku ampuller başlayan ve Beyin doğru hareket kafatası beyin ayırmak için. Hazırlık ortamı ile dolu başka bir 10 cm'lik çanak içinde beyinleri toplayın.
7. astrosit hazırlanması (adım 1.6) için yukarıda tarif edildiği gibi korteks parçalarının hippocampi teşrih. Her yarımkürede hippocampi çıkarın ve hazırlık ortamı ile doldurulmuş 2 ml tüp onları toplamak.
8. diseksiyon tamamladıktan sonra, steril bir laminer akış tezgah ve Diges tüp transferi1 ml Sindirim solüsyonu papain içeren hipokamp dokusunda t. Adım 1.9 açıklandığı gibi sindirim çözüm hazırlayın - 1.10 ama MEM yerine DMEM kullanın.
   NOT: 3.9 Adımları - 3.12 kritik ve 10 içinde tamamlanması gerekmektedir - 15 dakika.
9. sindirim tamamlandıktan sonra, dikkatlice bir pipet ile hafif bir emme yoluyla sindirim çözümü çekme.
10. ardışık olarak ilave edilmesi ve daha sonra dikkatli bir şekilde, yıkama döngüsü başına 1 ml taze kültür ortamı aspire hippocampi nöron ortamı ile 3 kez yıkayın. hücre süspansiyonu santrifüj etmeyin.
11. Son yıkama aşamasından sonra, dikkatli bir şekilde 1 mL nöron ortam içinde doku Karışım.
12. Bir sayma odacığı kullanılarak hücrelerin sayısı ve 24 oyuklu bir plaka (3.2 belirtilen plaka) tek bir oyuk başına 500 uL nöron ortamı içinde 35,000 hücre plaka.
    Not: İsteğe bağlı olarak, hücre tümböleni hücre hazırlama canlılığını değerlendirmek için tripan mavisi ile zıt olabilir. Görsel kontrol ile kaplama yoğunluğunu kontrol(- Standart 10X objektif görme alanı başına 110 hücreleri genellikle 90) iyon mikroskobu kullanılarak.
13. 37 ° C'de, 1 saat boyunca% 6 hacim / hacim _CO2 inkübatörde yer nöronlar.
14. , Inkübasyon yayınla hazırlanan ekler almak kuluçka (birleşen astrosit mono tabakaları ile tohumlanmış) (adım 2.8 bakınız). astrosit orta aspire ve 500 ul taze nöron ortamı ile değiştirerek orta alışverişinde bulunurlar.
    NOT: ekler 2'den sonra birleşik astrosit tek tabakaları liman olmalıdır - 3 DIV (İn Vitro Gün).
15. dikkatle steril forseps kullanarak nöron kültürleri (3.13 adım) ihtiva kuyulara astrositler ile ekler yerleştirin.
16. 37 ° C'de,% 6 hacim / hacim _CO2 geri inkübatöre elde dolaylı nöron astrosit kokültürü yerleştirin.
    NOT: Bu koşullar altında, nöronlar tam olarak tanımlanmış ortam içinde 4 hafta için yetiştirilebilir. Hiçbir orta değişikliği gerekli. Uzun süre kültürleri için, e doldurmak için tavsiye edilir24 oyuklu bir plaka buharlaşmayı azaltmak için steril su ile mpty kuyu.
17. Gerçekleştirmek in vitro hücre analizleri sonra kültür dönemleri istenen (örneğin, immünsitokimya, PCR, Western Blot, elektrofizyolojik kayıtlar (yama kelepçe veya multielectrode dizi) için) ^7,15,18.
    NOT: kültür sistemi, aynı zamanda kültürler ¹¹ akut ve kronik farmakolojik tedavisi için uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Dolaylı Coculture sistemiyle nöronal kültürler analizi çok yönlü ve kültür olgunlaşma farklı aşamalarında gerçekleştirilebilir. Hücrede 4 hafta boyunca muhafaza edilebilir olması kültürlerin uzun dönem araştırmalar mümkündür.

Şekil 1 orta sol panelde şematik birlikte üretim kurulumunu göstermektedir. astrosit tek katmanlı (üst sol panel) ve nöronal ağın (sol alt panel) faz kon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Paylaşılan ortamda bunları korurken mevcut protokolün temel amacı, tamamen ayrı nöronal ve astrositik kültürler etmektir. Bu nedenle, elde edilen kültürlerin saflığı prosedürü başlangıcında kontrol edilmelidir. Biz nöronal belirteç olarak nöron-spesifik tubulin, nörofilament veya Neun proteininin kullanılmasını tavsiye, GFAP astrositik işaretleyici olarak, oligodendrosit öncüsü işareti ve Iba1 protein olarak O4 antijen mikroglia tanımlamak için.

protokol krit...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
B27	Gibco (Life Technologies)	17504-044
Cell-culture-grade water	MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768	CAUTION: H317, H361
DMEM	Gibco (Life Technologies)	41966-029
DNAse	Worthington	LS002007
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1397	CAUTION: H317-334
Glucose	Serva	22700
HBSS	Gibco (Life Technologies)	14170-088
HEPES	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Horse serum	Biochrom AG	S9135
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C-2529
MEM	Gibco (Life Technologies)	31095-029
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A7641	CAUTION: H334
Papain	Worthington	3126
PBS	self-made
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P0899
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P3655
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636
Trypsin-EDTA	Gibco (Life Technologies)	25300054
Equipment
24-well-plates	Thermoscientific/Nunc	142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture)	BD Falcon	353504
Binocular	Leica	MZ6
Cell-culture inserts	BD Falcon	353095
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Counting Chamber	Marienfeld	650010
Forceps	FST Dumont (#5)	11254-20
glass cover slips (12 mm)	Carl Roth (Menzel- Gläser)	P231.1
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i
Micro-tube (2 mL)	Sarstedt	72,691
Microscope	Leica	DMIL
Millex Syringe-driven filter unit	Millipore	SLGV013SL
Orbital shaker	New Brunswick Scientific	Innova 4000
Parafilm	Bemis	PM-996
Petri dishes (10 cm)	Sarstedt	833,902
pipette (1 mL)	Gilson	Pipetman 1000
Sterile work bench	The Baker Company	Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors	FST Dumont	14094-11
Syringe	Henry Schein	9003016
T75 flask	Sarstedt	833,911,002
tube (15 mL)	Sarstedt	64,554,502
Water bath	GFL	Water bath type 1004