Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler

Özet

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Özet

Gastrulasyon gibi Drosophila olarak çok hücreli hayvanların embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen morfolojik dinamik olayların ilk kümesidir. Bu morfolojik değişim de mezenkimal geçiş (EMT) için epitel olarak kabul edilmektedir. EMT düzeninin bozulması fibroz ve kanser metastaz ile ilişkilidir. EMT, moleküler bir dizi mekanizma tarafından kontrol edilir dair yeni kanıtlar vardır. apikal daralma kontrol gibi, pek çok önemli genler de bilindiği gibi kanser metastazı gözlenen EMT önemli faktörler olduğu. Drosophila gastrulasyon sırasında EMT gibi, epitel hücreler şeklini değiştirmek için indüklenebilir ve çeşitli hücre tipleri karşı hücre kaderine yönlendirmek için yeniden programlanması. Burada embriyonik gelişimin bu aşamasında morfogenetik hücresel hareketler ve hücre kaderi kimlik başlatılmasını tahlil Drosophila gastrulasyon sağlam bir görüntüleme yöntemi sağlamaktır. Bu yöntemi kullanarak, c tespitell gastrulasyon sırasında yeniden düzenlenmesi ve GFP kullanarak gastrulasyon sırasında apikal daralma önemini göstermek DE-kaderin etiketli.

Giriş

Gastrulasyon Drosophila ^1,2 olarak çok hücreli hayvanların embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen morfolojik dinamik olayların ilk kümesidir. İlginçtir ki, delil ortaya çıkan bu süreç, mekanik ve moleküler mekanizmaları ³ arasındaki etkileşim yoluyla düzenlenir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, gastrulasyon önemli bir işlemdir mezenkimal geçiş (EMT), epitelial ayrıca kanser metastazı ^4-8 insan hastalık süreçlerine dahil edilir. Apikal daralma kontrol gibi birçok genler de bilindiği gibi kanser metastazı ⁹ gözlenen EMT önemli etkenler olarak. Böylece, gastrulasyon sırasında apikal daralma yukarıda belirtilen düzenleyici mekanizmaların araştırılması ve kanser metastazı anlayışımızı geliştirmek için mükemmel bir model. Bu tekniğin avantajı, bu nedenle, gerçek zamanlı ve gastrulasyon zamanda hücre hareketi dikkate ki, biz olacakkanser metastazı yanı sıra gastrulasyon rol oynayan genleri ekrana mümkün.

Nispeten bilinmeyen, ancak, hücre-hücre yapışması apikal daralma ¹ merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. Drosophila genetiği iyi düzenleyici moleküler mekanizmaları keşfetmek tek bir hücre düzeyinde araştırmaları için uygundur. Bu model gastrulasyon sırasında apikal daralma önemini ortaya çıkarmak için bize sağlayacaktır. Ayrıca, bu yöntem, kanser metastazı rol oynayan genleri taranması için kullanılabilir. Drosophila gastrulasyon yakalayan canlı görüntüleri daha daha ayrıntılı doku yeniden düzenleme düzenleyen moleküler mekanizmaları anlamak sağladı. Bu yazıda bunu başarmak için basit bir yöntem kapsamlı bir açıklama sağlar.

Protokol

Not: DE-cad :: GFP ^10: Bu çalışmada kullanılan transjenik sinekler şunlardır.

Elma Plate 1. Hazırlık

1. Mikrodalgada 12.5 g ağar, 125 mL% 100 ticari olarak temin elma suyu, 12.5 g glikoz ve 375 mL _H2O ısı karışımının bir karışım hazırlayın ve 3 cm hücre kültürü çanağı içine dökün. ileride kullanım için 4 ° C'de karışım saklayın.
2. elma plakasını hazırladıktan sonra, sinekler yumurta bırakmaya izin bunun üzerine yoğrulmuş maya hamur ince bir tabaka ekleyin.

2. Embriyo Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Protokolü

1. dostum ve daha sonra yoğrulur maya kaplı bir elma plaka üzerinde bir gecede yumurtlamak için bir şişe yaklaşık 50 sinekler (25 erkek ve 25 kadın) yerleştirin. Şişenin ağzında elma suyu plakasını ayarlayın. baş aşağı bir kuluçka şişesi bulundurun. Inci istemi için alüminyum folyo ile plastik Drosophila stok şişeleri Wrape daha fazla yumurta bırakmaya uçar.
2. Ertesi sabah, bir yenisi ile eski elma suyu plakasını değiştirin.
3. sinekler alüminyum folyo ile sararak şişeyi 3 ila 4 saat süreyle yumurtalarını edelim.
4. Üç dört saat sonra, bir fırça veya pamuk feci kullanarak elma suyu plaka embriyo süzgeç embriyolar toplamak ve PBS ile yıkayın. 12 oyuklu kültür tabaklarında embriyo PBS ile 2 veya 3 kez daha yıkanır.
5. 12-Kaynak kültür tabağı içindeki 5 dakika için% 50 çamaşır suyu ile embriyolar Dechorionate.
6. dechorionation işleminden sonra, PBS ile embriyolar, 2 ila 3 kez daha yıkanır.
7. PBS basıp evre kendi sınırları şeffaflık seviyesine göre mikroskop altında 5 embriyoları içeren bir 3 cm hücre kültürü çanak embriyolar aktarın. 200 uL pipet kullanarak aşamalı embriyolar pipetle.
8. Sonra, bir cam lamel seçilen iki embriyo yerleştirin ve ince bükülmüş kağıt mendil ile aşırı PBS kaldırmak. yukarı embriyolar dorsal yüzü yönlendirmekince bükülmüş kağıt mendil kullanarak lamel. Bundan sonra, ince bir iğne ve bükülmüş kağıt mendil kullanarak silikon gres ile cam lamel embriyolar takın.
9. slayt altındaki biraz boşluk bırakarak, embriyolar üzerinde halokarbon yağı 700 küçük bir damla ekleyin ve baş aşağı girintili slaytta embriyoları içeren lamel yerleştirin.
10. Konfokal görüntüleme sistemi, bir Argon / 488 lazer ve bir yağ daldırma objektif (63X) ile embriyolar inceleyin.
    NOT: Uygun gelişim aşamasında embriyo belirlenmesi gastrulasyon olayın görüntülerini yakalamak için önemlidir. Bu koşullar altında, neredeyse tüm embriyolar analiz embriyo bir yetişkin olarak geliştirmek için daha fazla kültür edilebilir en az bir aşama 14 kadar normal gelişim gözlemleyin.

Sonuçlar

Burada, Drosophila embriyo gastrulasyon olaylarını ve embriyo hazırlama prosedürünün genel bir bakış (Şekil 1) göstermektedir. Hücre zarları DE-kaderin :: GFP ve hücre hareketlerinin canlı görüntüleme Drosophila gastrulasyon sırasında yapılır (Şekil 2) kullanılarak etiketlenir. DE-kaderin GFP sinekler bize hücre yapışma kavşakları görselleştirmek için izin beri, biz apikal hücre şekli ve bu sistemi kullanarak har...

Tartışmalar

Although we have previously reported a similar procedure to capture live images of the gastrulation process in Drosophilla¹, the method we describe here is detailed and easy to trace endogenous cadherin expression and thus is quite useful for genetic screening of key factors involved in gastrulation. To maximize success with this imaging procedure, it is essential to use an indented slide. Mechanical pressure sometimes causes embryonic death. Therefore, it is also important to handle the embryos as ge...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma	MKBH 5726
Vacuum grease Silicone	Beckman	335148
Glass coverslip	Matsunami glass	Thickness No1	24 - 36 mm
Embryo stariner	Corning	Corning3477
Plastic Drosophilla Stock Bottles	Hitec	MKC-100
DE-Cadherin knock-in flies			REF (10)