Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Özet

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Özet

Zika Virüsü (ZIKV), mikrosefali, göz kusurları, ve bozulmuş büyüme gibi fetal gelişim anomalileri bağlı ortaya çıkan bir patojendir. ZIKV Flaviviridae ailesinin bir RNA virüsüdür. ZIKV esas sivrisinekler tarafından iletilir, ama aynı zamanda fetal dikey geçiş yanı sıra cinsel temas için maternal tarafından yayılır. Bugüne kadar, virüs tarafından enfekte olanlar korumak için hiçbir güvenilir tedavi veya aşı seçenekleri vardır. tekrarlanabilir etkili Zika virüsü enfeksiyon hücre kültür sisteminin geliştirilmesi ZIKV çoğaltma gibi aşı ve ilaç geliştirme moleküler mekanizmalarının incelenmesi için kritik önem taşır. Bu bağlamda, virüs üretimi ve büyüme analizi için bir memeli hücresi bazlı in vitro Zika virüs kültür sistemi açıklayan bir protokol burada rapor edilmektedir. viral titresi ölçmek için bir hücre tek ve plak deneyi ile ilgili Zika virüsünün plakların oluşumu ile ilgili ayrıntılar sunulmaktadır. Viral genomun replikasyonu kinetiğive çift kollu bir RNA genomu replicatory ara belirlenir. Bu kültür platformu, interferon-a (IFN-α) tanımlanmasında ortaya çıkan küçük sitokin kümesinin bir kütüphanede karşı ekran için kullanılmıştır, IFN-β ve Zika viral büyüme potent inhibitörleri olarak, IFN-γ. Özetle, bir in vitro enfeksiyon Zika viral kültür sistemi ve çeşitli virolojik deneyler büyük ölçüde daha viral patogenez mekanizmaları ve viral virulans evrimini durulaştırmada araştırma toplum yararına potansiyeline sahip bu çalışmada, ortaya konmuştur. Antiviral IFN-alfa ayrıca enfekte hamile kadınlar da dahil olmak üzere yüksek riskli toplumlarda Zika virüs enfeksiyonları için profilaktik, maruziyet sonrası profilaktik ve tedavi seçeneği olarak değerlendirilebilir.

Giriş

Zika Virüsü (ZIKV) mikrosefali ve kötü gebelik ^1,4 çıktıları ile ilişkili önemli bir patojendir. ZIKV gibi Dengue, Batı Nil, ve St Louis ensefalit virüsleri gibi nörolojik bozukluklara neden olabilir tıbben ilgili flavivirüslerin kümesine aittir. Viral başlıca bulaşma ek olarak, cinsel iletim de ^5,6 rapor edilmiştir, sivrisinek vektörü Aedes aegypti tarafından ve. ZIKV nedeniyle sivrisinek vektör genişleyen coğrafi dağılımı ve doğum kusurları ile güçlü korelasyon büyük bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir. ZIKV ilk Zika ormanda bir sentinel rhesus maymun 1947 yılında izole edilmiştir, Uganda ve ilk insan olgusu 1952 ^7,8 bildirildi. ateş, döküntü, baş ağrısı, konjunktivit ve kas / eklem ağrısı gibi hafif belirtileri olan mevcut ZIKV ile enfekte bireyler. Enfekte hamile kadınlar gelişmekte olan fetus ^1'e ZIKV iletebilir. ZĐKV enfeksiyonu da Guillain-Barre sendromu, periferik sinir oto-immün demiyelinasyon hastalığı ⁹ ile bağlantılı olmuştur.

Zika viral genomun uzunluğu yaklaşık 10.8 kilobaz olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA molekülü içerir. genomun yapısı, bir protein-kodlama bölümünü eteklendiren kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCR) ile 5'NCR-Cı-prM-e-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3'NCR olarak düzenlenmiş ^6. Tek bir poliprotein (3419 aa) o eş ve post-translasyonel 10 daha küçük peptidler halinde bölünmüş olan çevrilmiştir. 5'NCR ve 3'NCR RNA kök döngü yapıları Hem viral genomun çeviri ve replikasyon başlamasından kritik bir rol oynar. genomun yapısal bileşenleri kapsid, membran ve zarf proteinlerinin oluşmaktadır. yapısal olmayan proteinleri genom replikasyonu için kritik öneme sahiptir.

Şu anda, Zika viral suşları üç ana genotipler ayrılır: Batı AfrikaDoğu Afrika ve Asya ^6,10-13. Bu teklif edildiğini daha sonra daha ¹² gelişti Batı Afrika ve Asya'ya yayıldı Doğu Afrika soy. Asya genotip Amerika'da mevcut salgınlar sorumludur. Zika virüsü sivrisinek ve memeli hücrelerinde hem de kültürlenebilir. Primer dermal fibroblastlar, olgunlaşmamış dendritik hücreler, kortikal nöral projenitör hücreleri, Vero hücreleri, Zika viral enfeksiyona ^10,14,15 duyarlıdırlar. Hem tip I ve tip II interferonlar cilt fibroblastlar ¹⁵ ZIKV büyümesini sınırlamak için gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, bir memeli hücre kültür sistemi, üretim ve Asya genotip ZIKA virüs tipi PRVABC59 deneyleri için aşamalı bir ayrıntılı protokol sağlamak ve ilaç geliştirme ortamı olarak, bu enfeksiyon kültür sisteminin kullanılmasını göstermek için vardır. Bu kaynak büyük ölçüde daha i aydınlatmak için Zika viral ve nörolojik araştırma toplum yararına potansiyeline sahipViral patogenez ve viral virulans evrimi ts mekanizmaları.

Protokol

Not: iş akışının şematik taslağı Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Hücreler

1. Zika virüs üretimini ve viral replikasyon döngüsü analizi için Vero hücreleri kullanır.
2. Tam,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 birim / ml), streptomisin ihtiva eden büyüme ortamı (100 birim / ml) ve 10 mM HEPES hazırlayın.
3. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de belirtilen tam büyüme ortamı ile kültür Vero hücreleri.

2. Zika Virüs Üretimi

1. T-75 balonuna% 0.25 tripsin kullanılarak% 80 hücre yoğunluğunda Vero hücreleri hasat ve hücreleri saymak.
   1. T-75 kültür şişelerinde ortamı aspire ve 2 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkayın.
   2. % 0.25 tripsin 2 ml ilave edilir ve 5 dakika için 37 ° C 'de balon inkübe edin.
   3. Tripsin etkisiz hale getirmek için bir büyüme ortamı içeren serum 8 ml ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı suspend hücreler 15 ml tüp hücreleri transferi vb.
   4. hücrelerin 10 ul çıkarın ve% 0.4 tripan mavisi eşit miktarda karıştırın. hücre sayım odası slayt hazırlanan karışımı yükleyin ve otomatik kan sayım cihazının kullanıldığı sayımları canlı hücre elde.
2. T-160 şişesi içine 30 ml hacim içinde 7.000.000 hücre toplam tohum.
3. Ertesi gün, şişesi başına 10 ml serum serbest kültür ortamı Zika virüs inokulum (0.1 İçişleri Bakanlığı 0.01) enfeksiyon uygun bir çokluğu hazırlar.
4. T-160 şişesi harcanan Ortamı çıkarın ve taze hazırlanmış viral inoculum (10 mi) ilave edin.
5. 4-6 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de inoküle şişeleri inkübe edin. yavaşça her saatte yan şişeleri eğerek inokulum yayıldı.
6. İnkübasyonun tamamlanmasından sonra, her şişenin sıcak serum desteklenmiş büyüme ortamı (30 mi) ile inokulum değiştirin. Ardından bir sonraki 96 saat boyunca viral kültür devam ediyor.
7. içinde ilerlemesini doğrulamaBir faz kontrast mikroskobu kullanarak ve 40X ve 200X büyütmede gerektiği gibi görüntüleri (Şekil 2) almak hücre tek tabaka viral plakların görünümünü gözlemleyerek Fection.

Şekil 2:. Çeşitli büyütme Vero hücrelerinin bir tek tabaka üzerinde Zika virüs tarafından oluşturulmuş Plaklar Aydınlık alan ve görüntüler 48 HPI de Zika virüs plakları göstermektedir. tek tabaka yuvarlak hücre odakları varlığını unutmayın. (Ölçek çubuğu = 50 um) bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

8. 96 saat zaman noktasında ve santrifüj 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de süpernatan hasat hücre kültürü süpernatanları hücre debrisini uzaklaştırmak için.
9. Dikkatle rahatsız pelet haline enkaz ve transfer t olmadan süpernatant kaldırmak15 ml tüpler o. 24.000 xg, ultra santrifüje (isteğe bağlı), viral parçacıklar konsantre gerçekleştirilebilir.
10. -80 ° C 'de birden fazla alikotları viral kültür süpernatanlarının saklayın.

Plak Testi ile 3. Ölçme Zika Virüs Titre

1. 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 ml hacim içinde oyuk başına 1 x 10 ⁵ hücre Tohum naif Vero hücreleri.
2. Ertesi gün, serumsuz ortam kullanılarak T-160 şişesi toplanan virüs kültürü yüzen maddelerinin seri seyreltil 10 kat hazırlar. Her harcanan medyayı iyi çıkarın ve üç kopya halinde Vero hücrelerinde üzerine hazırlanan inokulum 400 ul ekleyin.
3. 37 aşılandı şişeler inkübe 4-6 saat boyunca% 5 _CO2 ile ° C. yavaşça her bir saatte yana plaka eğerek inokulum yayıldı.
4. İnkübasyonun sonunda, serum takviye ortamla inokulum (oyuk başına 2 mi) değiştirin.
5. 48 saat sonrası aşılama at, bir faz Contr kullanılarak viral odağını saymakast mikroskop. ml başına plak oluşturucu birim (pfu) gibi viral titresi hesaplanır. Plak analizi için Şekil 3'e bakınız.
6. Düzeltmek ve plakların açık bir görünüm için% 20 etanol içinde hazırlanmıştır% 4 formaldehit hücreleri ve% 0.1 kristal mor çözelti leke.

4. Zika Viral genom replikasyonu Deneyi

1. 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 mi hacminde göz başına 1 x 10 ⁵ hücre Tohum saf Vero hücreleri. üç kopya halinde serumsuz ortam kullanılarak, düşük ve yüksek titresi, Ertesi gün, viral inokulum (400 ul / göz, 0.01 ve 0.1 arasında MOI) hazırlanması. sahte enfeksiyon için, serumsuz ortam (400 ul / göz) kullanın.
2. 3.4 adımları 3.2 tekrarlayın.
3. 48 ve 96 saat zaman noktalarında, RNA ve immunositokimya (ICC) için numune toplayın.
   1. hasat RNA örnekleri için, ortamı çıkartın ve sonra lizatları iyi doğrudan her lizis çözeltisi 400 ul ekleyin ve toplamak.
   2. ICC, medya ve t kaldırmakTavuk her bir metanolün 1 mi ekleyerek hücreleri düzeltmek ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe plakası.
   3. hücre lizatından, üreticinin talimatlarına göre, bir RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole eder. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA sayısal olarak.
4. Hasat RNA'dan ZIKV genom içeriğini belirlemek için, iki aşamalı bir ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) uygulayın.
   1. RNA nın ters transkripsiyonunu için, ilk olarak, 0.2 ml tüp içinde izole edilmiş RNA 5 ug, dNTP (10 mM) 1 ul, 1 ul rastgele heksamer (250 ng) içeren bir 13 ul reaksiyon karışımı ayarlayın. 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir tüp inkübe ve daha sonra bir dakika süreyle buz üzerine yerleştirin. Daha sonra, ters transkriptazın 1 ul 5x iplik sentez tamponu 4 ul 0.1 M ditiyotreitol ve 1 ul ve reaksiyon karışımı RNaz inhibitörü 1 ul ekle. 50 ° C ve inactiv 60 dakika, ardından 25 ° C'de ek 5 dakika boyunca tüp inkübe15 dakika boyunca 70 ° C'de ısıtılarak reaksiyon yedi.
   2. qPCR 2x yeşil boya süper karışımı 12.5 ul içeren DNA polimeraz ve Zika virüsü [için Zika virüs pan-genotip primerler (spesifik 10 mM bireysel primerlerin 1 ul sonuçlanan cDNA 1 ul kullanarak gerçekleştirin: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), Zika virüsü Asya genotip PRVABC59 soyu primerler (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], ya da hepatit C virüsü (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') için veya hücresel ev bakıcısı geni GAPDH (: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3'), bir 25 ul reaksiyon hacmi içinde.
   3. çalışma durumunu 15 sn için 95 ° C, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde 30 sn (40 döngü) 60 ° C ile PCR gerçekleştirin.
   4. Z normalleştirmek için döngü eşiğe göre (Ct) değeri GAPDH ifade düzeyini kullanmakika viral genomun ölçümü. GAPDH kıyasla Zika genomunun delta Ct (ACt) değerini hesaplayın ve 2 ^ACt değerini elde. Daha sonra, belirtilen zaman noktalarında enfekte olan ve olmayan hücreler arasında normalize Zika genom içerik oranı alınarak kat değişimi hesaplamak. ZIKV genom çoğaltma sonuçları için bakınız Şekil 4.
5. metanol sabit hücreler kullanılarak ICC gerçekleştirin.
   1. (PBS içinde% 0.1 Triton-X 100,% 3 keçi serumu,% 3 BSA) 1 x PBS ile sabitlenmiş hücreler üç kez yıkayın ve ICC bloke tamponu ile bloklayın.
   2. bloke edici tampon içinde 100 ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe: 1 seyreltme fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2 (1 ug / ml) kullanın.
   3. 1x hücrelerin PBS ile yıkayın ve 1 de ikincil antikor keçi anti-fare IgG-594 (1 ug / ml) ekleyin: bloke tamponu içinde 1.000 seyreltme ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edin.
   4. Hoechst boyası kullanılarak çekirdekleri için 1x PBS ve leke hücreleri yıkayın ve100X büyütmede bir floresan mikroskop (Şekil 4) kullanarak hücrelerin gözlemleyin.

Zika virüs enfeksiyonuna karşı sitokin kütüphane tarama 5.

1. De 12 oyuklu plaka kullanılarak göz başına 1 x 10 ⁵ hücre naif Vero hücreleri tohumu. Hücreler (6 saat Ekim sonrası) birleştirildikten sonra, biyolojik çiftleri belirtilen konsantrasyonlarda (2 ml hacim / oyuk) her bir sitokin ekleyin. Araç (PBS) tek başına kontrol içerir.
2. 12 saat tedavi sonrası, Zika viral enfeksiyon (kuyu başına 0.1 400 ul İçişleri Bakanlığı) gerçekleştirin. enfeksiyon (sahte) olmadan negatif kontrol kuyuları yer alır.
3. 4 saat sonrası enfeksiyon, sitokin muamele ortam (2 mi) ile, viral aşının değiştirin. Ek 44 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
4. 48 saat sonrası enfeksiyon, bir faz kontrast mikroskop kullanılarak viral plaklar sayısı ve 40X büyütmede (Şekil 5) ile enfekte hücrelerin temsili görüntüler elde.

Sonuçlar

Bir Zika viral suşu, Asya genotip (PRVABC59 GenBank erişim numarası KU501215) Bu çalışmada ¹² kullanılmıştır. % 80 birleşme Vero hücreleri de novo Zika viral enfeksiyon araştırmak için kullanıldı. Viral üretiminde ve daha sonra virolojik karakterizasyonu için, erken geçit (P3) Zika virüsü kullanılmıştır. Viral plaklar enfeksiyon ikinci gününde gözlendi. Başlangıçta enfekte olan hücre serbest Zika, viral yavrularıyla tek tabakalı kül...

Tartışmalar

Burada, in vitro Zika virüsü kültürü için bir aerodinamik protokol sunulmuştur. Virüs kültürü genişleyen titresi ölçmek ve sağlanan genom replikasyonu ölçülmesi için en uygun uç noktalarının belirlenmesi de dahil olmak üzere kritik adımlar. Zika virüsü enfeksiyon ajanlarını işlerken, biyogüvenlik prosedürleri sıkı takip edilmelidir, bir insan patojeni, yani. Bir maymun böbrek hücre çizgisi, Vero çeşitli virolojik ölçümlerde göstermek için kullanılmıştır. Zika viral...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red	Corning	25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	T10282
Countess – Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Countess-cell counting  chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10283
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fischer	4471088
RNase-Free DNase	Promega	M6101
Vero Cell Line	ATCC	CCL-81
Zika viral strain PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6	Peprotech	200-06
IL-1 alpha	Peprotech	200-01A
TNF-alpha	Peprotech	300-01A
Interferon alpha A	R & D Systems	11100-1
Interferon beta	Peprotech	300-02BC
Interferon gamma	Peprotech	300-02
Centrifuge 5415R	Eppendorf	5415R
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI	Nikon	Visit Nikon for Request