Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

Özet

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Özet

Bu hücre görüntüleme ve uzaktan işleme gibi birçok önemli Biyomedikal uygulamalar, süperparamanyetik demir oksit nanopartiküllerinin (SPIONs) ile hücrelerin etiketlenmesi yoluyla elde edilebilir. SPIONs yeterli hücresel alımını sağlanması geleneksel SPIONs yükseltilmiş konsantrasyonlarda hücrelerin teşhir ederek ya da (72 saat kadar) pozlama süreleri uzatan tarafından karşılandı edilmiş bir sorundur. Bununla birlikte, bu stratejiler toksisite aracılık muhtemeldir. Burada, protein bazlı spion magnetoferritin sentezini yanı sıra düşük maruziyet konsantrasyonları kullanılarak hızlı hücre mıknatıslanma sağlayan basit bir yüzey fonksiyonlandırmalar protokol mevcut. magnetoferritin arasında spion çekirdek at dalak apo-ferritin boşluğunun içine 8.2 mil mineralize bir ortalama parçacık çapına sahip kobalt katkılı demir oksit içerir. magnetoferritin kimyasal Katyonikleştirme olarak inkübasyon süreleri kullanarak bir roman, insan mezenkimal kök hücreleri manyetize yüksek zar-aktif spion (hMSCs) üretildi0.2 mM olarak alçak olarak bir dakika ve demir konsantrasyonları kısa.

Giriş

bağlayıcı yüzeyin veya süperparamanyetik demir oksit nanopartiküllerinin (SPIONs) arasında içselleştirme gibi görüntüleme ve uzaktan manipülasyon gibi uygulamalar için hücre tiplerinin çeşitli mıknatıslanmayı sağladı. ¹ Ancak, yeterli hücresel mıknatıslanma elde spion ve hücre yüzeyi arasındaki etkileşimin zayıf olduğu, özellikle zor olabilir. Geçmiş, uzun süreli maruz kalma veya yüksek spion konsantrasyonlarda ² bu zorluğu aşmak için stratejiler olarak istihdam edilmiştir. Bu toksisiteyi ^5,6 artırmak ve lenfositler gibi düşük içselleştirme oranları, hücre tipleri çok sınırlı başarı için ^3,4 Bununla birlikte, bu stratejiler sorunludur. ⁷ SPIONs hücresel alımı arttırmak için, çeşitli yüzey işlevsellik yaklaşımlar araştırılmıştır. Spesifik olmayan alım transfeksiyon A kullanılarak elde edilebilir olsa da, örneğin, antikorlar, reseptör dolayımlı endositoz, ⁸ teşvik etmek için kullanılmaktadırGent ^9,10 veya HIV Tat-peptid gibi hücre delici türleri. Transfeksiyon ajanları nanoparçacık çökelmesine neden olumsuz yönde hücre fonksiyonunu etkileyebilir ise ^11,12 Bununla birlikte, antikor ve peptit işlevselleştirme yaklaşımları, pahalı reaktifler ve karmaşık sentetik olarak hazırlanması ile sınırlıdır. ^13,14

Biz son zamanlarda kimyasal katyonize magnetoferritin sentezini, bir dakika gibi kısa inkübasyon süreleri kullanarak mıknatıslanma insan mezenkimal kök hücrelerin son derece etkili bir roman spion (hMSCs) bildirdi. ¹⁵ Magnetoferritin demir depolama protein ferritin demineralize boşluğu içinde bir spion sulandırılması sentezlenir. ¹⁶ Bu protein bazlı spion, protein kabuk tarafından tanınan manyetik çekirdek, ^17-19 ve biyouyumluluk ve sulu çözünürlüğü manyetik özellikleri üzerinde kontrol gibi hücre manyetizasyon için uygundur yapan birçok özellikleri, birleştirir. ayrıcaDaha fazla yüzey işlevsellik nedeniyle kolaylıkla kimyasal olarak ^20-22 ya da genetik olarak tadil edilmiş olabilir adreslenebilir amino asidi elde edilir. ^23-25 Protein kabuğun asidik amino asit tortularının, kimyasal Katyonikleştirme hali hazırda, hızlı ve sürekli hücre mıknatıslanma giden hücre yüzeyi üzerinde anyonik etki alanları ile etkileşime stabil nanoparçacık oluşturur göstermiştir. Bu prosedür zahmetli işlevsellik ve uzun inkübasyon protokolleri ihtiyacını ortadan kaldırır ve non-spesifik etiketleme mekanizması nedeniyle bu hızlı mıknatıslanma stratejisi, diğer hücre tiplerinde yaygın bir uygulama bulmak gerekir. Burada, katyonize magnetoferritin sentezi, saflaştırılması ve yüzey fonksiyonlandırmalar detaylı protokoller de dahil olmak üzere ultra-hızlı hücre etiketleme yöntemi derinlemesine bir rapor sunduk.

Protokol

İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC) Bristol Southmead Hastanesi Araştırma Etik Kurulu kurallarına tam uygun (referans # 078/01) ve hasta onam alındıktan sonra total kalça protezi ameliyatı geçiren osteoartritik hastalarda proksimal femur kemik iliğinden hasat edildi.

1. Magnetoferritin sentezi ve saflaştırılması

1. Genel açıklamalar
   1. metal ön oksidasyonunu kısıtlamak için nitrojen atmosferi altında 65 ° C sıcaklıkta bir yapışmalı, çift ceketli bir reaksiyon kabı içinde magnetoferritin sentezlenmesinde. Bir şırınga pompası kullanılarak tepkime kabına kapak erişim portu üzerinden metal tuz çözeltileri ve hidrojen peroksit enjekte edilir.
   2. magnetoferritin Sentezden sonra, anyon değişim kromatografisi ile proteinin saflaştırmak boyut dışlamalı kromatografi, ardından Protein boşluğu içine alınmış nano-tanecikleri uzaklaştırmak için (bakınız bölüm 1.4), protein monomerleri izole edilmesi için (Bölüm 1.5 bakınız). deBir Bradford tahlili kullanılarak termine protein konsantrasyonu (bölüm 1.6 bakınız).
2. Hazırlık sentez öncesinde
   1. Su içinde bir azot gazı silindirine bağlanmış bulunan bir tüp yerleştirmek streç film ile bir kanalın kilitleme ve yaklaşık 60 dakika boyunca nitrojen gazı geçirilerek, iyonsuzlaştırılmış suyun 500 ml oksilenlendirilmesi.
   2. 65 ° C çift cidarlı reaksiyon kabına bağlı bir su banyosu ısıtın. yaklaşık 20 dakika boyunca bir tampon çözeltisi ile azot gazı geçirilmesi yolu ile kap ve oksilenlendirilmesi mühür, tepkime kabına, 50 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponu (pH 8.6) 75 ml ilave edilir. Aynı zamanda, manyetik bir karıştırıcı kullanarak tampon çözeltisi ilave edin.
   3. HEPES tampon çözeltisi oksijen alma sonra tampon azot gazı tedarik tüpü çıkar ve bu, bir nitrojen atmosferi korumak için kap içerisinde süspanse edin. 3 mg / m bir nihai konsantrasyon elde etmek için, apo-ferritin eklemel. Manyetik karıştırmaya devam edin, ancak köpürme meydana gelirse karıştırma hızını azaltmak.
   4. deoksijene deiyonize su, 50 ml 0.19 g çözülerek kobalt sülfat heptahidrat bir 25 mM stok çözelti hazırlayın.
   5. deoksijene deiyonize su, 100 ml 0.98 g çözülerek amonyum demir sülfat hekzahidrat solüsyonu 25 mM çözelti hazırlayın.
   6. amonyum demir sülfat hekzahidrat solüsyonu 2.5 ml alın ve kobalt sülfat heptahidrat 2.5 ml ile değiştirin.
   7. İlk deoksijene deiyonize su 9 ml (ağ / ağ% 30), bir hidrojen peroksit çözeltisi 965 ul ekleyerek ve daha sonra 99 ml için bu alt stokunun 1 ml ekleyerek deoksijene deiyonize su içinde hidrojen peroksit 8.33 mM'lik çözelti hazırlayın deoksijene deiyonize su.
3. Magnetoferritin sentezi
   1. s manyetik (aynı zamanda apo-ferritin çözeltisi içine demir-kobalt ön ve hidrojen peroksit hem de 10.1 ml enjektetirred), iki şırınga pompası kullanılarak / dakika 0.15 ml bir akış hızında (toplam hacim enjekte: 20.2 mi) eklendi.
   2. Enjeksiyon süresi boyunca deiyonize su, 500 ml oksilenlendirilmesi.
      Not: reaksiyon kabının içerikleri yavaş yavaş reaksiyon ilerledikçe, koyu kahverengi bir renk kabul eder.
   3. Kısaca, ilk enjeksiyondan tamamlanmasından önce, demir-kobalt ön ve taze deoksijene deiyonize su kullanarak hidrojen peroksit çözeltisi bir 100 ml hazırlanır.
   4. demir-kobalt ve bir hidrojen peroksit taze hazırlanmış solüsyonları kullanılarak 1.3.1 tarif edilen enjeksiyon adımı tekrar edin.
   5. Enjeksiyon süresi boyunca deiyonize su, 500 ml oksilenlendirilmesi ve 1.3.3 ve 1.3.4 tarif edildiği gibi devam edin.
   6. üçüncü enjeksiyondan sonra, karıştırılarak 15 dakika boyunca olgunlaşmaya çözeltisi bırakın.
   7. çözelti içinde serbest metal iyonlarının kenetlenmesi için tepkime kabına 1 M sodyum sitrat çözeltisi 1.5 ml ilave edilir.
   8. reaksiyonundan çözüm çıkarın50 ml santrifüj tüplerine, 4,350 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj ve 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek süpernatan geçmesi halinde damar. Bu aşamada, süzüldü üst fazı saflaştırma kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
4. İyon değişim kromatografisi
   1. 10 ml / dk bir akış oranında bir peristaltik pompa kullanılarak bir katyonik matris ihtiva eden bir kolon (20 cm uzunluğunda, 2.5 cm çapında) üzerine örnek yükleyin.
   2. 10 ml / dk bir akış oranında bir gradyan pompası kullanılarak tamponu (50 mM tris (hidroksimetil) aminometan (TRIS) tamponu, pH 8.0) içinde çalışan yaklaşık olarak 100 ml kolon yıkayın.
   3. 150, 500 ve 1000 mM son NaCl konsantrasyonu, her bir konsantrasyonu, 150 ml: protein elüt edilmesi için Tris tamponu içinde sodyum klorür (NaCl) artan konsantrasyonları ile 10 ml / dk bir sütun yıkayın.
   4. Protein, 500 mM NaCl konsantrasyonunda elüte olur olarak, otomatik bir kısım toplayıcısı kullanılarak ve 50 ml'lik kısımlar halinde, toplayın.
      NOT: İçiniyon değişim kromatografisi detaylı protokol daha önce yayınlanmış protokolleri danışın. ²⁶
5. Ebat eksklüzyon kromatografı
   1. 4 ml hacim birimi tarafından takip edilen 15 ml santrifüj filtre ünitesi kullanılarak yaklaşık 2 ml'lik bir hacme kadar magnetoferritin 150 ml konsantre edilir. Bu prosedürün detaylı bir protokol için santrifüj filtre ünitelerinin üreticinin talimatlarına (malzeme listesine bakınız) başvurun.
   2. bir enjeksiyon döngüsü kullanılarak jel süzme sütunu üzerine konsantre edildi örnek yükleyin.
   3. 1.3 ml / dakika bir akış hızında (150 mM NaCl ihtiva eden 50 mM Tris tamponu, pH 8.0) tampon maddesi ile sütunun yıkayın.
   4. otomatik bir kısım toplayıcısı kullanılarak ve 6 ml fraksiyonlar toplanır. Protein monomerleri son Zehir. Bu noktada, arıtılmış, magnetoferritin Katyonikleştirme kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
      Not: bir jel filtrasyon kolonu kullanılarak büyüklük dışlama kromatografisi ayrıntılı bir protokoldür bakınız için oncekiusly protokolleri yayınladı. ²⁷
6. Protein konsantrasyonunun saptanması
   1. ticari olarak temin edilebilen bir at dalak ferritin kullanılarak 50 mM Tris tamponu içinde 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 ve 1 mg / ml ferritin standartları hazırlayın.
      NOT: piyasada mevcut ferritin protein konsantrasyonu şişe belirtilmiştir. Değilse, bu bilgi için sağlayıcısına başvurun.
   2. Çözeltinin rengi, yaklaşık 0.5 mg / ml standart renk aynı oluncaya kadar 50 mM Tris tamponu içinde bilinmeyen bir konsantrasyon magnetoferritin örnekleri seyreltilir. seyreltme faktörü bir yere not edin.
   3. 96 gözlü bir levhanın gözleri içine üç kopya halinde her bir standart ve magnetoferritin örnek 10 ul ekle.
   4. (Bradford tahlil reaktif ayrıntılar için malzemeler listesine bakın) her kuyuya hazır Bradford reaktifi 200 ul ekleyin.
   5. 8 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
   6. Kullanılarak λ = 595 nm absorbans ölçümübir mikroplaka okuyucu.
   7. Protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak ferritin standartların ortalama absorbans Konu ve magnetoferritin numunenin konsantrasyonunu hesaplamak için doğrusal bir uyum eğim ve kesişme kullanın.
      NOT: hesaba standart eğrisine magnetoferritin örneği ayarlamak için kullanılan seyreltme faktörünü alın.

2. Magnetoferritin Katyonikleştirme

1. Genel açıklamalar
   Not: magnetoferritin Katyonikleştirme için, N, N-dimetil-1,3-propandiamin (DMPA) N- MF yüzeyinde aspartik ve glutamik asit kalıntısı elde etmek birleştirilmiştir - (3-dimetilaminopropil) - etilkarbodiimid hidroklorid (EDC) eklenmiştir.
   1. karıştırma altında oda sıcaklığında reaksiyonu yürütmek. Aşağıda verilen protokol, 5 ml (protein konsantrasyonu 2 mg / ml) 'in bir toplam hacim içinde magnetoferritin 10 mg Katyonikleştirme içindir. Ancak, yukarı veya aşağı ölçeklemeDMPA: EDC oranları tutarlı olarak tampon ve magnetoferritin çözeltisi hacimleri protein tutarak.
   2. Katyonikleştirme reaksiyonu öncesinde, 50 mM NaCl içeren 50 mM fosfat tamponu (pH 7) içine magnetoferritin örnekleri dialyze. Bu Tris elüsyon tamponunu çıkarın ve Tris amin ve EDC ile aktive edilen karboksilik asit kalıntıları arasında, istenmeyen reaksiyonları önlemek için önemlidir. diyalizden sonra protein konsantrasyonu belirlemek ve / ml önce Katyonikleştirme 4 mg ayarlayın.
2. Katyonikleştirme protokolü
   1. DMPA 374 mg tartılır ve 200 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES) tamponunda 2.5 ml içinde çözülür.
   2. konsantre edildi (6 M) hidroklorik asit (HCI) kullanılarak çözelti, pH yaklaşık 7 ayarlayın.
      DİKKAT: Davlumbaz bu adımı gerçekleştirin, DMPA'nın için asit ilavesi olarak toksik dumanlar bültenleri!
   3. 4 mg / ml'de magnetoferritin solüsyonu 2.5 ml (son yoğunlaştırmaMES trasyonu 100 mM, magnetoferritin nihai konsantrasyonu / ml toplam protein miktarı 10 mg), 2 mg olmasıdır.
   4. Bir manyetik karıştırıcı ilave edin ve 2 saat dengelenmeye karıştırılır.
   5. Dikkatle 1 M HCI kullanılarak pH değeri 5.0 çözelti ayarlayın.
   6. DMPA / magnetoferritin çözeltisine EDC tozun 141 mg ekleyin.
   7. 3.5 saat boyunca karıştırmaya devam edin.
   8. Herhangi bir çökeltileri uzaklaştırmak için 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek çözelti filtre.
   9. Diyaliz tamponu yerine bir 12-14 kDa molekül ağırlığı kesmesi ile diyaliz tüp solüsyonu ilave edildi ve 4 ° C 'de 2 gün boyunca, 50 mM NaCl içeren 50 mM fosfat tamponu (pH 7) 4 L karşı diyaliz En az üç o dönemde kez.
      NOT: Bu noktada, katyonize magnetoferritin sonraki kullanıma kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.

Katyonize Magnetoferritin ile 3. İnsan Mezenkimal Kök Hücre Etiketleme

1. Genel açıklamalar
   1. 37 ° C ve% 5 karbondioksit atmosferinde sınıf II laminer akış dolapları ve nemlendirilmiş inkübatör kullanan tüm hücre kültürü gerçekleştirin.
   2. 4 gün - tek tabakaları 175 cm ² şişe ve her 3 doldurulan kültür ortamı, 20 ml kullanılarak kültür hücreleri. Kültür ortamı 1.000 mg / L glikoz,% 10 (h / h) cenin sığır serumu,% 1 (h / h), penisilin / streptomisin solüsyonu,% 1 ihtiva eden, Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) oluşan (h / h) L alanil-L-glutamin çözeltisi ve 5 ng / taze takviye ml insan fibroblast büyüme faktörü.
2. Katyonize magnetoferritin ile hMSC Manyetik etiketleme
   1. Tohum 150,000 25 ^cm2 şişelere hMSCs ve gece boyunca 37 ° C uygun bırakın.
   2. Filtre 0.22 um'lik bir şırınga filtreden geçirilerek katyonize magnetoferritin sterilize ve protein konsantrasyonu belirlenir.
   3. steril koşullar tutulması, katyonize magnetoferri bir 0.5 uM çözelti hazırlamakfosfat, kalay tuz (PBS) tamponlu. kullanılana kadar steril bir kültürü kaputu şapkalı tutun.
   4. Oda sıcaklığında 2 ml PBS ile kaplı hücreler yıkanır.
   5. tabakalanmış hücrelere sterilize katyonize magnetoferritin çözeltisi 1 ml ilave edilir ve arzu edilen bir süre (1 dakika ile 1 saat) inkübe edilir.
   6. tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 0.5 ml ilave edildikten ve 5 dakika için 37 ° C 'de enkübe edilerek hücreler PBS ile, ve daha sonra, hasat hücreleri yıkayın.
   7. , Tripsin / EDTA inaktive 524 x g'de 5 dakika boyunca 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj çözelti aktarmak için kültür ortamı 1 ml ilave edilir.
   8. Süpernatant atılır ve fetal sığır serumu ve PBS içinde 2 mM EDTA (w / v)% 0,5 oranında içeren, 0.5 ml hücre pelletini manyetik ayırma tamponu yeniden askıya.
3. Manyetik Hücre Ayırma
   1. Çok standa mıknatıs takın ve mıknatıs manyetik ayırma sütun ekleyin. th bir ön ayırma filtresi yerleştirine sütunu.
   2. ön ayırma filtresi manyetik ayırma tampon 0.5 ml yerleştirin ve filtre ve yıkama ve onları ıslak sütununda hem aracılığıyla çalışmasına izin verin.
   3. sütununun altında bir 15 ml santrifüj tüpüne koyun.
   4. manyetik ayırma kolonu filtre haznesinde hücre süspansiyonu, 0.5 ml ilave edilir.
   5. hazne boşaldığında, manyetik ayırma tamponu, 0.5 ml ekleyin.
   6. hazne boşaldığında, manyetik ayırma tamponu ilave 0.5 ml ekleyin.
   7. Bir kez daha (1.5 mi olmalıdır yıkama için kullanılan manyetik ayırma tamponu toplam hacim) tekrarlayın. Bu yıkama adımı sütunu (non-manyetize hücre fraksiyonu) olmayan tüm mıknatıslanmış hücreleri ayrışır.
   8. Mıknatıs sütunu çıkarmak ve yeni bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne koyun. Sütun deposunun filtresini çıkartınız.
   9. hazneye manyetik ayırma tamponu 1 ml ilave edilir ve üretimi ile birlikte piston kullanılarak sütun üzerinden itme anındar. Bu santrifüj tüpüne (manyetize hücre fraksiyonu) halinde kolondan manyetize edilmiş hücreler çözülür.
   10. Santrifüj 524 x g'de 5 dakika boyunca her iki tüp.
   11. Süpernatantı atın ve 0.3 ml PBS içinde hücre pelletleri yeniden askıya.
   12. hemasitometre kullanarak her fraksiyon hücreler sayıların sayısını.
   13. Manyetize edilmiş hücrelerin oranını tespit, E (%), aşağıdaki denklem kullanılarak:
       
       N (M) manyetize edilmiş fraksiyon ve n hücre sayısı olduğu (M + NM) manyetize olmayan manyetize fraksiyonlarda hücrelerin sayısı toplamıdır.
4. Indüktif eşleşmiş plazma optik emisyon spektroskopisi kullanarak demir ölçümü için katyonize magnetoferritin ile etiketlenmiş hMSCs hazırlanması (ICP-OES)
   NOT: protokol diğer ICP-OES araçlar için adapte edilmesi gerekebilir. Yeniden danışmak tavsiye edilirmından kendiniz sorumlusunuz teknisyeni.
   1. x g'de 524 5 dakika için bir hücre bilinen numarasını santrifüjleyin.
   2. PBS Süpernatantı ve% 50 (h / h), nitrik asit, 0.25 ml ekleyin.
   3. Vortex asitleştirilmiş hücre süspansiyonu karıştırın.
   4. Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   5. Her bir numune ve vorteks karışımına damıtık su 4.75 ml ilave edilir.
   6. ICP-OES ile analiz edin. ²⁸
   7. Hücresel demir içeriğinden bir değeri belirlemek için hücre sayısı ölçülen demir normalize edilecektir.

Sonuçlar

TEM Apoferitin boşluğu içindeki nanoparçacık mineralizasyon onaylamak ve ortalama çekirdek boyutu (Şekil 1A ve 1B) belirlemek için kullanılmıştır. boyanmamış magnetoferritin örneklerinin Görüntü analizi 8.2 ± 0.7 nm bir ortalama çekirdek çapı verdi ve aurothiglükoz leke proteini kafesi içinde nanopartiküllerin varlığını doğruladı. Fotoğraflar daha düzgün nanopartikül çekirdek izole etmek için manyetik ayırma ile saflaştırılmış bir magnetoferritin örneği göstermektedir unutmayın. manyetik saflaştırılmıştır değil Magnetoferritin numuneleri biraz daha geniş çekirdek boyutu dağılımına sahiptir. Seçilen alan elektron difraksiyonu kullanılarak magnetoferritin çekirdek yapısı ²⁹ analizi mümkün manyetit göre ters spinel yapısı, bu (Fe ₃ O ₄₎ ve / veya maghemit (γ-Fe ₂ O _3), hem de gösterilen spinel yapısı Co ₃ nedeniyle O _4. Ayrıca, Raman Fe ₃ O ₄ küçük γ-Fe ₂ O ₃ miktarları ve kobalt ferrit (Şekil 1 C) atfedilen zirveleri saptandı. magnetoferritin ICP-OES analizi magnetoferritin her miligramı için kobalt 102 demir ug ve 0.9 ug ortalama göstermiştir.

Şematik bir sonraki Katyonikleştirme aşamasını (Şekil 2 A) gösteren, dahildir. dinamik ışık dağılımı ile tespit edildiği magnetoferritin ve katyonize magnetoferritin hidrodinamik çapı sırasıyla 11.8 ± 1.1 nm ve 12.5 ± 1.4 nM idi. magnetoferritin kovalent DMPA-kaplinin Katyonikleştirme etkinliği zeta Potansiyometrinin ve matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon time-of-flight (MALDI-TOF) kütle spektrometrisi ile belirlendi. Zeta potansiyeli Onay, katyonize magnetoferritin için + 8.3 mV MF -10,5 mV olarak değiştirildiPozitif (Tablo 1) negatif yüzey potansiyeli değiştirin. Kütle spektrometresi deneyleri yerli-apo ferritin ve katyonize apo-ferritin (Şekil 2 B) 21.1 kDa için 20.1 kDa alt birimi molekül ağırlığı bulundu. Bu kütle artışı yaklaşık 12 bağlanmış DMPA protein alt-birim başına moleküllerin ve tüm 24 alt birim protein 288 kalıntı Katyonikleştirme karşılık gelir.

Manyetik doygunluk ve duyarlılık KALAMAR Magnetometri kullanılarak ölçüldü ve enine ve boyuna Relaksivite manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak ölçüldü. Manyetik özellikler Katyonikleştirme kapalı spion (Tablo 1) manyetik özellikleri üzerinde önemsiz etkiye sahip olduğunu belirten magnetoferritin ve katyonize magnetoferritin için benzerdi. Bundan başka, bu özellikleri magne katyonize ^19,30 Gösteren diğer demir oksit bazlı nano benzertoferritin görüntüleme kontrast artırıcı geleneksel spion bazlı MRI kontrast ajanları olarak uygun olacaktır.

30 dakika maruz kaldıktan sonra, hücre yüzeyi yoğun katyonize magnetoferritin (Şekil 3 A) ile kaplandı. Ancak, bir hafta sonra, hiçbir nanopartiküller hücre yüzeyinde (Şekil 3 B) bulundu. Katyonize magnetoferritin manyetik markalama hMSCs de son derece etkili olduğu görülmüştür. Özellikle, bir dakika süreyle katyonize magnetoferritin hücrelerin maruz hücre popülasyonunun% 92 mıknatıslama ve hücre başına demir 3.6 ug arasında iletimiyle sonuçlandı. Tüm hücre popülasyonunun (Şekil 3 C) manyetizasyon ile sonuçlanmıştır 15 dakika inkübasyon süresi uzar.

Şekil 1: magnetof karakterizasyonu erritin çekirdekler% 5 kobalt katkılı. Aurothiglükoz (A) ve boyanmamış (B) ile boyandı magnetoferritin TEM ve görüntüler. Ankastre manyetit endeksleri ile ilgili elektron kırınımı gösterir. Ölçek çubuğu: 20 nm. Magnetoferritin (c) Raman spektrumu. Oklar kobalt ferrit (T _2g), manyetit ve maghemit (A _1g hem de) ana Raman titreşim modlarını gösterir. Kullanılan ^31,32 lazer dalga boyu 532 nm idi. (Okuda ve ark., ¹⁸ uyarlanmış Görüntü). Bu magnetoferritin örnek ayrıca eşit yüklenen magnetoferritin parçacıkları izole manyetik ayırma kullanılarak saflaştırılmıştır olduğunu not edin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

785fig2.jpg "/>
Şekil 2: magnetoferritin arasında Katyonikleştirme. A), protein yüzeyi üzerindeki asidik (kırmızı dağılımı) ve temel (sarı) amino asit kalıntılarını gösteren Çözücü erişilebilir yüzey alanı gösterimleri. (1) Magnetoferritin yüzey proteini (3) asidik amino asit kalıntısı elde etmek, DMPA karbodiimid aracılıklı çapraz bağlama ile katyonize magnetoferritin (2) için modifiye edilir. APO-ferritin ve katyonize apo-ferritin alt birimlerinin b) kütle spektrometresi analizi. MALDI-TOF tarafından üretilen kütle-yük (m / z) Apoferitin spektrumu (ApoF) ve katyonize Apoferitin (kedi ApoF). 21.1 kDa 20.1 kDa'dan bir kütle artışı Katyonikleştirme sonra gözlenir. (Correia Carreira ark uyarlanan görüntü. ¹⁵⁾ , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Manyetik etiketleme ve katyonize magnetoferritin ile inkübe hMSCs hücre ayrılması. Katyonize magnetoferritin ile 30 dakikalık bir inkübasyon sonrasında hMSCs A) TEM görüntüsü. ok yoğun hücre yüzeyi üzerinde paketlenmiş magnetoferritin çekirdeklerinin mevcudiyetine işaret etmektedir. Ölçek çubukları: 200 nm. Etiketleme sonra hMSC bir hafta B) TEM görüntüsü. hücre yüzeyi katyonize magnetoferritin açık olduğunu. Manyetik etiketleme hızını ve kuvvetini incelenmesi C) hücre popülasyonunun% 92 magnetoferritin katyonize 0.5 uM bir dakikalık maruz kaldıktan sonra manyetize edilmiş ve tüm hücre popülasyonunu 15 dakika içindeki manyetize edilmiş oldu. hücre başına demir içeriği ICP-OES ile belirlendi. Üç biyolojik çoğaltır ortalama ve standart sapma gösterilmektedir. Correia Carreira ark uyarlanmıştır (Resim. ¹5) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

	MF	Kedi-MF
Hidrodinamik çapı [nm]	11.8 ± 1.1	12.5 ± 1.4
Zeta potansiyeli [mv]	(-) 10.4 ± 0.2	8.3 ± 0.7
Manyetik doyma moment [Am 2 kg -1]	54.9 ± 1.6	55.3 ± 1.4
Kütle duyarlılık [x 10 4 m 3 kg -1]	1.75 ± 0.08	1.75 ± 0.07
Boyuna Relaksivite [mm -1 sn -1]	2.6 ± 0.1	2.3 ± 0.1
Enine Relaksivite [mm -1 sn -1]	44.6 ± 1.0	52.8 ± 0.8

Tablo 1: magnetoferritin nin fiziko karakterizasyonu (MF) ve katyonize magnetoferritin (kedi-MF). (Tablo Correia Carreira et al uyarlanmıştır. ¹⁵⁾

Tartışmalar

aurothiglükoz ile lekelenmiş magnetoferritin örnekleri TEM proteini kafes içinde nanopartiküllerin başarılı bir mineralizasyon saptandı. Elektron difraksiyon ve nanoparçacık çekirdeğin Raman analizi kobalt nanopartikül iç başarılı doping gösteren bir kobalt ferrit mevcudiyetine işaret etmiştir. Bu karma oksit nanopartiküller başarıyla apo-ferritin boşluğu içinde mineralize olabilir göstermektedir. Ayrıca, kobalt katkılama manyetik özelliklerinin ayarlama sağlayan reaksiyon karışımına ilave kobalt ön miktarını değiştirerek değiştirilebilir geçerli olduğunu göstermiştir. ¹⁸

Magnetoferritin sentezi sürece sıkıca kapatılabilir ve reaktifler (örneğin, üç-boyunlu, yuvarlak tabanlı bir şişeye) ilave edilebildiği erişim portları gibi, gemilerin çeşitli gerçekleştirilebilir. Reaksiyon sıcaklığı kabı yerleştirerek ya da 65 ° C 'de muhafaza edilmelidirÇift kılıflı bir tekne kullanılarak bir su / yağ banyosu veya. Burada, sentezi gerçekleştirmek için bir çift ceketli bir elektrokimyasal hücre bir düzenleme. Doğru pH değerini korumak ve sulu çözeltilerin oksijen kirlenmesini önlemek, başarılı sentezini garantilemek için çok önemlidir. Metal tuz çözeltileri her zaman önceden yerine kullanmak taze önce hazırlanmalıdır. Ayrıca, ticari Apoferitin çözümleri kalitesi değişir ve sentez sonucunu etkileyebilecek (örn., Nanoparçacık çekirdek mineralize boyutu). Bu üreticiler tarafından kullanılan herhangi bir artık indirgeme maddesi çıkarmak için sentez öncesinde 50 mM HEPES tamponu (pH 8.6) içine Apoferitin çözeltisi diyaliz için yardımcı olabilir. Sentezi için kullanılan apo-ferritin çözümün toplu numarasını bir yere not yapmakta fayda var, bu yüzden özellikle ek malzeme ihtiyacı satın alınacak gereken üreticiden talep edilebilir. Ayrıca, piyasada mevcut apo-ferritin protein konsantrasyonu olan can, şişe üzerinde belirtilmelidirsentezi için gerekli olan apo-ferritin çözeltinin hacmi hesaplamak için kullanılabilir. Bu durum söz konusu değilse, bu bilgi için sağlayıcısına başvurun.

Burada ve daha önceki raporlarda sunulan - - metal tuzları ve hidrojen peroksit tedricen ilave avantajı nanopartikül çekirdeğin mineralizasyon farklı yükleme faktörleri (örneğin, nanopartikül boyutları) elde edilebilir şekilde kontrol edilebilmesidir. ^33. Ayrıca, başka, örneğin, bir manyetik ayırma kolonu, bir elektromıknatıs içine tespit paslanmaz çelik tozu ile dolu bir kolon kullanılarak magnetoferritin arıtmak mümkündür. ^34. Bu nedenle, yüksek tek dağılımlı nanopartikül çekirdekleri toplu magnetoferritin numuneden izole edilebilir. Bununla birlikte, manyetik hücre etiketlenmesi için burada sunulan bu gerekli değildir. magnetoferritin sentezinin bir sınırlaması yaklaşık% 10 nispeten düşük sentez verimi, ticari apo-Fe, nispeten yüksek maliyetrritin çözümler. Ancak, apo-ferritin de kurulmuş de-mineralizasyon protokolleri takip ederek ferritin ucuza temin at dalak hazırlanabilir. ¹⁶

magnetoferritin bir Katyonikleştirme DMPA 250 molekülü ve negatif yüklü artığı başına EDC 50 moleküllerin mol oranı eklenerek elde edilmiştir (hesaplamalar at dalak ferritin amino asit sekansına dayalı olarak). protein üzerindeki reaktif bu fazlalığı, daha önce ferritin Katyonikleştirme sonuçları ile benzerdi yüksek Katyonikleştirme verimleri ile sonuçlanmıştır. MALDI-TOF analizi Apoferitin ve katyonize Apoferitin ³⁵ için magnetoferritin çekirdeğin fazla moleküler kütlesi kullanılmıştır. Yüksek Katyonikleştirme verimi elde etmek için, uygun pH değeri de önemlidir. EDC-aracılıklı çapraz bağlama hafif asidik koşullar altında daha etkilidir, ve pH değeri 5 magnetoferritin için en uygun Katyonikleştirme sonuçlar vermiştir bulundu. Bununla birlikte, diğer proteinler cationization pH optimize edilmesi gerekebilir. Bu ciddi çökelmeye neden olabilir, çünkü en Katyonikleştirme veya proteinin izoelektrik noktasına yakın kaçınılmalıdır.

katyonize magnetoferritin kök hücre mıknatıslanma yüksek verimli ve inkübasyon sürelerini çok altında 30 dakika ile elde edilebilir. Hatta bir dakikalık inkübasyon MRI T2 ve T2 * kontrast etkilemek için gereken bildirilen aralık içinde 3.6 ug, hücresel bir demir içeriği ile sonuçlandı. ^36,37 verimli etiketleme düşük ekstrasellüler demir konsantrasyonları ile elde edilir dikkat çekicidir. Örneğin anyonik nano parçacıklar kullanarak daha önceki çalışmalar, 5 mM demir ile 30 dakikalık bir inkübasyon süresinden sonra hücre başına 10 ug demir seviyeleri rapor etmektedir. Buna karşılık ^38, 0.5 uM proteini içeren bir katyonize magnetoferritin çözeltisi ile inkübasyon yaklaşık 0.2 mM demir ile kuluçkaya bırakılmaya karşı gelen ve cel başına demir yaklaşık 10 pg verir30 dakika sonra l. Biz açıkça TEM kullanarak herhangi bir endositotik veziküller tespit etmek mümkün değildi. Ancak, katyonize ferritin kullanarak önceki çalışmalarda içselleştirilmesi maruziyeti ilk on dakika içinde meydana geldiğini gördük. ^39,40 katyonize ferritin clathrin- veya kaveolin bağımlı endositoz belirten kaplanmış kesecikler, lokalize olabilir. Aynı çalışmalar inkübasyon 30 dakika sonra, katyonize ferritin lizozomlar benzeyen, hücre yüzeyi üzerinde mevcut olan, hem de multiveziküler organlarında de olduğu bildirilmiştir.

Diğer uygulamalar, anti-kanser ilaçları ⁴¹ ya da kuantum noktaları ⁴² gibi diğer nanopartiküller ve / veya fonksiyonel moleküller, yüklü apo-ferritin kafesleri Katyonikleştirme içerebilir. Bu ferritin yapıların Katyonikleştirme hücrelere kendi yük daha hızlı ve daha etkin bir şekilde iletilmesini neden olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Fisher Scientific	BPE310-1	powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.6 and dilute to 50 mM prior to use. Check the pH carefully prior to synthesis!
apoferritin from equine spleen	Sigma Aldrich	A3641	we used LOT# 081M7011V
cobalt sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	C6768	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
ammonium iron sulphate hexahydrate	Sigma Aldrich	F1543	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
hydrogen peroxide solution (30%)	Sigma Aldrich	216763	prepare fresh solutions from the salt prior to synthesis
sodium citrate	Sigma Aldrich	S1804	powder; a 1 M solution can be prepared and kept at room temperature for several months
Millex GP filter unit, 0.22 micron	Merck Millipore	SLGP033RS	syringe filter
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503	powder; prepare a 1 M stock solution at pH 8.0 and dilute to 50 mM prior to use
sodium chloride	Sigma Aldrich	31434	poweder; add to buffers as required
Centriprep centrifugal filter units	Merck Millipore	4310	Ultracel YM-50 membrane, 12 ml volume; use for initial concentration until the magnetoferritin solution has been concentrated from about 150 ml to 20 ml
Amicon Ultra-4 centrifugal filter untis	Merck Millipore	UFC801024	Ultracel-10 membrane, 4 ml volume; use to concentrate magnetoferritin solution from about 20 ml to 2 ml
ANX Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare	17-1287-04	we packed this column ourselves
HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR column	GE Healthcare	17-1196-01	this column was bought ready packed
ÄKTA purifier system	GE Healthcare	28406264
sample pump P-960	GE Healthcare	18-6727-00	load sample at a flow rate of 10 ml/min
automated fraction collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00
Bradford assay reagent	Sigma Aldrich	B6916	solution ready to use
Ferritin, Type I: from horse spleen	Sigma Aldrich	F4503	prepare ferritin standards from this solution to determine magnetoferritin concentration
N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA)	Sigma Aldrich	308110	CAUTION: when adjusting the pH of a DMPA solution, perform this step in a fume hood
N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	Sigma Aldrich	E6383	keep in freezer but bring to room temperature before opening the bottle
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	AppliChem	A0689,0500	powder; prepare a 200 M stock solution at pH 5
dialysis tubing cellulose membrane	Sigma Aldrich	D9652	soak 10 min in deionized water before use
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glucose	Sigma Aldrich	D5546	warm in 37 °C water bath before use
fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F7524	add to stock DMEM bottle, 10% (v/v) final concentration
penicillin/streptomycin solution	Sigma Aldrich	P0781	add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
glutamax solution	Gibco	35050-087	add to stock DMEM bottle, 1% (v/v) final concentration
human fibroblast growth factor	PeproTech	100-18B	add to DMEM freshly into cell culture flask with each media change; final concentration 5 ng/ml
phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	D8537	sterile solution, for cell cultrue
trypsin/EDTA solution	Sigma Aldrich	E5134	keep in freezer and defrost in 37 °C water bath before use
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134	powder; make a 2 mM solution in PBS
bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7030	add 0.5% (w/v) into 2 mM EDTA solution in PBS; carefully stir with magnetic stirrer, avoid foaming; filter sterilize through a 0.22 micron syringe filter
MACS multi stand	Miltenyi Biotec	130-042-303	for attachment of MACS magnet
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	disposable; intended for single use, but if sterility is not required, they can re-used: wash with deionized water and 100% ethanol, and placed in a drying oven; discard if you observe rusty patches
MiniMACS separator magnet	Miltenyi Biotec	130-042-102	can be bought as a starter kit, together with columns and stands
MACS column pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407	30 mm filter
Nitric acid solution, 64-66%	Sigma Aldrich	7006
Titrando 907, syringe pump	Metrohm	2.907.0020
Equipment used to characterize magnetoferritin and cationized magnetoferritin
SpectraMax M5	Molecular Devices		Used to measure absorbance in the Bradford assay
JEM 1200 EX	JEOL		Used for TEM imaging of magnetoferritin
InVia Raman spectrometer	Renishaw		Used for Raman spectroscopy
Torus DPSS laser	Laser Quantum		Used for Raman spectroscopy
Bruker UltrafleXtreme	Applied Biosystems		Used for MALDI-TOF analysis of apoferritin and cationized apoferritin
ZetaSizer Nano-ZS	Malvern Instruments		Used to measure hydrodynamic diameter and zeta potential of magnetoferritin and cationized magnetoferritin
Magnetic Property Measurement System	Quantum Design		Used to measure magnetic saturation moment and magnetic susceptibility
Magnetom Skyra	Siemens		Used to determine longitudinal and transverse relaxivity
Tecnai 12 BioTwin Spirit	FEI		Used for TEM imaging of hMSC labeled with cationized magnetoferritin
710 ICP-OES	Agilent		Used to determine iron content in cells