Sıçanlarda Karın Aort Konstrüksiyon sayesinde Kardiyak Yaptırma Bir Model

Özet

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Özet

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

Giriş

Kalp yetmezliği periferik dokularda bir yorgunluk, nefes darlığı dahil olduğu belirtileri, egzersiz intoleransı karmaşık klinik sendrom, ve sıvı tutulması olduğunu. Bu gelişmiş ülkelerde ¹ önde gelen ölüm nedenidir. Kenara sarkomer protein ya da iyon kanalları ² mutasyonlardan kaynaklanır miras kardiyomiyopati, miyokard disfonksiyonu hipertansiyon, kalp kapak hastalıkları, obezite ve diyabet ³ dahil olmak üzere tıbbi koşulları, çeşitli neden olabilir. Yetersiz kardiyak pompalama kapasitesine miyokard yapısı, elektrik iletim ve enerji metabolizması kurşun değişiklikler sonuçta kalp yetmezliği ^3,4 sonuçlanır dolaşım taleplerini karşılamak için. kalp yetmezliği altında yatan mekanizmaları araştıran, bu nedenle, kardiyovasküler araştırma alanında kritik öneme sahiptir. kalp yetmezliği ilerlemesi için önde gelen moleküler mekanizmaları belirleme sonunda yeni tedavi hedefleri ya da yararlı biyomarkerların keşfi yardımcı olabilir 1 kadar. İnsanlarda ⁵ kalp yetmezliği olan temel klinik özellikleri paylaşan kalp yetmezliği hayvan modelleri geliştirmek için önemlidir.

Kardiyak hipertrofi ve yeniden şekillenme kalp yetmezliği gelişiminde kritik bir rol oynamaktadır. Hipertansif kalp hastalığı, kalp hipertrofisi ve insan hastalarda ¹ görülen uyumsuz biçimlenme anahtar bir faktör olduğunu. Bu insan koşullarını taklit etmek için, hayvan modelleri genellikle cerrahi prosedürler aracılığıyla kurulur. Özellikle, enine ya da abdominal aorta sonuçta kalbinde bir basınç yükü neden sol ventrikül karşı direncini artırmak için daraltıldığı edilebilir. Bu olgu, genellikle kardiyak hipertrofiye kardiyomiyositlerinin fizyolojik tazminat kardiyovasküler sistemin fonksiyonel talebi karşılamak için olur. Bununla birlikte, fonksiyonel talep kardiyak fibroz ve CONTRAC yol normal fizyolojik telafi edici mekanizmalar geçersizkaro bozukluğu. Enine aort daralma (TAC) cerrahi genellikle aortik arktan torakotomi, mekanik ventilasyon ve timus ayrılması ve yağ dokusu dahil karmaşık prosedürleri kapsar. Buna karşılık, abdominal aort daralma basit deneysel teknikler ^6-8 gerektirir. abdominal aorta, sol ve sağ renal arter arasında, ameliyat sırasında dar olduğunu. Kardiyak hipertrofi ve yeniden şekillenme abdominal aort daralma cerrahisi ^6-8 birkaç hafta sonra görülebilir; Onlar enine aort daralma cerrahisi ^9,10 tarafından üretilen benzer sağlam hipertansif kalp hastalığı üretirler. Burada, etkin, yüksek tekrarlanabilir ve minimal invaziv bir yöntem kullanılarak sıçanlarda abdominal aort daralma yapmak için bir protokol açıklar. renal arterlerin bitişik abdominal aorta 4-0 ipek iplikle oluşan bir 0.72 mm döngü tarafından dar edilir. On hafta cerrahi, kalp hipertrofisi ve remodelin sonrag gözlenebilir. Abdominal aort daralma kaynaklı kalp hipertrofisi sıçan modelinde hastalık mekanizmalarını ve patofizyolojisi yanı sıra potansiyel tedavilerin gelişimini incelemek için bir platform sağlar.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım için Kılavuzu (NIH yayın no. 85-23, 1996 revize) uyarınca yapılmıştır. Bu protokol ile ve Ulusal Tayvan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen kurallara uygun olarak kabul edildi.

1. Hayvan Cerrahisi

1. Bir honlama taş üzerinde iğne ucu köreltme ile 22 G iğne şırınga hazırlayın. pense kullanarak, bir dik açı iğne plicate.
2. Ameliyattan önce, gerekli cerrahi aletler ve malzemeler, yanı sıra kurtarma kafesini hazırlamak. Kullanmadan önce tüm enstrümanları ve cerrahi malzemeleri otoklavlayın.
3. 200 g etrafında fareler korumak ve yiyecek ve suya serbest erişimi olan kontrollü bir sıcaklıkta (21 ± 2 ° C) 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında tutmak. Her bir grupta en az 6 fareleri içerir. pentobarbital anestezisi fareleriveya başka bir uygun anestezik bir madde (0.5 mi, IP olarak 75 mg / kg). kuyruk refleks testi ile anestezi derinliği onaylayın.
   Not: yükleme refleksinin yokluğu Yeterli anestezi bir göstergesidir.
4. vücut ısısını korumak için, bir ısıtma yastığı ile bir ameliyat platformunda yatar pozisyonda bir sıçan yerleştirin. Cerrahi kirlilikleri önlemek için bir hayvan saç kesme makinesi ve saç çıkarıcı losyon ile sıçan karın bölgesini tıraş. betadin veya ameliyattan önce başka temizlik reaktif ile temiz tıraşlı karın fırçalayın.
   NOT: işlem boyunca steril bir alan sağlamak için önemlidir.
5. Bir neşter ile karın orta hat boyunca 2 cm kesi olun. serum fizyolojik kullanılması, ameliyat sırasında nemli karın organı tutmak. Posterior periton bölgede yatıyor inferior vena kava maruz pamuk topları kullanarak tarafına dikkatlice sindirim organları yerinden. genellikle bitişik ve yalan abdominal aorta, tespitinferior vena kava sol.
   NOT: abdominal aort kalp hızı ile zaman içinde yanıp söner gemi.
6. altındaki damarları ortaya çıkarmak için forseps bir çift ile periton delin. Yavaşça renal arterlerin bitişik abdominal aorta izole ve sağ kökeni ve sol renal arterlerin arasında abdominal aorta altında 8 cm uzunluğunda 4-0 ipek sütür geçmektedir.
7. sütür ile gevşek bir çift düğüm yapmak; 3 mm çaplı döngü bırakın ve döngü içinde körleşmiş ve bükülmüş 22 G iğne yerleştirin. aort ve iğne etrafında düğüm sıkın ve ardından 0,7 mm çaplı daralma elde etmek için derhal iğne çıkarılır.
8. 6-0 emilebilir sütür materyali ile karın boşluğuna kapatın. Basit sütürler ile kas ya da derideki kesiler dikilmelidir. enfeksiyonu önlemek için, bir iyot tentürü ile cerrahi siteyi fırçalayın.
9. yeterli bilinç kavuşur kadar serbest dolaşımı ile belirtildiği gibi, dikkatli bir şekilde hayvan gözlemlemekve gıda alımı. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. ameliyat sonrası ağrıyı önlemek için, asetaminofen (0.5 ml, 300 mg / kg, ip) ile sıçan tedavi.
   NOT: kurumsal politikalar tarafından onaylanan kullanıcılar analjezikler yönetmek gerekir.

2. Doku ve Kan Örnek Toplama

1. 10 hafta sonrası ameliyat at, sıçan tartmak ve (0.5 ml, ip 75 mg / kg), pentobarbital ile uyutmak. Ameliyattan önce, kuyruk refleks testi ile anestezi derinliği onaylayın. metal tepsi üzerinde sıçan yerleştirin.
2. Bir neşter kullanılarak boyun orta hat boyunca 2 cm kesi olun. trakea maruz forseps ile dikkatlice kasları yerinden. trakea paralel ve kalp hızı ile zaman içinde zonklamak karotis arterler, tanımlamak için dikkatle gözlemleyin.
3. EDTA ile kaplanmış bir kan toplama tüpüne karotid arterden kan toplamak. hemen santrifüj2,000 x g'de 15 dakika boyunca, kan ve plazma toplama. kadar gerekli -80 ° C kan plazması saklayın.
4. xiphoid sürecin orta hat çevresinde, göğüs bölgesinde 5 cm kesi olun. Keskin forseps ile diyaframı delin. makas kullanılarak, kesme ve kalp maruz her iki tarafta orta klaviküler çizgisinde göğüs kafesini çıkarın. kalp ve damar sınırları boyunca dikkatle kalbi tüketim. doku kapma olmadan yavaşça kalp çıkarın.
5. perfüzyon iğne aort gövdesini bağlayarak modifiye Langendorff perfüzyon aparatı üzerinde kalbi monte edin. Krebs tamponu ile kalbi serpmek (110 mM NaCl, 2.6 mM KCI içeren 1.2 mM KH ₂ PO _4, 1.2 mM MgSO _4, 25 mM NaHCO ₃ ve 11 mM glikoz [pH 7.4]) kan yıkamak için. kalbi tartılır ve kalp-ağırlık-vücut-ağırlık oranı hesaplanır. buz üzerinde% 4 paraformaldehid ile kalbi düzeltmek. paraformaldehit buhar Zehir olduğundan, bir maske takmak unutmayınic.

3. Doku Fibrozis Niceleme

1. Bir doku kesit cihazda paraformaldehid sabit kalp dokusu yerleştirin ve 2 mm kalınlığında kesitler kesti. Bir gömme kasetine doku bölümleri yerleştirin. dereceli alkol banyoları (% 50,% 75,% 95, ve 1 saat için her% 100), bir dizi doku kurutmak.
2. 1 saat boyunca mum içinde son olarak 1 st için ksilen doku infiltrasyonu ile. Bir gömme kasetine sızmış doku yerleştirin ve parafin mumu ile gömmek. microtoming kadar oda sıcaklığında parafine gömüldü dokuların saklayın.
3. 4 mikron kalınlığında kesitler içine gömülü doku dilimleyin. 45 ºC su banyosunda bölümleri yerleştirin. bir açıyla su banyosu içine bir cam slayt batırın ve yavaş yavaş slayt kısmi eki izin parafin kesit kenarlarını yaklaşım.
4. kaydırmak ve banyo dışına doku bölümünde olası hava boşluklarını kaldırmak ve daha iyi bağlanmasını kolaylaştırmak için. kuru to 1 saat 37 ºC de slaytlar ve histolojik boyama için oda sıcaklığında saklayın.
5. Bir tanka slayt koyun. 30 dakika boyunca ksilen slayt Deparaffinize ve son olarak da damıtılmış su içinde ve (3 dakika her biri için% 95,% 75 ve% 50) ardışık olarak seyreltilmiş alkol içinde rehidre. Tamamen 1 saat doku bölümleri kapsayacak şekilde yeterli picrosirius kırmızı çözümü kullanın. İki değişiklikler için,% 0.5 asetik asit solüsyonu içinde slaytlar durulayın, sonra mutlak alkol eden iki durulama yapmak.
6. slayt Hava kurutun ve bir lamel ile sentetik reçine slayt monte edin. Görünür ışık alanında slayt fotoğraf.
   NOT: fotoğraftaki kırmızı alan 200X büyütmede mikroskop altında bir picrosirius Kırmızı pozitif bölgeyi gösterir. Fibrozis ¹¹ kapsamını gösteren toplam alan üzerinde picrosirius Kırmızı pozitif bölgeye yüzdesini hesaplayın.

4. Kan Troponin Niceleme

1. plazma troponin düzeyleri ölçmekbir enzim-bağlantılı ümmünozorbent deneme (ELISA) kullanılmıştır. iki kopya halinde her bir numune deneyi. Yük, kan plazması, 50 ul uygun kuyulara bir antikor kokteyli 50 ul. plakası kapatılır ve 400 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
   NOT: plazmada Kardiyak troponin kalp yaralanması için bir göstergedir.
2. sıvı aspire ve yıkama tamponu 250 ul üç kez de her yıkayın. Son yıkamadan sonra, plaka ters ve aşırı sıvı kaldırmak için temiz bir kağıt havlu karşı kurulayın.
3. Her kuyucuğa tetrametilbenzidin alt-tabaka 100 ul ilave edin ve 400 rpm'de bir plaka karıştırıcısı üzerinde karanlıkta 10 dakika süreyle inkübe edilir. Her bir oyuğa durdurma çözeltisi 100 ul ekle. 1 dakika karıştırmak için, bir plaka karıştırıcısı üzerinde plakayı sallayın. 450 nm'de optik yoğunluk (OD) kaydedin.
   NOT: troponin konsantrasyonu OD değeri ile orantılıdır.

Sonuçlar

10 hafta abdominal aort daralma cerrahisi sonrası ortaya çıkan kardiyak patoloji analiz edildi. Kalp histoloji vücut ağırlığına, kalp ağırlığına oranının hesaplanması ile ve kalbin kollajen miktarı tespit edilerek ölçülür. Kalp yaralanma plazma troponin konsantrasyonunun ölçülmesiyle doğrulandı.

Şekil 1A'da gösterildiği gibi, daha yüksek bir kalp ağırlık-vücut ağırlık ...

Tartışmalar

Hypertensive heart disease, a major health problem that contributes greatly to morbidity and mortality, can lead to cardiac hypertrophy and heart failure⁵. The pathogenesis and progression of hypertensive heart disease in humans is complex, so an appropriate animal model is critical to investigate the underlying mechanisms and to test novel therapeutics that aim to improve cardiac structure and function⁵. The abdominal aortic constriction model, which simulates chronic heart disease, is an effective...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G syringe needle	BD Biosciences	309572
EDTA Blood Collection Tubes	BD Biosciences	REF365974
4-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	441244
Acetaminophen	Sigma Aldrich	A7085
Picrosirius red solution	Abcam	ab150681
Cardiac troponin kit	Abcam	ab200016
Imagequant	Molecular Dynamics
Langendorff	ADInstruments	ML870B2