Ven interpozisyonu Model: baypas açıklığının Eğitim için uygun bir model

Özet

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Özet

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Giriş

Koroner arter hastalıkları ve bunların komplikasyonları dünyada önde gelen ölüm nedenleri arasındadır. Güncel tedavi stratejileri yeniden kurulması kan akımı üzerine ya daralmış damar genişletici veya bir bypass oluşturarak odaklanmak. damar otogrefti kullanarak koroner arter bypass cerrahisi (CABG) ilk kez 1968 yılında tanımlanmıştır ve yılda rafine edilmiştir. Dışında sol ön revaskülarizasyon inen koroner arter gelen, safen ven kanallar en sık ¹ kullanılmaktadır. Ancak, greft açıklık safen ven grefti (SVG) Aşil topuğu kalır. Cerrahiden bir yıl sonra, greft açıklık on yıl ^2,3 sonra% 61 düşüyor,% 85'dir. SVG açıklık kaybı patofizyolojik mekanizmaları ve nedenlerini açıklanması dolayısıyla önemli bir görevdir.

Bu video ven greft kaybı araştırmak için bir sıçan ven interpozisyonu modelini göstermektedir. Bu yöntemin genel amaçları altında yatan biyopatolojik keşfetmek için vardırve ve hastalığın ilerlemesi sırasında -physiological süreçler ilaç veya tedavi seçeneği testi için uygun bir model geliştirmektir. arteriyel sisteme yüzeysel epigastrik ven nakli, bu model yakından koroner bypass klinik ayarını taklit eder. Cerrahi travma, iskemi ve duvar basıncı patolojik damar değişikliklerinin önemli tetikler ve tarif edilen modelinde taklit edilir.

Farklı modeller ve türlerin ven greft açıklığı kaybı araştırmak için kullanılabilir. Bu domuzlar ^4, koyun ^5, köpeklerde ⁶ ve maymun ⁷ gibi büyük hayvan modelleri, insan damar ve anatomik yapıları benzer ve bu nedenle ⁸ test edilecek Bypass stent veya yeni cerrahi teknikler gibi kompleks terapötik stratejiler, sağlar. Ancak özel konut, ekipman ve personel gereklidir. Buna ek olarak, yüksek maliyetler ve ameliyat sırasında ek bir anestezist ihtiyacı onların geniş bir uygulama engel. Smsıçanlarda da dahil olmak üzere tüm hayvanlar, özel konut gerekmez, kullanımı kolay, ve yönetilebilir maliyetleri. Fare modellerinde ^9,10 ile karşılaştırıldığında, sıçan modelleri sonuca daha iyi çalışabilirlik avantajı ve bu nedenle daha az değişkenliğe sahip. Sıçanlar fizyolojik ve genetik fareler ^11,12 den insanlara daha benzer. Buna ek olarak, çoğu vahşi tip fareler sadece II hataları tip eğilimli fare modelleri yapmak sınırlı myointima ^13, gelişir. Böyle inferior vena kava olarak ana fare damarlar, histolojisi, sadece birkaç hücre tabakalarından oluşur ve erken değerlendirme zor ¹³ vermektedir. Bir başka dezavantaj, greft kurtarma sonra bir sonraki analiz için uygun bir doku küçük bir miktardır.

Bu video açıklanan model, gerçekleştirmek için, yeniden üretilebilir, ucuz ve kolay ve hızlı ve güvenilir bir tespit edilebilir. Bu viral vektörler gibi pahalı deneysel terapötik maddeleri değerlendirmek için uygundurekonomik bir şekilde gen terapisi için.

Protokol

Hayvanlar Laboratuvar Hayvanları İlkeleri, Laboratuar Hayvan Kaynakları Enstitüsü tarafından hazırlanan ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Kılavuzu'nda uygun insancıl bakıma aldı. Tüm hayvan protokolleri sorumlu yerel otorite ( "Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hansestadt (Sağlık ve Tüketiciyi Koruma Dairesi) Hamburg") tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan Bakımı

1. Laboratuvar Hayvanları Enstitüsü 300-350 g ağırlığında Lewis sıçanları (LEW / Crl) sıçan ve ROSA / lusiferaz LEW transgenik fareler elde edin.
2. havalandırmalı dolaplar geleneksel koşullar altında sıçan tutmak ve onlara standart sıçan yemi ve otoklava su ad libitum beslenirler.
3. donör ve alıcı olarak sinjenik LEW / Crl sıçanlar olarak ROSA / lusiferaz LEW transgenik fareler kullanarak bir greft nakli gerçekleştirmek.

Donör Sıçan 2. Hazırlık

1. Bir askere kullanıniyon odası izofluran (2.5-3%) ile bir sıçan uyuşturan için.
2. Sırtında sıçan yerleştirin ve ağız ve burun kapsayan bir yüz maskesi ile anestezi korumak. arka ayakları sıkışmasını ve reflekslerin yokluğu doğrulayarak anestezi yeterli derinliğe kontrol edin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlere bazı veteriner merhem sürün.
3. arka bacakları yaymak ve bant kullanarak kendi konumunu düzeltmek.
4. saç düzeltici ile inguinal saçlarını tıraş ve% 80 etanol ile takip povidon-iyot kullanarak tüm alanı dezenfekte edin. İki kez dezenfeksiyon işlemi tekrarlayın.
   NOT: Cerrahi alan, gazlı bez ve cerrahi aletler sterilize edilmelidir. süreç boyunca steril bir alan korumak ve tek kullanımlık, steril cerrahi eldiven, maske ve kep giymek.
5. Mikroskop altında, linea Inguinalis boyunca dikey bir kesi yapmak. nazikçe cilt altı dokuları ayırmak için iki forseps kullanın ve ori yüzeysel epigastrik ven maruzFemoral ven cin. Dikkatle çevre dokulardan yüzeyel epigastrik ven izole.
6. İki mikro kelepçeler kullanarak yüzeyel epigastrik ven kan akışını durdurun.
7. dikkatlice forseps ile izole ven kaldırma ve microscissors damar yoluyla keserek damar yaklaşık 0.5 ila 1 cm segmenti hasat. kan kaybını önlemek için damar güdük mikro kelepçeler bırakın. steril gazlı bez üzerine ven kaldırıldı parça yerleştirin. Dikkatle toplandı damarın bir ucunda içinde 30 G iğne yerleştirin ve heparin ile kap (50 birim / ml) yıkayın.
   NOT: Dikkatli damar tutun ve kaldırma, kesme ve yıkama sırasında zarar görmemesi. heparin uygun miktarda greft temizlemek için emin olun.
8. Alıcı sıçan içine nakli, bir gemi spazmı önlemek için kadar buz üzerinde% 1 lidokain damar segmentini tutun.
9. % 5 izofluran anestezi artırarak donör sıçan Euthanize. 2-3 dk, op sonralinea alba boyunca karın tr, diyafram üzerinden kesilmiş ve kan dolaşımını durdurmak için kalbi kaldırın.

Alıcı Sıçan 3. hazırlanması

1. Uyutmak ve donör sıçan aynı şekilde alıcı sıçan düzeltin.
2. saç düzeltici ile bacakların medial tarafını Tıraş ve povidon-iyot ve% 80 etanol kullanılarak üç kez dezenfekte edin.
3. anestezi derinliği izlemek ve arka ayakları kısma zaman refleksleri bulunmadığını teyit ederek yeterli olduğundan emin olun.
4. kasık kat diz medyan femur kesi gerçekleştirin. Mikroskop altında, çevresinden femoral arter ayırmak için 2 forseps kullanabilir.
5. kan akışını durdurmak için mikro kelepçeleri kullanın. Distal kelepçe ile takip ilk proksimal kelepçe, yerleştirin.
6. microscissors kenetlenmiş femoral arter kısa bir kesimi kesip atın. bir boşluk yaratarak microscissors kalan arter güdük kısaltılmasıven grefti daha büyük 1-2 mm. 30 G iğne kullanılarak heparin ile arteriyel güdük yıkayın.
   NOT: adventisya hafifçe damar güdük ötesinde çıkıntı halinde, geminin ucuna hafifçe çekin ve bir parça çıkarmak için forseps kullanabilir.
7. arteriyel kütükleri arasındaki adım 2.8 hasat ven yerleştirin ve boşluğa uygun sığacak şekilde uzunluğunu ayarlayın. ven yönüne dikkat edin.
8. ilk 10-0 prolen sütür kullanılarak proksimal anastomoz gerçekleştirin. (Şekil 1D) gösterilen sırayla tek dikiş yürütün. ventral tarafta üç sütür eklemeden önce her yan tarafında bir dikiş ile başlayın. Daha sonra, anastomoz tamamlamak için teknenin sırt tarafında üç dikiş yerleştirin.
9. Adım 3.8 açıklanan proksimal anastomoz için aynı tekniği kullanarak greft distal damarları bağlayın. Yine, her yan tarafında bir sütür ile başlamak ve daha sonra ventral sid üç sütür koyunE ve dorsal tarafı.
10. fibrin yapıştırıcı bileşen 1 ve 2 ile yük iki adet 1 mL'lik şırınga dikkatlice forseps ile greft kaldırın ve bileşen 2, ardından greft altında fibrin yapıştırıcı bileşeninin 1 yaklaşık 100 ul bırakın.
    NOT:: 1 oranında parçalar 1 ve 2, bir 1 uygulanır emin olun.
11. geri pozisyonda greft yerleştirin ve greft üzerine bileşenleri 1 ve 2'nin ek bir 100 ul bırakın. tutkal greft ve anastomoz yetmezliği ve damar grefti aşırı distansiyonu önlemek amacıyla anastomoz kapsar emin olun.
12. Dikkatle proksimal ardından uzak kelepçe açmak.
13. Nakledilen damar ve greft distal arter gözle görülür bir darbe kontrol ederek başarılı bir ameliyat onaylayın.
14. cilt kapatma engellemektedir aşırı tutkal, çıkarın. tedavi tutkal kaldırın ve microscissors aşırı çıkarmak için forseps kullanın. 5-0 prolen sütür ile cilt katmanları kapatın.
15. 4-5 m enjekteg / kg Carprofen subkutan sıçan uyanmak izin vermeden önce. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvan bırakmayın. tamamen iyileşti kadar tek bir kafeste hayvan tutun.
16. Aşağıdaki 3 gün boyunca ağrı kesici ilaç olarak içme suyu (100 ml başına 50 mg metamizol) Metamizol ekleyin ve günlük hayvan izleyin.

4. Dubleks Sonografi

NOT: duxplex sonografi sıçanlarda ¹⁴ non-invaziv kan akışını görselleştirmek için.

1. indüksiyon odasında (izofluran% 2) bir sıçan Anesteziyoloji. Sırtında sıçan yerleştirin ve burnu kaplayan bir yüz maskesi ile anestezi korumak.
2. uyluk çevresi saç kaldırmak için saç makasları ve epilasyon kremi kullanın.
3. uyluk ultrason jeli uygulayın. hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. MS 400 transdüser kullanılarak dubleks sonografi görüntü elde (merkez frekansı: 30 M/ Sn 230-400 kare hızı ile Hz).

5. histopatolojisi

NOT: Hasat morfometrik analiz ¹⁵ Masson trikrom boyama ile gemi leke ve.

1. gece boyunca% 4 paraformaldehid içinde hasat kap saptamak etanol artan konsantrasyonlarda kurutmak. parafin örnek embed ve bir mikrotom kullanılarak 5 mikron kalınlığında dilimler halinde kesin.
   NOT: Paraformaldehyde toksik ve özel dikkatle ele alınmalıdır.
2. trikrom boyama solüsyonu ile onları boyamadan önce slaytlar Deparaffinize. Lekeli slaytlar dehydrate ksilen ile bunları temizleyin ve orta montaj takar. slaytlar kurutulduktan sonra, bir mikroskop ile örnekleri görmek.

6. Biyoparlaklık Görüntüleme (BLI)

NOT: Ameliyat sonrası greft biyolüminesens sinyali ¹ ölçerek in vivo zamanla takip edildi6.

1. PBS 22 ml D-luciferase potasyum tuzu, 1 g çözülür ve intraperitoneal olarak sıçan (375 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte. luciferin hayvan dönmesi için 15 dakika bekleyin.
2. gerçek zamanlı biyolüminesens miktar sistemi içine sıçan yerleştirin ve biyoparlaklık sinyali erişin.

Sonuçlar

sıçan ven interpozisyonu modeli myointima hiperplazi ve ven greft yetmezliği gelişimini incelemek için uygundur. Hayvanlar ameliyat sonrası iyi kurtarmak ve mükemmel fiziksel durumu sonrası operasyon göstermektedir. Şekil 1 anahtar cerrahi adımları gösterir. Linea Inguinalis boyunca cilt kesisi sonra, epigastrik yüzeysel ven ve femoral arter (Şekil 1A) tespit edilir. Bu erken greft yetmezliği ve açıklık kaybına yol açabilir olarak greft Hasat, greft (Şekil ...

Tartışmalar

Bu video ven greft kaybı araştırmak ve altta yatan patolojik süreçlerin araştırılması ve yeni ilaçlar ya da tedavi seçeneklerinin test etmek için izin veren bir fare ven interpozisyonu modelini göstermektedir.

Anestezi cerrahi prosedürler çok önemli bir yönüdür. Bu özellikle uzun süreli operasyonlar sırasında, güvenli ve kolay bir yöntem olduğu için sürekli inhalasyon anestezi sistemi tavsiye edilir. Bu işlem en fazla 1 saat sürer eğitim safhasında büyük ön...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment