ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Gerilme R20291

Özet

Bu protokol klinik olarak ilgili ve genetik uysal gerginlik, R20291 kullanarak Clostridium difficile enfeksiyonu (CDI) sefoperazon fare modeli özetliyor. Klinik hastalık izleme, C. difficile bakteriyel numaralandırma, toksin sitotoksisite ve bir fare modelinde CDI genelinde histopatolojik değişikliklere vurgu protokolde ayrıntılı olarak verilmiştir.

Özet

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Giriş

Clostridium difficile hayatı tehdit eden ishal ¹ neden olan bir anaerobik, gram pozitif, spor oluşturan basildir. C. difficile enfeksiyonu (CDI) yıl ^1-4 başına sağlık maliyetlerinde üzerinde 4800000000 $ artmış, insan morbidite ve mortalite ve sonuçları ile ilişkilidir. 2013 yılında, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri kamu sağlığı ¹ acil tehlike teşkil ettiğini gösteren, acil antibiyotik direnç riski C. difficile kategorize. Şu anda, antibiyotik vankomisin ile tedavi ve metronidazol CDI ⁵ için standart bakım olarak kabul edilir. Hastaların ^2,5-7% 30 - Ne yazık ki, antibiyotik başarılı tedavi sonrası CDI tekrar 20 meydana gelen, yüksek. Bu nedenle, bu enterik patojene karşı yeni terapötiklerin keşfi gereklidir. C. difficile, ac insan hastalığı yaklaşan bir hayvan modelinde karşı ilaç gruplarına değerlendirmeklinically-İlgili suşu gereklidir.

Başlangıçta, Koch Postülatları bir klindamisin ile tedavi edilen Suriye hamster modeli ⁸ kullanılarak 1977 yılında C. difficile için kurulmuştur. Bu model hala patogenezi ^9,10 C. difficile toksin etkilerini araştırmak için bugün kullanılmaktadır. Ancak, CDI Hamster modelinde yüksek mortalite oranları ile sonuçlanır ve CDI ^10,11 insanlarda görülebilir kronik sinsi hastalık belirtilerinin yaklaştığı değildir. Araştırmada sıçangil platformlar erişilebilirlik ve reaktif durumuna göre, CDI bir fare modeli uygundur.

2008 yılında, CDI sağlam bir fare modeli klindamisin ¹² bir intraperitoneal enjeksiyon, ardından 3 gün bir antibiyotik içme suyu kokteyl (kanamisin, gentamisin, kolistin, metronidazol ve vankomisin) fareler muamele edilmesiyle kurulmuştur. CDI ve şiddetli kolit duyarlı Bu hale fareler. bağlıuygulanan aşı doz ing, klinik belirti ve letalitesinin bir dizi bu model kullanılarak görülebilir. Bu zamandan beri, çeşitli antibiyotik rejimleri C. difficile gastrointestinal sistem kolonize olabilir noktaya kolonizasyon direnci azalan, fare bağırsak Mikrobiyota değiştiren incelenmiştir (En ark gözden geçirdik. Ve Lawley & Young) ^13,14.

Daha yakın zamanlarda, 5 ya da 10 gün boyunca içme suyu verilen geniş spektrumlu sefalosporinler, sefoperazon, tekrarlanabilir CDI ¹⁵ duyarlı fare oluşturur. Üçüncü kuşak sefalosporin verilmesinin insanlarda CDI riski ile ilişkili olduğundan, sefoperazon modelinin kullanımı daha doğru bir hastalık ¹⁶ doğal olarak meydana gelen yansıtır. Sefoperazon ile tedavi edilen C. difficile duyarlı fareler C. difficile sporlarının ve klinik olarak değişen suşları çeşitli bitkisel hücreler hem meydan edilmiştiralaka ve virülans ^17. Bulaşıcı form olarak C. difficile vejetatif hücreleri kullanılarak özgün çalışmaların bazılarında rağmen, C. difficile sporlarının iletim ¹⁸ ana mod olarak kabul edilir.

Son on yılda, C. difficile R20291, bir NAP1 / BI / 027 suşu, CDI ^19,20 salgınlara neden ortaya çıkmıştır. Biz sefoperazon ile tedavi edilmiş fareler klinik olarak ilgili ve genetik uysal C. difficile suşu, R20291 aşılandığında hastalığın klinik seyrini belirlemeye çalıştık. Bu protokol kilo kaybı, bakteri kolonizasyonu, toksin sitotoksisite ve C. difficile R20291 sporları ile meydan farelerin gastrointestinal sistemde histopatolojik değişiklikler de dahil olmak üzere, klinik seyir ayrıntıları. Genel olarak, bu fare modeli CDI insan hastalığı yaklaştırmak için değerli bir deney platformu olduğunu kanıtlamaktadır. Bu özelliği, fare modeli, etkilerini değerlendirmek için kullanılabilirklinik hastalığın iyileştirilmesi ve C. difficile karşı kolonizasyon direnci restorasyonu yeni tedavi yöntemleri.

Protokol

Etik Açıklama:
Veteriner North Carolina State University College'da Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (NCSU) bu çalışmayı onayladı. NCSU Hayvan Bakım ve politika Kuzey Carolina Devlet 1985. Laboratuar hayvanları tesislerinin Hayvan Refahı Yasası ve Sağlık Araştırması Uzatma Yasası belirtilen standartlar ve ilkeler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için Kılavuzu'nda belirtilen kurallara uymak geçerlidir kullanın. Hayvanların sağlık durumları günlük olarak değerlendirildi ve can çekişen hayvanlar insanca ikincil tedbirlerle takip CO ₂ boğulma tarafından ötenazi uygulandı. Eğitimli hayvan teknisyenleri veya veteriner bu çalışma sırasında bir AAALAC akredite tesiste hayvancılık yapılmaktadır.

İçme Suyu Antibiyotik Cefoperazone'un 1. İdare C. difficile Kolonizasyon ve Hastalıklara Hassasiyetinin Başarmak için

NOTLAR: 5 ila 8 haftalık C57BL / 6 WT farelerin (kadın ve erkek)önce antibiyotik su yönetimini başlamadan satın alınan ve 1 hafta boyunca karantinaya alındı. karantina takiben fareler otoklava gıda, yatak ve su ile yerleştirildi. Kafes değişiklikleri laminer akış kaputu laboratuvar personeli tarafından haftada yapıldı.

1. 7 gün önce cebine hedeflenen gün (Şekil 1), steril damıtılmış su içinde sefoperazon (0.5 mg / ml) hazırlayın.
2. sefoperazon su ile otoklava su şişeleri (0.5 mg / ml) doldurun ve her bir fare kafes içine yerleştirin.
   NOT: adımlarda 1.1 ve 1.2 gösterildiği gibi sadece Taze hazırlanmış sefoperazon su, 5 günlük dönemde yapılan ve 2 günde dışarı değiştirilmelidir. kurumsal çevre sağlığı ve güvenlik yönergeleri izleyerek sefoperazon suyun uygun şekilde imha edilmesi tavsiye edilir.
3. sefoperazon su 5 gün sonra, steril distile su ile dolu otoklava su şişeleri ile şişeleri değiştirin. Deney süresince farelere bu içme suyu verin.

2. C. difficile Spore İnokulum hazırlanması ve Fareler Oral Gavaj

NOT: Başlamadan önce, aşağıdaki öğelerin en az 24 saat süreyle anaerobik odasına yerleştirilir emin olun: 1x fosfat tamponlu salin (PBS; Malzemeler bakınız), taurokolat sikloserin sefoksitin fruktoz agar (TCCFA) plakaları (Materyaller ve ek dosyasına bakın ) ve steril bir L-şekilli ayırıcı.

Not: C. difficile sporları ile tehdit Fareler Biyolojik Güvenlik Seviye 2 hayvan tesisine yerleştirilmiştir edilmelidir.

1. Daha önceden hazırlanmış ve steril su ^21,22 4 ° C 'de muhafaza edilmiştir (Bu durumda, R20291 olarak) istenen suşun bir C. difficile spor stok elde edilir. Kullanmadan önce bu spor stokunun numaralandırma belirleyin.
2. Bilinen konsantrasyonda spor stoku (spor / ml) göre istenen seyreltme 25 ul başına 10 ⁵ sporları elde etmek için hesaplanır. inokulum hacmi sağlamak tüm aşılamak için yeterliDeneyin (fare başına 25 ul), fareler inokulum numaralandırma (yaklaşık 30 ul) gerçekleştirmek için, ve pipetleme hatası hesaba.
3. Vortex orijinal C. difficile spor stok. Daha sonra, bir vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüpü içinde, steril su içinde, orijinal C. difficile spor stoku (adım 2.2) hesaplanan hacmi tekrar süspansiyon. Laminer akış kaputu aerobik bu gerçekleştirin. Bu seyreltilmiş karışımı belirlemek "spor inokulum."
4. 65 ° C su banyosu içine spor inokulum yerleştirin ve 20 dakika ısıtın.
   Not: Bu adım sadece aktif C. difficile sporlarının ısıl işlem sonrası kalmasını sağlayacaktır.
5. Laminer akış kaputu içinde, ısıtmalı spor inokulum 50 ul almak steril bir mikrosantrifüj tüp içinde yerleştirin ve anaerobik odasına ²³ içine geçer. spor sayımı için bu örneği kullanmak.
6. Laminer akış kaputu içinde kalan ısıtılmış spor aşı int yükoa 1 ml şırınga steril ampul uçlu mide gavaj iğne takılı. fareler arasında dozaj doğru ve hızlı tekrarı sağlamak için manuel şırınga step yararlanın. sonda iğne kullanmadan önce ısıtılmış spor inokulum ile dolu olduğundan emin olun.
   Not: her fare için yeni bir steril gavaj iğnesi gerekli değildir. C. difficile sporların çeşitli dozları tatbik edilir, ancak yeni bir gavaj iğnesi Her bir doz önerilmektedir.
   NOT: C. difficile sporlarının geleneksel dezenfektanlara karşı oldukça dirençlidir. Bu nedenle, 62. Perisept sporların dezenfektan olarak bir sporisidal dezenfektan kullanımı gereklidir. Üretici C. difficile sporlarını yok etmek için bir 2-min temas süresini önerir.
7. Gavaj spor inokulum 25 ul her bir fare. boynun gevşek cilt tarafından geri kafasını hareketsiz kılmak için hayvan tutarak yavaşça her fare kısıtlamaktadır. parmağı kullanarak daha fazla hayvanın kafasını ve hareketsizözofagus uzamış. hayvan seslendirmek ya da kısıtlama sırasında sıkıntı diğer belirtileri göstermeye olmadığından emin olun.
   Not: gavaj ile farelere verilen toplam hacmi 10 ml / kg vücut ağırlığı (0.1 ml / 10 g) olmalıdır.
8. dik, dikey konumda fare korumak ve yavaşça ağzının kenarından içine sonda iğne geçmektedir. ağız çatı boyunca sonda iğne yönlendirin ve yavaş yavaş yemek borusuna doğru sonda iğne ilerlemek.
   NOT: Herhangi bir direnç ile karşılaşılırsa, gavaj iğne trakea içine giren olabilir ve bu nedenle ileri DEĞİL, daha ziyade hemen kaldırılır ve yeniden konumlandırılmış.
9. sonda iğne özofagusa yaklaşık yarım sonra, ısıtmalı spor inokulum 25 ul enjekte ve yavaşça yemek borusu gelen sonda iğneyi çıkartın.
   NOT: sonda iğne Zoraki ilerleme yemek borusu veya mide yırtılmasına neden olabilir. gavaj iğne ilerleyen Bu nedenle, direnç ise, Hemen çıkarın ve sonda iğne yeniden konumlandırmak için en iyisidir.
10. kendi kafesine hayvan dönün ve bu istenmeyen trakeal yönetimini veya ısıtılmış spor inokulum aspirasyon gösterebilir olarak, herhangi bir öksürük ya da solunum sıkıntısı belirtileri gözlemlemek.
    NOT: Fareler antibiyotik tedavisi sonrası C. difficile son derece duyarlı olan; kafesleri esastır arasında nedenle, önlemler çapraz bulaşmayı önlemek için. kontroller olarak ele antibiyotik ama karşı konulmaz fareler yönetirken bu özellikle önemlidir.
11. tüm fareleri aşılamak sonra, steril bir mikrosantrifüj tüpe kalan ısıtılmış spor inokulum yerleştirin ve spor sayımı için anaerobik odasına geçmek.
12. ısıtmalı spor inokulum sayımı için ve kalan zorla ağız yolundan verilmiştir ısıtmalı spor inokulum (adım 2.4), 1x PBS her inokulum 01:10 seri dilüsyonları olun. 5 dilüsyonları (yani, 10 ^-1 ile - 4 yapmak ve plaka tavsiye edilir10 ^-5).
13. aseptik teknik kullanılarak, tek bir TCCFA plaka üzerine her seri seyreltme 100 ul aktarın.
14. steril L şeklinde bir dağıtıcı ile eşit levha boyunca ortama tatbik seyreltme yayıldı. Hatta seyreltilmiş inokulum yayılan sporların doğru numaralandırma için esastır.
15. 37 ° C'de 24 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin. 24 saat sonra, C. difficile koloni oluşturan birimler (CFU) hacmi 25 ul (0.025 mi) içinde farelere uygulanan enfektif dozu (takviye dosyası "Örnek hesaplamalar" bölümüne bakın) elde etmek üzere sayılabilir. C. difficile kolonileri sarı düz ve soluk ve düzensiz kenarları ve buzlu cam görünümü ²⁴ var.
    NOT: Bakteriyel sayımı için tespit limiti 10 ² CFU olduğunu.

C. difficile Enfeksiyon boyunca Hastalık 3. İzleme Fare Kilo Kaybı ve Klinik Belirtiler

1. tartılırantibiyotik kapalı 2 günlük bir iyileşme (gün 0) sonra, önce ve 5 gün sefoperazon, antibiyotik tedavisi sonrası nimals, ve daha sonra deney süresince.
   NOT: Her gün tutarlı bir seferde ağırlıkları alın. Ağırlıklar meydan gün (gün 0) C. difficile enfeksiyonu boyunca karşılaştırma için ilk başlangıç ağırlığı olarak kullanılması gerektiğini aldı.
2. Bir biyogüvenlik kabini içine dijital bir ölçek yerleştirin. ölçek üzerine steril bir plastik behere koyun ve plastik beher ağırlığını daralayın. Sonra, yavaşça kuyruk tabanı ile fare pick up ve plastik beher içine yerleştirin.
   1. geri ölçekte behere koyun. Fare kaçış olmadığından emin olmak için beher üstünden elini getirin. istikrarlı bir ağırlık elde etmek için 3 sn - 2 adet sürebilir. Sonra, yavaşça geri kafesin içine fare koyun. Bu ağırlık kaydedebilir ve bu kafeste her fare için bu işlemi tekrarlayın.
      NOT: önlemler çapraz Contamina önlemek için alınması zorunludurkafesler arasında yon ağırlıklarını alırken. Farelerin oluşturduğu her bir kafes tartım için kendi plastik kabı olması gerekir. plastik kap her kullanım arasında bir sporisidal maddesi ile dezenfekte edilmiş ve steril alüminyum folyo ile kaplanmış olmalıdır.
3. Günde iki kez (en azından) uyuşukluk, iştah, ishal kaybı ve kambur duruş dahil olmak üzere klinik şiddetli C. difficile enfeksiyonu belirtileri, meydan hayvanlar izleyin.
4. Insanca onların ilk bazal vücut ağırlığının% 20 kaybedersiniz hayvanları euthanize ve / veya (adım 3.3 listelenen) C. difficile enfeksiyonu ciddi klinik belirtiler gelişir.
   NOT: başlangıç bazal vücut ağırlığı% 20 kayıp değil emin olmak için, deney sırasında gerektiği gibi C. difficile enfeksiyonu klinik belirtilerini gösterir Fareler tartılmalıdır. Deneyde erken zaman noktalarında sırasında, bu iki günde ölçümler anlamına gelebilir.

C. difficile 4. Bakteriyel numaralandırmaFare Dışkı ve Çekal İçerikten

NOT: 1x PBS (Malzeme), TCCFA plakaları (Malzeme bakınız), steril bir L-şekilli yayma ve steril mikrosantrifüj tüpleri ve / veya: Başlamadan önce, aşağıdaki öğelerin en az 24 saat süreyle anaerobik odasına yerleştirilir emin olun dilüsyonları için PCR plakaları.

1. C. difficile Numaralama Örnekleri Alınması
   NOT: dışkı veya çekal içeriği elde etmek öncesinde, analitik bir ölçekte steril mikrosantrifüj tüpler tartın. Dört ondalık basamağa (ör 0,9864 g) yuvarlama tüp tarafında boru ağırlığı kaydedin. Bu ağırlık gösterelim "tüp ağırlığı." Toplanan Her numune steril, tartılmış mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmelidir.
   1. Fare dışkı steril koleksiyon
      1. Yavaşça boynun gevşek cilt tarafından geri kafasını hareketsiz kılmak için hayvan tutarak her fare dizginlemek. t, yavaşça hayvanın kuyruk dizginlemek için pinky parmağınızı kullanınhus anüs açığa. hayvan seslendirmek ya da kısıtlama sırasında sıkıntı diğer belirtileri göstermeye olmadığından emin olun.
      2. doğrudan hayvanın anüs altında steril, tartılır ependorf tüp tutun. Tüp fare ile doğrudan temas etmediğini zorunludur.
         1. Hayvan defecates olarak, bir tüp içine dışkı pelet toplar. Tüm dışkı örnekleri toplanır kadar oda sıcaklığında tüpü bulundurun. Bir fare arınmak için Bu nedenle dışkı toplamak için tekrar denemelerini gerektiren, birkaç dakika sürebilir.
      3. Analitik ölçekte dışkı içeren tüpler tartılır. Dört ondalık basamağa (örn 1,0021 g) yuvarlama, tüp ağırlığını kaydedin. olarak elde kilo gösterelim "nihai tüp ağırlığı."
      4. doğrudan dışkı toplama sonra bakteri sayımı için anaerobik odasına dışkı örnekleri geçmektedir.
   2. Otopsi sırasında fare çekal içeriği steril koleksiyon
      1. İkincil tedbirler tarafından takip CO ₂ boğulma tarafından insani ötenazi sonra, çekum ²⁵ elde etmek için bir nekropsi gerçekleştirin. çekum gastrointestinal sistemin büyük, virgül şeklinde bölümdür.
      2. steril plastik Petri kabı üzerine çekum yerleştirin. tek kullanımlık steril hayır kullanın. 10 neşter bıçak çekal içeriğini ortaya çıkarmak için kesenin kör ucundan açık çekum kesmek için.
         1. Yavaşça neşter bıçağı ile hafif bir basınç uygulayarak ve çekum çizi kısmına doğru içeriği süpürme yoluyla çekal içeriğini ayıklayın.
            NOT: Bakım histopatolojik inceleme için sunulacaktır çekal doku, bozmayacak alınmalıdır.
      3. toplanmasını hemen izleyen bir steril, tartılır mikrosantrifüj tüp içine çekal içeriğini yerleştirin. çekal içeriği sadece yaklaşık 10 mg bakteriyel sayımı için gereklidir.
      4. Analitik skal üzerinde çekal içeriği barındıran tüpleri tartmake. Dört ondalık basamağa (örn 1,0021 g) yuvarlama, tüp ağırlığını kaydedin. olarak elde kilo gösterelim "nihai tüp ağırlığı."
      5. Bakteriyel numaralandırma için anaerobik odasına çekal içerik örnekleri geçirin.
2. C. difficile bakteriyel numaralandırma
   1. C. difficile için numaralandırılan edilecek içeriklerin (dışkı veya çekal) son ağırlığını hesaplayın. dan "nihai tüp ağırlığı" çıkarılarak bu yapılan "tüp ağırlığı."
   2. 1X PBS içine içeriğinin 1:10 seyreltme hesaplayın ve buna göre tekrar süspansiyon. fekal pelet, (ek dosya "Örnek Hesaplamalar" bölümüne bakınız) yavaşça çözelti içine pelet bozmaya pipet ucu kullanın.
   3. Anaerobik içeriği oturuşmaya bırakılmış, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında, bu yeniden süspansiyon haline örnekleri inkübe edin.
   4. enum 1x PBS içinde, her numune için seri seyreltileriçeriği (dışkı veya çekal) gramı başına CFU durmasýna. anaerobik bu gerçekleştirin.
   5. aseptik teknik kullanılarak, TCCFA plakalarına her seri seyreltme 100 ul aktarın. steril bir L-şekilli serpme kullanarak, eşit plaka üzerinde yaymak için medyaya uygulanan seyreltme yayıldı. Hatta seyreltme yayılma kolonilerin doğru sayım için gereklidir.
   6. 37 ° C'de 24 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin. Bu zamanda, içerik (dışkı veya çekal) gramı başına CFU elde etmek için C. difficile koloniler numaralandırmak. C. difficile kolonileri sarı düz ve soluk ve düzensiz kenarları ve buzlu cam görünümü ²⁴ var.
      NOT: Bu protokol, ileum ve kolon içerik de dahil olmak üzere, diğer sıçangil GI içeriğine, C. difficile numaralandırmak için kullanılabilir. PCR plakaları seri dilüsyonları yapmak için kullanılabilir.

5. Vero Hücre Sitotoksisite Tahlili C. difficile Toksin Cytotoxi belirlememizeŞehir

NOT: Bu deney örnekleri Nekropside toplandı ve -80 ° C'de saklandı fare modeli tamamlandıktan sonra yapılması tavsiye edilir. Aseptik hücre kültürü teknikleri, bu tahlil sırasında Vero hücreleri kirlenmesini önlemek için gereklidir. Bu protokol gerçekleştirmek için 2 gün sürer. Tüm dışkı ve bu deneyde kullanılan bağırsak içeriği tartılmış steril mikrosantrifüj tüpü içinde saklanmalıdır (ile gösterilir "boru ağırlığı" yukarıya bakın). (Içindekiler dahil) son tüp ağırlığı en yakın dört ondalık basamağa analitik bir ölçekte aracılığıyla ölçülür (yukarıdaki bölümüne bakınız). Çok kanallı bir pipet kullanın Bu deney için tavsiye edilir.

Not: başlamadan önce, aşağıdaki öğeler mevcut sağlamak olduğu: Vero hücreleri, DMEM 1x "olarak ifade% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ortam (Eagle ortamı (DMEM) 1x Dulbecco modifikasyonu medya, "Malzemeler ve tamamlayıcı dosyasına bakın),% 0.25Ultra saf su içinde 1 ug / ml, 3 ul tripsin-EDTA, 1 x PBS,% 0.4, tripan mavisi, 96 çukurlu bir hücre kültürü düz tabanlı plaka, 96 oyuklu filtre plakası, Clostridium difficile toksin A (eş-payı ve -80 ° C) mağaza, Clostridium difficile Antitoksin, hesaplamalar ve plaka haritaları için bir çalışma sayfası (;) ek dosyalarına bakın.

Not: Dikkat C. difficile ve toksin personel poz için bu tahlil sırasında alınmalıdır.

1. Vero hücreleri, bölme (Gün 1)
   1. 37 ° C su banyosu içinde DMEM 1x ortamı,% 0.25 tripsin-EDTA ve 1 x PBS ısıtın.
   2. Hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C ve% 5 _CO2) Vero hücrelerinin bir şişeyi elde edilir ve steril hücre kültürü laminar akış başlığı içinde yerleştirin. Kullanmadan önce kaputu ve ekipman aşağı silmek için% 70 etanol kullanın. serolojik pipet kullanarak, Vero hücrelerinde çıkarın ve bir atık c içine atmak için doku kültürü şişesi medya aspiratOntainer.
   3. 1x PBS, 5 ml Vero hücreleri durulayın doku kültür şişesi içinde (önceden ısıtılmış). PBS aspire ve bir atık kabı içine atın.
   4. doku kültür şişesine% 0.25 tripsin-EDTA 5 ml. 3 dakika - 2 bir temas zaman tanıyın. Bu süre içinde, hücreler şişe yüzeyinden gelmeye başlar gözlemleyin. Yavaşça Vero hücreleri gevşetmek için yan doku kültürü şişesi yan sallayın.
   5. Tripsin-EDTA ile temas süresinden sonra, hemen doku kültür şişesi içine DMEM 1x ortam 5 ml. Bu Tripsin-EDTA nötralize edecektir. hafifçe balonun arkasında kapalı herhangi bir bekâr Vero hücreleri yıkamak için bu çözümü kullanın. Sonra, 15 ml konik tüp içine bu karışımı aktarmak için bir serolojik pipet kullanın.
   6. 180 x g'de 5 dakika ve 25 ° C'de konik tüp Vero hücreleri santrifüj. santrifüj düzgün dengeli olduğundan emin olun. Santrifüjden sonra, konik tüp altındaki Vero hücreleri görünür bir pelet görüyoruz. DISR özen gösterinBu pelet upt. konik tüp süpernatant kapalı aspire ve atın.
   7. DMEM 1x ortam 3 ml Vero hücreleri tekrar.
2. Vero hücre sayımı
   1. % 0.4 tripan mavisi, 100 ul (Kademe 5.1.7 yapılan) Vero hücre süspansiyonu 100 ul ekle. Yavaşça yukarı ve aşağı çözüm pipetleme karıştırın.
   2. Bir hemasitometre her bölmeye Bu karışımın 10 ul ekle.
   3. hemasitometre dört parçaya içinde yaşayan hücrelerin sayısını. Ölü Vero hücreleri Tripan Blue alacak ve böylece (bu hücrelerin sayılmamalıdır) mavi boyanmış olacaktır. Bu numaraları kaydedin "Vero hücre çalışma sayfası," sağladı.
   4. Tüm dört çeyrek daireye canlı Vero hücrelerinin toplam sayısını toplamak ve ortalama hesaplamak. Hücrelerden çok 2 100 yana ul seyreltme faktörü, sıvının 200 ul'lik toplam içindedir.
   5. düzeltme faktörü ile çarpın "vermek; hücre sayısı / ml "hemasitometre kullanırken, düzeltme faktörü her zaman 10 ^4'tür vermek için toplam hacim ile çarpın." hücrelerinin toplam sayısını "..
3. Her deney için Wells Gerekli Sayısını Belirleme
   NOT: Tek bir örnek (dışkı ya da bağırsak içeriği ya) nüsha halinde yapılacak 24 ayrı kuyu gerektirir. Oyuk başına 10 ⁵ Vero hücre konsantrasyonunda (90 ul toplam hacim) gereklidir.
   NOT: Bir gece boyunca 37 ° C, oyuk başına 10 ³ Vero hücreleri bir konsantrasyonda Vero hücre 96 oyuklu plakalar inkübe isterse uzun kuluçka süresi hesaba önerilir. Vero hücre çalışma sayfası içinde Hesaplamalar bu değişiklikleri hesaba ayarlanması gerekir.
   1. (Kademe 5.2 arasında, Vero hücre çalışma sayfası, Resim kullanın) mevcuttur Vero hücreleri miktarına göre kullanılabilir kuyu sayısı belirler.
   2. hacmi belirlemekİstenen kuyu sayısı doldurmak için gerekli Vero hücre süspansiyonu (numune sayısına göre test edilir). herhangi bir ek hacim (sağlanan Vero hücre çalışma sayfası kullanın) hata pipetleme için hesaba eklenir emin olun.
   3. Deney için gerekli hacmi elde etmek için DMEM 1x medya (Kademe 5.1.7 elde edilen) Vero hücre süspansiyonu seyreltilir.
4. 96 oyuklu bir hücre kültür plakasına Tohum Vero hücreleri,
   1. Aşama 5.3.2 arasında Vero hücre yeniden süspansiyon kullanılarak, 96 çukurlu bir hücre kültürü düz tabanlı plakanın her oyuğuna Vero hücre süspansiyonu 90 ul bir çok kanallı pipet kullanın.
   2. Oyuklara toksini (örnekler) ilave edilmeden önce 4 saat en az _CO2, 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içinde Vero hücreleri ile plaka inkübe ve% 5. Bu inkübasyon süresi Vero hücreleri her bir alt uymak sağlayacaktır.
5. (Dışkı veya Örneklerinden Stok Çözümleri oluşturmaBağırsak İçerik)
   NOT: Tüm numuneler analitik bir ölçekte aracılığıyla ölçülen "tüp ağırlığı" ve "nihai tüp ağırlığı" olmalıdır. hesaplamalar için Vero hücre çalışma sayfası kullanın.
   1. içeriğinin ağırlık hesaplayın. mg için g dönüştürmek, sonra ul mg. 1x PBS içinde bir 1:10 seyreltme yapmak için gerekli çözümün ul nihai toplam sayısını hesaplayın. örnek eklemek için 1x PBS toplam miktarını hesaplayın.
   2. örnek (yukarıda hesaplanan) 1x PBS toplam hacim. aerobik, bu gerçekleştirin ve aseptik teknik kullanılarak. fekal pelet, yavaşça çözelti içine pelet bozmaya pipet ucu kullanın.
   3. Numuneler vorteksle ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3,522 x g'de santrifüj. santrifüj düzgün dengeli olduğundan emin olun. pelet bozabilir ve çözelti içine numuneyi tekrar süspansiyon için dikkatli olun.
      NOT: Yalnızca birkaç örnek işleniyor eğer Adım 5.5.3 sırasında, içeriği sterilize edilebilir96 çukurlu bir filtre plakası kullanılması yerine tek bir 0.22 mikron filtre içinden geçirilerek. Bazı örnekler bu tekniği kullanarak tüm hacim içeriği sterilize etmek için birden çok filtre gerekebilir.
   4. süpernatan 150 ul alarak ve 96 çukurlu bir filtre plakası üzerinde ayrı ayrı oyuklarına yerleştirerek Örnek / PBS karışımı sterilize edin. içeriği bu plaka filtre böylece 96 çukurlu bir hücre kültürü düz tabanlı plaka üzerine güvenli bir şekilde filtre plakası yerleştirin.
   5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 431 x g'de filtre plakası / hücre kültürü levha istifi santrifüjleyin. santrifüj düzgün dengeli olduğundan emin olun ve filtre plakası / hücre kültürü plakası yığını sıkıca hizalanmış olduğunu ve santrifüj sırasında kayması olmaz.
      NOT: Bu filtrelenmiş içerik seyreltme plakaları kullanılacaktır 10 ^-1 hisse senedi vardır.
   6. buz üzerine süzüldü örnekleri ile plaka koyun.
6. Oluşturma Seyreltme Plate 1.
   NOT: Sulandırma Plate 1. (1 DP #) pozitif (C. difficile Toksin A) ve negatif (1x PBS) kontrollere (Vero hücre çalışma sayfası DP 1. düzeni bakınız) da dahil olmak üzere numune başına 6 kuyu, gerektirecektir.
   1. Bu deney için pozitif kontrol (C. difficile Toksin A) hazırlamak için, -80 ° C ila 3 ul alikotları (1 ug / ul) elde edilir ve 0.01 ug / ml bir nihai konsantrasyon elde edildi, ultra saf su 297 ul ekle. buz üzerine yerleştirin.
   2. Her bir örnek için onların yoğunluktaki (10 ^{-1 -6} 10) ile kuyu Etiket ve pozitif ve negatif kontroller göstermektedir (DP 1. düzeni bakınız).
   3. Her bir oyuğa 1x PBS uygun bir şekilde artırmıştır. 10 ^-1 kuyu NO PBS ekleyin. 10 ^{-2 -6} ila 10 kuyuları, 1x PBS 90 ul ekleyin.
   4. Her bir oyuğa numune, uygun bir şekilde artırmıştır. 10 ^-1 kuyu, her bir örnek için 10 ^-1 stokunun 100 ul ekleyin (filtre plat gelen Adım 5.5.7 bkze). 10 ^-2 10 ^-6 kuyuları, seri dilüsyonları yapmak; 10 ^-1 kuyudan 10 ul alarak ve iyi 10 ^-2 ekleyerek başlayın. 10 ^-6 seyreltme dışarı seri dilüsyonları devam edin.
   5. şeffaf plastik yapıştırıcı mührü ile DP # 1 tabak kapatın ve buz üzerine yerleştirin.
7. Oluşturma Seyreltme Plate 2.
   NOT: Sulandırma Plakası (DP # 2) pozitif ve negatif kontroller de dahil olmak üzere her bir örnek, (Vero hücre çalışma sayfası DP 2. düzeni bakınız) 6 kuyu 2 şeritli gerektirecektir.
   1. Her bir örnek için onların yoğunluktaki (10 ^{-1 -6} 10) ile kuyu Etiket ve pozitif ve negatif kontroller göstermektedir (DP 2. düzeni bakınız). ya da ( "antitoksin kuyu" olarak belirtilen) antitoksin ile örnek adı ( "örnek kuyu" olarak belirtilen) örnek adı ile kuyu etiketleyin.
   2. Bu test için gerekli antitoksin miktarını hesaplayın. NOT: antitoksin 25x stokihtiyacı Çözelti 1 x PBS içinde 1:25 seyreltilir. buz üzerinde hazırlanan antitoksin 1x çözüm yerleştirin.
   3. Için "örnek kuyu," iyi ki numunenin tüm yoğunluktaki (10 ^{-1 -6} 10) her 1x PBS 20 ul ekleyin. Için "antitoksin kuyuları," iyi ki numunenin tüm yoğunluktaki (10 ^{-1 6} ila 10) her 1x antitoksin 20 ul ekleyin.
   4. 6 ve satır 7 - - satırlar 1 DP # 2 belirlenmiş kuyu içine DP # 1 kuyularda Transferi seyreltilmiş örnek 20 ul 12 (Vero hücre çalışma sayfası DP 2. düzeni bakınız). Yukarı ve aşağı pipetleme hafifçe çözüm karıştırın.
   5. berrak bir plastik yapıştırıcı conta DP 2. Kapak ve oda sıcaklığında inkübasyon 40 dakika izin verir. Bu inkübasyon antitoksini bağlanan ve bu şekilde etkisiz hale ve C. difficile toksinler için sağlamaktır.
   6. İnkübasyondan sonra, (uygun Vero hücre kuyulara DP 2. karışımın 10 ul V Vero hücre plaka taslağına bkzero Hücre Çalışma). Yavaşça kuyuların alt yüzeye yapışık Vero hücreleri bozmayacak özen aşağı yukarı pipetleme çözüm karıştırın.
   7. 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içinde bir gece boyunca Vero hücre plakası inkübe ve% 5 _CO2.
8. Işık Mikroskobu kullanılarak Yuvarlama için Vero Hücreleri değerlendirin (2 gün)
   NOT: Vero hücre plakasına örnek karışımlar eklerken 10 faktör ile sulandırma faktörü değişiklikleri (örneğin, 10 ^-3 şimdi 10 ^-4 olduğunu) olduğunu hatırlayın. Mevcut antitoksin olan kuyu hiçbir Vero hücre yuvarlama az dikkat olmalıdır. Vero hücre yuvarlama (sitotoksisite) C. difficile toksin içermeyen örneklerde dikkat edilecektir. Sitotoksik aktivitesi örnek ve antitoksin ihtiva eden bir seyreltme nötralize ise, Vero hücre sitotoksisite elde C. difficile toksin varlığı onaylandı.
   1. Bir ligh kullanılarak Vero hücre yuvarlama için incelenmesi200X büyütmede t mikroskop. (Pozitif kontrol dahil) numune kuyuları kaydetti% 80 Vero hücre yuvarlama için son bir kuyunun seyreltme kaydedin.
   2. numunenin gramı başına% 80 Vero hücre yuvarlama üretilen yüksek seyreltisinin karşılığı olarak tanımlanan sitotoksik titresi hesaplanır. Örneğin, en yüksek seyreltme sonra seyreltme faktörü bu örnek için 10 ^-6 olacaktır 10 ^-5 ise. Böylece, günlük [nihai seyreltme faktörü] / g örnek 6 karşılıklı titreye verir [10 ^6], log olacaktır.
      Not: - 4 geçit ve bu tahlilde ²⁶ kullanımlarına en fazla 30 pasajlar önce Vero hücreleri gereken en az 3 uğramıştır.

Sonuçlar

temsili bir çalışma sırasında, 5 haftalık C57BL / 6 ağırlık fareleri 5 gün boyunca içme su (0.5 mg / ml) içinde Cefoperazone'un ile önceden işleme tabi tutulmuş ve 2 gün düzenli içme suyu ile yıkayın izin verildi. Farelere 0. günde (Şekil 1A) oral gavaj yoluyla C. difficile R20291 10 ⁵ sporları ile tehdit edildi. Fareler 14 gün boyunca CDI kilo kaybı ve klinik bulgular (uyuşukluk, iştahsızlık, ishal ve kambur duruş) i...

Tartışmalar

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner	SSS Navigator	48027	This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter	Fisherbrand	09-720-3	Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue	Gibco	15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin	Gibco	15070-063
10% heat inactivated FBS	Gibco	16140-071	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe	BD Medical Supplies	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap	Corning	430917
96 well cell culture flat bottom plate	Costar Corning	CL3595
96 well filter plate	Millipore	MSGVS2210
Adhesive Seal	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone	Becton Dickinson	211684	Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A	List Biological Labs	152C	Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine	Sigma	C6880	Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose	Fisher	L95500	Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous)	Sigma	M2643	Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter	Millex-GS	SLGS033SS	Filter for TCCFA plates
Na2HPO4	Sigma	S-0876	Part of TCCFA plates (see below)
NaCl	Fisher	S640-3	Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade	Miltex, Inc	4-410
PCR Plates	Fisherbrand	14230244
Plastic petri dish	Kord-Valmark Brand	2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader	Fisherbrand	14-665-230
Syringe Stepper	Dymax Corporation	T15469
Taurocholate	Sigma	T4009	Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664	Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope	Olympus Life Science
DP27 camera	Olympus Life Science
cellSens Dimension software	Olympus Life Science