Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Özet

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Özet

Meme kanseri tüm dünyada kadınlarda kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. 15 ay - Karaciğer metastazı sadece 4.8 ortalama sağkalım oranları ile kötü sonuçlar meme kanseri metastazı olan olguların% 30 yukarı ve sonuçlar yer almaktadır. primer tümör hücresi xenograftlarının ve spontan tümör modelleri dahil olmak üzere meme kanseri metastazı Güncel kemirgen modelleri, nadiren karaciğer metastaz. Kalp ve intrasplenik enjeksiyon modelleri ancak bu modeller sayesinde enjeksiyon yerinde tümör büyümesini önlemek için dalağın çıkarılması eşlik eden ikincil site metastazı ile eleştirilmiştir veya tehlikeye bağışıklık yoluyla olabilir, karaciğer metastazı neden yoktur. gelişmiş karaciğer metastazı modelleri ihtiyacını, karaciğer geliştirildi öncelikle ve doğrudan tümör hücrelerini sunan fare portal ven enjeksiyon yöntemi çözmek için. Bu model diğer organ veya dalağın alınması eş zamanlı metastaz komplikasyon olmadan karaciğere tümör hücrelerini sunar. seçmekkan kaybının kontrol etmek için enjeksiyon yerinde 10 ul, ≥ 32 gauge iğne ve hemostatik gazlı bez - imized portal ven protokolü 5 küçük enjeksiyon hacimleri kullanır. metastatik potansiyelin test edildi değişen üç singeneik meme tümörü hatları kullanılarak Balb / c dişi fare portal damar enjeksiyonunu yaklaşımı; yüksek metastatik 4T1 hücreleri, orta metastatik D2A1 hücreleri ve düşük metastatik D2.OR hücreleri. daha az agresif D2.OR hattı için yüksek metastatik 4T1 ve D2A1 hatları ile karaciğer metastazlarının gelişimi için 40 gün ve> 55 gün - 20 ~ bir gecikme ≤ 10.000 hücre / enjeksiyon sonuçlarının Konsantrasyonları. Bu model karaciğer, meme kanseri metastazı incelemek için önemli bir aracı temsil ve sık sık kolorektal ve pankreatik adenokarsinomlarında dahil karaciğer metastaz diğer kanserler için geçerli olabilir.

Giriş

Karaciğer için Meme Kanseri Metastaz

Karaciğer, kemik ve akciğer ^1-3 ile birlikte meme kanseri metastazı ortak bir sitedir. Meme kanserli hastalarda karaciğer metastazı 4,8 itibaren 15 ay ^6-9 karaciğer metastazı aralıkları ile meme kanseri hastalarının ortalama yaşam olarak, çok kötü sonuçlar ^4,5 bağımsız bir prognostik faktördür. Buna karşılık, akciğer veya kemik metastazı olan meme kanserli hastalarda 9 27.4 ay ^8,9 ve 16,3 56 ay sırasıyla ^8,10-12, medyan sağkalım oranlarına sahiptir. Metastaz Primer tümör tümör hücresi yayılması ile başlar ve nedeniyle organa ^13-15 olan dolaşan tümör hücrelerinin tohumlama ve oluşumun hasta mortalite ile sona metastatik kaskad, şu şekilde de ifade çok aşamalı bir süreçtir. % 10 - metastaz Kemirgen modelleri metastatik kaskad sadece 0.02 ile son derece verimsiz olduğunu ortaya koymuşturaleni metastazı ^16,17 kuran dolaşan tümör hücrelerinin. Metastatik verimsizlik biri büyük darboğaz anlayışı siteye özgü metastaz önemini vurgulayarak, metastatik nişler ¹⁸ olarak adlandırılan, ikincil siteler eşsiz doku mikroçevrelerde tarafından belirlenir. Metastatik niş nüks siteye özgü, ve kısmen, farklı hücre dışı matris proteinlerinin ^19,20 birikimi, çeşitli bağışıklık hücre popülasyonlarının ^21-23 infiltrasyonu ve çok sayıda sitokin düzensiz üretimi de dahil olmak üzere değiştirilmiş doku homeostazında ile karakterize edilir, kemokinler ve büyüme faktörleri ^15,18,24,25. Böylece, doku spesifik metastatik niş bir anlayış metastatik hastalık hedef nasıl bir anlayış önce gelir. Ancak, karaciğer metastazı sağlam modeller eksiktir. Dahası, karaciğer metastazı geliştirilmiş modelleri meme kanserli hastalarda wi için yeni hedefler ve etkili tedaviler belirlenmesi için gerekli olacakinci karaciğer metastazları.

Karaciğer için Meme Kanseri Metastaz Eğitim için Modeller kurulmuş

Karaciğer immün sistemi baskılanmış farelerde insan kanser hücresi zenograftlarını dahil Şu anda mevcut modeller meme kanseri metastazı incelemek için. ^{- / -} Veya SCID bağışıklık sistemi zayıflamış sıçangil ana ^26-29 Bu modeller, tipik olarak, MCF-7, MDA-MB-231 ve çıplak, Rag1 da çalışılmış insan göğüs kanseri hücre çizgileri kullanın. Ksenograft modelleri insan kaynaklı kanser hücre hatları içeren avantajı sağlamak, ancak metastaz ^30-32 ve tedavi direnci ^33-35 bağışıklık hücreleri için son takdir verilen, tam bağışıklık yetkili konakta metastaz çalışma çok önemlidir. Bağışıklık yetkili ana karaciğer meme kanseri metastazı çalışma modelleri ile ya da cerrahi olmayan memenin yağlı pedine sinjenik tümör hücreleri (örneğin, 4T1 ve D2A1 hücre çizgileri) ortotopik enjeksiyon arasında,primer tümör rezeksiyonu ve metastaz ^36-38 sonraki değerlendirme. Notun, ortotopik nakli modelleri karaciğer metastazı oranı çok düşük ya da akciğer ^39,40 gibi diğer metastatik sitelere göre varolmayan veya akciğer metastazı kurulduktan sonra karaciğere özgü metastaz ^37,39 çalışma zorlaştıran oluşur .

Spontan genetik olarak meme kanseri modellerinden tümör eksplantlannın sinjenik tümör hücreleri gibi naif ana meme yağ yumuşak dokusu içine yeniden enjekte edilebilir. Örneğin, son zamanlarda orthotopically wild tip hosts enjekte edildiğinde K14 ^Cre ecad ^{f / f} P53 ^{f / f} fareler, spontan tümörler hangi model invaziv lobüler meme kanseri, tümörleri geliştiği bildirilmiştir. Onlar 15 mm ² ulaştıktan sonra bu tümörlerin cerrahi rezeksiyon ardından, farelerin% 18 karaciğer metastazı ^40,41 ilerledi. Üçüncü bir yaklaşım karaciğer metastazı yararlı kullanımlarını modellemek içinGenetik olarak farelerde spontan metastazı. Bugüne kadar, hali hazırda karaciğere yayılmış meme kanseri metastazı spontane fare modelini raporları seyrektir. İstisnalar H19-Igf2 p53 ^{fp / fp} MMTV Cre Wap-Cre ve K14 ^Cre ecad ^{f / f} P53 dahil ^f karaciğer metastazı farelerin düşük bir yüzdesinde gelişir genetiği değiştirilmiş fare modelleri, ^{f / 38,41- 43.} Genetiği değiştirilmiş fare modelleri metastatik kaskad, güçlü ve klinik olarak anlamlı modelleri sağlayan tüm aşamalarında çalışma kolaylaştırmak Böylece, onlar yüzünden karaciğer metastazı ³⁸ düşük oranlarda sınırlıdır.

Çeşitli metastaz modelleri, primer tümörün ve intravasation tümör hücrelerinin yayılması dahil olmak üzere metastatik kaskad ilk adımları atlayabilir. Bu modeller ekstravazasyon ikincil sitelerde tümörlerin kurulması, metastatik kaskad sonraki adımlarda ilgili soruşturma izin verir. intracardiac enjeksiyon modeli aort yoluyla dolaşım sistemine tümör hücrelerini dağıtır sol ventrikül içine tümör hücrelerini sunar. Intrakardiyak enjeksiyon başarılı bir enjeksiyon onaylamak için hücreler enjeksiyon yerinde ya da lusiferaz biyolüminesans gibi diğer görüntüleme yöntemlerinin ultrasonografi eşliğinde görüntüleme etiketli gerektirir. Sol karıncık yoluyla tümör hücre enjeksiyonu diğer organlarda ^44-48 arasında kemik, beyin, akciğer, ve / veya karaciğer metastazı, neden olabilir. Çünkü çoklu-organ metastazları, bu fareler sık ​​tam karaciğer içinde metastatik büyümeye araştırmak için etkilemediğini önce açık karaciğer metastazı gelişimine ötenazi gerekmektedir. önemli ölçüde multi-site metastaz gelişimini en aza indirir alternatif bir yaklaşım intrasplenik enjeksiyon modelidir. Intrasplenik enjeksiyon portal ven ^49,50 haline superior mezenterik ven ile birleştiği splenik ven yoluyla tümör hücrelerini sunar. Hayvanlar outgr için izlenebilirkaraciğerde Metastazların owth diğer bölgelerde metastaz oluşumu çok düşük olduğu için, ve bunun bir sonucu olarak, hayvanın genel sağlık ^49,50 korunur. Ancak, bir prosedür olduğunu etkileri bağışıklık fonksiyonu, intrasplenik modeli dalak tümörleri ^49,50 önlemek için splenektomi gerektirdiğini dikkat etmek önemlidir. Örneğin, miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarı, dalak kaynaklanan ve iskemi ^51,52 Aşağıdaki yara iyileşmesi sırasında fagositik ve proteolitik aktivitesi için sorumlu olan Ly6C ⁺ monosit alt-infiltrasyonu ile karakterize edilir. Splenektomi ile ⁵² yara iyileşmesi yardımcı monosit popülasyonlarında gözlenen azalma var. Bundan başka, splenektomi, özellikle dolaşım ve intra-tümör CCR2 ⁺ CD11b ⁺ Ly6C ⁺ monositik miyelo sayısında bir azalma ile, bir küçük hücreli dışı akciğer kanseri modelinde ana tümör büyümesini ve akciğer metastazları azaltmak için gösterilmiştirid hücreleri ^53. Buna ek olarak, kolon kanseri hücrelerinin intrasplenik enjeksiyonunun ardından splenektomi mezenterik lenf düğümleri ve karaciğer metastazı ⁵⁴ anti-tümör, doğal öldürücü hücrelerin azaltılmış seviyelerine yol açtı. Özetle, bu bulgular splenektomi metastatik hücre kaderi için daha sonraki sonuçları ile bağışıklık sisteminin rolünü ödün düşündürmektedir.

Karaciğer Metastazı Portal Ven Enjeksiyon Modeli

fareler nedeniyle çoklu organ metastaz için tehlikeye atmaz koşullar altında tam bağışıklık yetkili konakta karaciğere meme kanseri metastazı, araştırmak, bir portal ven enjeksiyon modeli geliştirilmiştir. Intraportal enjeksiyon modelleri kolorektal ^55,56 ve melanoma ¹⁶ hücre çizgilerinin karaciğer metastazı çalışma önce kullanılmıştır; burada singeneik meme tümör hücre metastazı model intraportal enjeksiyon uygulamasını anlatmak. Bu model incelemek için kullanılabiliraçık lezyonlara meme kanseri hücre ekstravazasyon ve tohumlama, ölüm / çoğalması / dinlenmesi ile ilgili tümör hücre kaderini belirleyen ve akıbet de dahil olmak üzere metastatik kaskad sonraki aşamaları. Bu modelde, singeneik meme tümörü hücre çizgileri bağışıklık yetkin Balb / c dişi fare portal ven, dalak çıkartılmadan karaciğere ilk ve doğrudan doğruya tümör hücreleri sunan bir yöntem ile enjekte edilir. Bu modeli, istihdam edildi yüksekten düşüğe kendi metastatik yeteneği arasında değişen dört meme tümör hücre hatlarının kullanılmasını geliştirmek için: D2.OR, D2A1 ve 4T1 ve yeşil floresan protein (D2A1-GFP) ile etiketlenen D2A1 istihdam var tümör hücre enjeksiyonundan sonra zaman noktaları erken araştırmak. 4T1 spontan bir MMTV ^+, Balb / c dişi fare ^36,37 ortaya çıkan ve meme yağ pedi birincil tümörlerin ^39,57,58 gelen akciğer, karaciğer, beyin, kemiğe metastaz 410.4 tümöründen türetilmiş yüksek ölçüde metastatik hücre hattıdır. D2A1 tümör hücreleri werE ayrıca ilk D2 hiperplastik alveoler nodül hücresi transplantasyonundan sonra, bir Balb / c konakçıda ortaya çıkan kendiliğinden meme tümöründen türetilen, ve akciğer ^59,60 birincil tümörden metastatik olduğu teyit edilir. Onlar birincil tümörü kaçış ve ikincil siteler varmak rağmen D2.OR tümör hücrelerinin nadiren uzak metastaz ^60,61 kurmak, D2A1 hattına bir metastatik olmayan kardeş hattı ve.

Buna ek olarak, non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) sırasında ya da cerrahi müdahale sonrasında da dahil olmak üzere yaygın olarak kullanılan ağrı tedavisi ilaçların kullanımını önlemek için önemlidir. NSAID'ler, belirli göğüs kanserlerinin ^62-65 anti-tümör aktiviteye sahip olan ve NSAID bazı sınıfları potansiyel karaciğer metastazı çalışma ve karaciğer metastazı niş ödün, hepatotoksisite ^66,67 riskini artırır. Dahası, çalışmalar yanlısı metastatik ext azaltarak, NSAID doğrudan doku mikro etkilediğini düşündürmektedirracellular matris proteinleri ^68-C tenaskin ve fibriler kollajen ^62,65. Seçenek olarak ise, bir opioid türevi buprenorfin kullanımı, opioidler, anti-tümör aktiviteye ^70, çünkü kemirgen ağrı yönetimi ⁶⁹ etkinliği ve delil olmaması için kullanılmıştır. karaciğer gereksiz zarar vermemek için 10 ul - Bu portal ven enjeksiyon modeli 5 küçük enjeksiyon hacimleri için optimize edilmiştir. modeli aynı zamanda küçük çaplı (≥ 32 ölçü) ve hemen işlem sırasında kan kaybını en aza indirmek için enjeksiyonu takiben hemostatik gazlı bez kullanımı ile iğneler içerecek şekilde optimize edilmiştir. Bu optimize edilmiş püskürtme parametrelerinin aksine, hücre sayıları hücre çizgisinin tümörijenik potansiyeline göre bireysel olarak belirlenmelidir. Ancak, uzun vadeli çalışmalar için / enjeksiyon ≤ 10,000 hücre başlayan tavsiye edilir. Örneğin kısa uç noktalara (örneğin, 24 saat enjeksiyon sonrası) çok daha tümör hücreleri (için,1 x 10 ⁵ - garanti eğer 1 x 10 ⁶⁾ kullanılabilir. Özetle, burada açıklanan portal ven enjeksiyon modeli karaciğer, meme kanseri metastazı çalışma için yararlı bir araç temsil eder ve diğer karaciğer metastazı modellerinin sınırlamaları bir dizi circumvents. Bu model tümör hücre ekstravazasyonu, tohumlama, bağışıklık yetkili fare konaklarda yaşam, çoğalma ve uyuşukluk ve metastatik akıbet erken kaderi kararlarının çalışma kolaylaştırır.

Protokol

Bu makaledeki tüm hayvan prosedürleri gözden geçirilecek ve Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Cerrahi Alan ve Araçların 1. Hazırlık

1. 30 dakika boyunca 124 ° C'de otoklav ile makas, forseps ve hemostat hazırlayın, 1 - planlanmış ameliyatları 2 gün önce. ameliyat sonrası iyileşme için otoklavlanmış ya da steril yatak, kafesleri ve gıda erişimi sağlayın.
2. tercihen bir laminer akış kaputu, aseptik cerrahi zemin hazırlayın.
   1. o yapılırken ısıtma yastığı, ışık kaynağı, anestezi boru ve burun konisi ve cerrahi işlem yakın olacak cerrahi seti başka bir bölümünde de dahil olmak üzere,% 10 çamaşır suyu ile cerrahi alan tüm yüzeyleri silin .
   2. aseptik cerrahi alanda, steril örtü, ışık kaynağı, anestezi boru ve roket ucu konisi, insülin şırınga ile temizlenir ısıtma yastığı yerleştirin1 ml şırınga, bupivakain, suni gözyaşı, steril tuzlu su, 2 x 2 "steril gazlı bez sünger, 4 x 4" steril gazlı bez, 0.5 içine hemostatik gazlı bez kesme - 1 cm ² adet, makas, forseps, hemostat, 4-0 vikril sütür bir otoklava kapta konik bir iğne ve 50 mi% 2 klorheksidin glukonat ile.
   3. buz üzerinde depolanan hazırlanan tümör hücreleri için bu alanda bir oda var olduğundan emin olun.
   4. Cerrahi alanına bitişik bankta, steril yatak ile ikinci bir ısıtma yastığı ve temiz kafesleri ile kurtarma alanında hazırlar.
      NOT: Böyle bir boncuk sterilizatör gibi bu alanda Ayrıca ev öğeler.

2. Portal Ven Enjeksiyon

1. ağrı tedavisi için subkutan 0.015 mg / ml buprenorfin, 100 ul ile 15 hafta, - Planlanan enjeksiyonlar One-saat önce, 8 yaşındaki Balb / c dişi fareler davranın.
   Not: Bu, enjeksiyon protokolü, uygun kullanılarak, herhangi bir yaşta dişi ya da erkek bir fare herhangi bir suşunun tatbik edilebilirsuşu değişiklikler için hücre çizgileri.
2. hücre hattı veya seçim tümör eksplant için protokollere dayalı enjeksiyon için tümör hücrelerini hazırlayın. hayvan koloni bu tür patojenlerin sokulması riskini azaltmak için, murin patojenlerin varlığının uygulamadan önce tüm tümör hücre hatları test edin.
   1. 3 gün enjeksiyondan önce 10 cm doku kültür plakasına D2A1, D2.OR ve 4T1 tümör hücreleri, çözülme hücreleri de dahil olmak üzere genetik olarak özdeş Balb / c, tümör hücresi hatları için, aşağıdaki gün hücreler, 90 olduğu -% 100 konfluansa.
   2. bir kez 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ve 5 dakika için 37 ° C 'de% 0.05 tripsin 2 ml kullanılarak konfluent tümör hücrelerini trypsinize ile 1 gün, aşağıdaki tümör hücresi çözülme yıkama hücreleri. tam ortam 10 ml taze 10 cm tabak içine 8 tam ortam ml (DMEM yüksek glükoz,% 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, ve 1 x penisilin / streptomisin) ve geçiş 01:10 ekleyin.
   3. enjeksiyonu gününde, 1 x PBS ve t ile bir kez yıkama hücreleriyukarıda tarif edildiği gibi rypsinize.
   4. 1500 xg'de tam ortam, 5 dakika boyunca bir dönüş 8 ml tripsinize hücrelerin tekrar PBS 1X 5 ml ortam ve tekrar süspansiyon çıkarın.
   5. canlılık değerlendirmesi için tripan mavisi dışlama kullanarak hemasitometre hücreleri saymak. önceden belirlenmiş bir konsantrasyon ve hacimde 1x PBS içinde enjeksiyon için tekrar süspansiyon hücreleri.
      NOT: 5 - küçük enjeksiyon hacimleri karaciğer gereksiz zarar görmesini önlemek olarak 10 ul tavsiye edilir.
   6. enjeksiyonlar süresince hücreleri buz üzerinde tutun. enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, canlılığı sağlamak için 1 gün için tam ortam kültür içinde laboratuara hücre örneği dönüp yerleştirin.
3. oksijen içinde verilen% 2.5 izofluran (2-kloro-2- (diflorometoksi) -1,1,1-trifloro-etan) - 2 anestezi altında fare yerleştirin. ısıtma yastığı kullanılarak vücut ısısını korumak. Bir ayak tutam bir tepki değerlendirerek tam anesthetization olun ve ardından anestezi bakımı% 2.5 izofluran - 2 de sia.
   NOT: oranını nefes hayvanları izlemek ve prosedür boyunca buna göre izofluran akış hızını ayarlamak için önemlidir.
4. cerrahi işlem sırasında gözlerin aşırı kurumasını önlemek için her gözün üzerinde yapay gözyaşı ya da veteriner merhem küçük bir miktar koyun.
5. maruz karın ile sırt üstü, bir yatar pozisyonda fare yerleştirin.
6. Kimyasal tüy dökücü ile bölgeyi silerek ^4. inguinal meme bezi meme başı aşağı, ikinci kaburga uzaydan kemirgen ventral sol tarafındaki saç çıkarın. 2 dakika sonra gazlı bez ve H ₂ O Bu adım 1 yapılabilir tamamen kaldırmak - - sayısız ameliyatları planlanan eğer zaman kazanmak için 2 gün önceden epilasyon 1 için oturup bekleyin.
7. (% 2 klorheksidin emdirilmiş) bir 2 x 2 "steril gazlı bez sünger alın ve epilasyon yerinde fare silin. Tüm çevredeki sterilize, kuyruk dahil, bakteri cont en aza indirmek içinaraçların aminasyon.
8. epilasyon siteyi ve alkol hazırlık ped ile aşağı çevredeki silin.
9. Üç% 2 klorheksidin ve iki alkol hazırlık pad yıkar toplam aşağı silin% 2 klorheksidin ve alkol adımlarını bir kez daha tekrarlayın ve bir final klorheksidin ile bitirmek. Nihai Klorheksidin kimyasal iç organlara alma klorheksidin önlemek için cerrahi site çevresinde damlayan olmadığını böyle silme etmeyin. NOT: klorheksidin ve alkol cilde ve çevresindeki kürk büyük miktarda Uygulama vücut sıcaklığında önemli bir düşüşe neden olabilir. adımlarda 2.7-2.9 sırasında aşırı hacmi ile silmeyin. bir ısıtma yastığı ile vücut ısısını korumak.
10. steril eldiven ve steril bıçak ile bir steril neşter kullanılarak, farenin sol tarafındaki medyan ve sagital düzlemleri arasındaki deri içine tek bir 1-inç kesi yapmak, kaburgaların alt başlayan ve sadece dördüncü inguinal düzlemi üzerinde biten meme bezi emzik.
11. otoklav veya boncuk sterilize makas ve forseps kullanarak, periton içine benzer bir 1-inç kesi yapmak. meme yağ yastığı içine kesme önlemek ve bağırsaklar, karaciğer, ya da diyafram kesmek için değil emin olun.
12. iç organlar gazlı bez yerleştirilir ve çevresindeki deri veya cerrahi alana temas edilemeyeceğine şekilde kesi yapıldı fare, sol tarafında steril serum fizyolojik ile ıslatılmış 4 x 4 "gazlı bez yerleştirin.
13. Tümör hücreleri, fare hazırlanması sırasında yerleşmek gibi yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı tümör hücrelerini hazırlayın. Tümör hücreleri ile bir 25 ul çıkarılabilir bir iğne şırınga ve 32-gauge iğne hazırlayın. Tümör hücreleri, iğnenin ucunda ve piston enjeksiyon için uygun bir hacimde kadar şırınga itin; hava kabarcıklarının enjekte etmekten kaçınmak.
14. Herhangi bir harici tümör hücreleri çıkarmak için steril alkol ped iğnenin dışında silin. iğne batmasından kaçınmak için dikkatli kullanın.
15. medyan sid tutunkenara forseps ile cilt ve periton astar dahil kesi, e ve dikkatle steril tuzlu su ile ıslatılmış steril gazlı bez üzerine yerleştirerek, büyük ve küçük bağırsakları dışarı çekmek için steril bir pamuklu bir bez kullanın. portal ven görülünceye kadar büyük ve küçük bağırsakları dışarı çekin.
16. İç nem ve sterilite korumak için tuzlu batırılmış gazlı bez iç organları örtün.
17. Ayrıca, steril eldiven giyme, bir asistan var steril bir pamuk ile yolumdan hafifçe tuzlu batırılmış gazlı bez sarılmış bağırsak tutun tam portal ven ortaya çıkarmak için bez uçlu. Ayrıca, kesi ortalama tarafında bir kenara doku tutmak için otoklava hemostat veya forseps kullanmak gerekli olabilir.
18. konik yukarı bakacak şekilde, bir açı NOT: portal vende Görselleştirme tercih eğer ancak stereo mikroskop kullanılabilir, büyütme olmadan yapılır.
19. Aynı anda basınçla ven steril bir pamuk uçlu aplikatör yerleştirerek iğneyi çıkartın. Ven enjeksiyon sitesi üzerinden 1 cm ² hemostatik gazlı bez - asistan hala bağırsak tutan bir kenara 0,5 tek parça yerleştirin.
    Not: Hemostatik tozu da protokol Bu adım için teşebbüs, ancak enjeksiyondan sonra venöz kan kaybını durdurulmasında etkili değildi.
20. 5 dakika boyunca steril bir pamuk uçlu aplikatör baskısı ile enjeksiyon yerinde hemostatik gazlı bez tutun.
21. dikkatle gazlı bez sopa eğer çevreleyen doku, steril küçük bir miktar için, hemostatik gazlı bez kaldırarak ven kapatılmasına değerlendirmeke salin emmek ve gazlı kaldırmak için kullanılabilir.
22. Kan kaybı, şu anda ortaya çıkarsa, ilave bir 5 dakika boyunca basıncı ile yerinde hemostatik gazlı bez ek parçası eklenir. kan akımı tamamen bittikten sonra, fare gazlı bez çıkarın.
    NOT: cerrahi işlem sırasında kan kaybı dikkatle fare ise kardiyak perfüzyon ile anestezi altında ötenazi gerekir değerlendirilir ve toplam izin verilen kan kaybı hacmi sağlanana veya aşıldığında (araştırmacının kurumsal inceleme kurulları için düzenleyici standart operasyon prosedürlerine göre) olmalıdır.
23. enjeksiyon bölgesinde enjeksiyon siteden ayrılmadan hiçbir kan, bozulmamış sayılır kez yavaşça karın boşluğuna iç organları yerleştirin.
24. periton astar ve sonra basit sürekli veya kesintili dikiş desen kullanarak steril 4-0 vicryl ve konik iğne ile cilt dikin. Tipik olarak, kesik kapatma 10-15 sütür gerektirir.
25. BUPI 100 ul enjektebir insülin şırıngası kullanılarak lokal ağrı yönetimi için kesi boyunca vacaine (5 mg / ml). Hidrasyon 26 gauge iğne ile 1 ml hava ile steril tuzlu su deri altından 0.5 mL enjekte edilir. tamamlamak için 25 dakika - Ameliyatlar 15 alır.
26. ameliyat boyunca steril koşullar korumak için, tüm araç ve gereçler eldivenli elleriyle de dahil olmak üzere fare ile temas sağlamak, temas önce uygun temizlenir. Mümkün kullanımlık steril malzemeler ve eldiven veya minimal kullanmak Nerede% 70 etanol solüsyonu veya% 10 çamaşır suyu çözümü temizlemek için.
27. Birden ameliyatları tek bir oturum için planlanmış ise steril gazlı bez, hemostatik tül 0.5 oyulmuş "4 x 4, steril gazlı bez sünger", 2 x 2 taze steril örtü, insülin şırınga, 1 ml şırınga, steril serum fizyolojik ile ilk cerrahi alan yeniden - 1 cm ² adet, konik iğne ile 4-0 vikril sütür ve% 2 Klorheksidin. ameliyatlar arasında makas, forseps ve hemostat boncuk sterilize ve izinyeterince önce yeniden kullanımı soğutmak için.

Kemirgen Sağlık ve Bitiş noktası Analizleri İzleme 3. Kurtarma,

1. cerrahi işlem tamamlandıktan sonra, 20 dakika en az yatak içermeyen, temiz kafeslerde kurtarma için bir ısıtma pedi üzerinde fareler korumak. anestezi uyanmak için 4 dakika - Fareler tipik olarak 2 alır.
2. tamamen anestezi iyileşene kadar diğer hayvanlarla-yerleşime co ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. Hayvan sternum yatma kendini korumak için yeteneği kazanmış kadar bu bilinç kazanmak ise gözetimsiz bir hayvan bırakmak ve monitör yok.
3. ağrı yönetimi için en fazla 72 saat boyunca her 6-12 saatte aşağıdaki cerrahi, 0.1 mg / kg buprenorfini - farelere 0.05 ver.
4. onlar iyileşme sırasında bozulmadan kalmasını sağlamak için her gün sütürler kontrol edin. dikişler yalanlandı durumunda, kalan sütür kaldırmak ve yerine, anestezi altında fare yerleştirin. enfeksiyon ya da Inflamm halindetirme veteriner kadrosuna danışın.
   NOT: Enfeksiyon veya iltihaplanma bu protokol ile karşılaştı olmamıştır.
5. metastaz çalışmaları için, metastatik hastalığın dışa belirtileri de dahil olmak üzere gözlenen, ancak bunlarla sınırlı değildir kadar günlük sağlık kontrolleri gerçekleştirin: soluk gözleri ve kulakları>% 10 kilo kaybı / kazancı, scruffiness, çevreye dikkat kaybı, karın ödem / assit, ya da bir kambur pozisyon.
   NOT: metastaz zaman çizelgesi iyi anlaşılmıştır kadar yeni bir hücre hattı veya hücre konsantrasyonu ile kullanım için bir model geliştirilirken Günlük kalp kontrolleri, özellikle önemlidir.
6. Çalışma son noktada, CO servikal dislokasyon ₂ inhalasyon fareler euthanize.
   Not: araştırmacının gözetim komitesi tarafından onaylandı ötenazi alternatif yöntemler anestezi altında iken 1X PBS ile perfüzyon de dahil olmak üzere kullanılabilir. Karaciğer Perfüzyon 1x PBS th, portal ven cannulating inferior vena kava kırpma ve iterek yapılır1 / dak 4 ml hızında kaba karaciğer damar - 2 dakika kan ve lökosit dolaşan kaldırmak için.
   NOT: Bu çalışma, hücre çizgisi ve kullanılan konsantrasyona için uç bağlı olarak, belirgin karaciğer metastazı veya otopside anlaşılacaktır ya da olmayabilir. Mikrometastatik lezyonlar karaciğer histolojik analiz ile ortaya çıkabilecektir. Bitiş noktaları çalışma tasarımı göre değişir.
7. İlk safra kesesi kaldırarak makas ve forseps ile karaciğer Özü, ardından karaciğere üstün inferior vena kava kesti. vena kava, portal ven ve karaciğer aşağı hepatik arter yoluyla kesti.
8. yavaşça tüm karaciğer çıkarın ve 1x PBS içinde 5x yıkayın.
9. sol, sağ, orta ve kaudat lob içine karaciğer ayırın.
10. 48 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içine formalin düzeltme karaciğer, oda sıcaklığında çalkalandı. Proses konsantrasyonu ve ksilen artan alkoller bir dizi dokular; parafin sabit doku embed ⁷¹ Yukarı.
    NOT: Alternatif olarak, karaciğer optimum kesme sıcaklığı (OKT) formülü ile bir cryomold doku yerleştirerek ve% 95 etanol batık kuru buz pelet üzerinde dondurma ile ek dondurulmuş olabilir.
    1. Bir mikrotom kullanılarak, bir doku maç kafa boyutu ortaya öyle ki parafin doku bloğu bölünür.
    2. Beş 4 mikron seri bölümleri kesmek, bu analiz için birinci basamağını oluşturan.
    3. doku 250 mikron kesti, atık bu bölümleri atmak.
    4. 250 mikron azından beş 4 mikron seri bölümleri bir ikinci seviyede kesip.
    5. tüm karaciğerden bölüme Gerektiği kadar tekrarlayın. Hematoksilen ve eozin boyama her düzeyde ilk bölümü metastazı ⁷² değerlendirmek.
       NOT: ek dondurulmuş doku için bölümleri kesmek için bir Kriyostat kullanın.
       NOT: mikrometastatik hastalığın tespiti, tümör hücre spesifik boyama gerektirir.
11. oturup tümör büyüme kesi de varsa çalışma fareler kaldırmake, bu enjeksiyonu takiben periton boşluğuna tümör hücre kaçağı belirttiği gibi.
    Not: Bu sorun gözlenmemiştir.

Sonuçlar

Tümör hücreleri, bir cerrahi prosedür vasıtasıyla karaciğer doğrudan teslim edildiği kapı toplardamarı enjeksiyonu modeli, portal ven içine, tümör hücre enjeksiyonu sağlar. antiseptik koşullar altında, bir anestezi fare olarak, ~ 1 inç cerrahi kesi sadece dördüncü inguinal meme bezi emzik düzlemi üzerinde başlayan ve kaburgaların alt biten ortanca ve sagital düzlemleri arasındaki farenin sol tarafında yapılır . Büyük ve küçük bağırsak yavaşça portal ven (Şekil 1A) görselleştirme sağlamak için kesiden çekilir. portal ven ve başarılı içi portal enjeksiyonu doğru anatomik tanımlama çini mürekkebi veya benzeri bir boya enjeksiyon protokolü uygulayarak teyit edilebilir. Portal ven yoluyla doğru enjeksiyon karaciğer derhal ve özellikle teslim edilmesini mürekkep neden olur, ve (akciğer Hindistan mürekkep yayılması figu neden olmaz) 1B yeniden. Bundan başka, D2A1 fare meme tümörü GFP ile etiketlenmiş hücrelerin, tümör hücrelerinin dağılımı kullanarak ciğer karaciğer (Şekil 1C) portal damar enjeksiyonunu teslimi onaylama doksan dakika Enjeksiyondan belirgindir boyunca. Yüksek büyütmede 90 dakika sonrası enjeksiyon de, tümör hücreleri sinüzoidlerin içinde, yanı sıra portal ven kan karaciğer (Şekil 1C) girer portal üçlü yakın, karaciğer parankimi içinde bulunan ortaya çıkmaktadır. Bu veriler, aktif tümör hücre Ekstravazasyon 90 dakika sonrası tümör hücre enjeksiyonu meydana geldiğini ortaya koymaktadır. Birlikte ele alındığında bu veriler, kapı toplardamarı enjeksiyonu modeli karaciğer ve akciğer enjeksiyon hacmi kayda değer taşıma boyunca dağıtılmış mürekkebi ya da tümör hücreleri ile karaciğere doğrudan enjeksiyon hacmi sağladığını teyit etmektedir.

portal ven enjeksiyon modeline sağlamlığını değerlendirmek için, üç separsingeneik fare meme tümörü hücre çizgileri, yetişkin dişi Balb / c farelerinde test edilmiştir yedi. Bu meme tümör hatları meme yağ yastığı modelleri kendi karakterize davranışlarına göre ve son derece agresif ve metastatik 4T1 hücre hattı, daha az agresif metastatik D2A1 hattı ve düşük / non-metastatik D2.OR hattını içeren seçilmiş edildi ^{37,61,73 74.} enjeksiyon başına 2.000 ve 10.000 hücre bu düşük hücre konsantrasyonları ile açık bir metastaz gelişimi için zaman içinde herhangi bir kayda değer farklar test edildi. bu çalışmalar için metastaz vekil belirteçleri karaciğer metastazlarının varlığı ya da yokluğu içi portal teslim onaylamak için karaciğer görsel değerlendirme ve diğer organlar tarafından teyit edildi, bunun üzerine otopsi, haklı damat eksikliği, solukluk ve kilo kaybı gibi kullanıldı . Bu veriler kısa metastaz sağkalım oranları gözlenmektedir olarak 4T1 ve D2A1 hücre hatları enjekte farelere kıyasla, daha agresif meme tümörü hatları temsil ettiği önceki raporlar teyitdaha az agresif D2.OR hattı (Şekil 2A) ile birlikte. Fareler 30 ~ tarafından 4T1 veya D2A1 tümör hücreleri geliştirdi aşikar karaciğer metastazı ile enjekte - 40 gün sonrası enjeksiyon ve D2.OR hücreleri enjekte tek bir fare vardı oysa bazı enjeksiyon sonrası (Şekil 2A) gibi erken 18 gün gibi metastaz gelişti 65 gün sonrası tümör hücre enjeksiyonu - 60 oldu çalışma sonunda, tarafından geliştirilen açık karaciğer metastazı. Metastaz sonra 250 mikron seviyelerinde karaciğer yoluyla kesit ve hematoksilen ve eozin (H & E) boyanan kesitler (Şekil 2B-D) analiz ederek teyit edildi.

fare karaciğerinde belirgin metastatik lezyonların tespitine ek olarak, portal ven modeli aynı zamanda ekstravazasyonu aşağıdaki tek hücre / hücre kümelerinin algılama ve mikro-metastatik lezyonların oluşumu dahil metastatik kademeli olarak daha önce olayları incelemek için kullanılabilir. Mültipleks immünofloresan boyama kullanıldıH & E, küçük lezyonlar varlığını doğrulamak için yeterli değildir onlar, tek hücre ya da mikro-metastatik lezyonlar olarak mevcut olduğunda, karaciğerde 4T1, D2A1 ve D2.OR meme tümörü hücrelerinin tespit etmek. Şekil 3A, hepatosit işaretleyici Heppar-1 için pan-bağışıklık işaretleyici CD45 negatif, epitelyal keratin CK18 pozitif ve negatif tümör hücreleri D2A1 bir farazi mikrometastatik odağı olan temsili bir Balb / c fare karaciğer gösterir. Hepatositler de bu boyama panelinde Heppar-1 kullanımını gerektiren, CK18 için pozitif leke. Önemli bir not safra kanalı epiteli ve karaciğer progenitör hücreler özellikle periportal bölgeleri (Şekil 3A) değerlendirirken, tümör hücreleri ve safra yollarında arasındaki dikkatli ayrımı gerektiren, CK18 için olumlu leke olmasıdır. Bir alternatif gelişmiş yeşil floresan ile etiketlendi singeneik meme tümörü hatlarını kullanmak için immünofloresan tek yaygın hücreleri ve mikrometastatik odaklar tespit edilir multipleks içinprotein (EGFP) ve / veya lusiferaz ve etiket (Şekil 1C) IHC gerçekleştirin. Nedeniyle eGFP, lusiferaz, ve diğer proteinlerin bağışıklık kazandırma için, tür ön hipofiz bezi ^75, yeni bağışıklık yetkin "parlayan kafa" eGFP ifade fare ve lusiferaz gibi, bu proteinlere tolerans kazandırma olan fare modelleri kullanmak esastır. Bu D2A1 tümörün olarak etiketlenmemiş singeneik hatlarının macrometastatic lezyonların tanımlanması için, CK18 / Heppar-1 / CD45 çoklu immünofloresan (Şekil 3B) idealdir.

Şekil 1: Portal Ven Enjeksiyon Karaciğer Doğrudan Tümör Hücreleri sunar. A) kapı toplardamarı enjeksiyonu; Kesi dördüncü inguinal meme bezi emzik düzlemi üzerinde ve hemen ri altında biten, medyan ve sol sagital düzlemlerde arasında yapılırb kafes. PBS enjeksiyonu (solda) ile B) Balb / c karaciğer. portal ven yoluyla çini mürekkebi enjeksiyonu takiben, karaciğer (orta) değil akciğer (sağ) mürekkep alır. C) portal ven aracılığıyla 1 x 10 ⁶ tümör hücrelerinin 90 dakika enjeksiyon sonrası bir Balb / c fare karaciğerinde GFP ile etiketlenmiş D2A1 fare meme tümörü hücrelerinin Örnek ince kesit ve görüntüler. Karaciğerler, formalin, tespit edilmiş parafine gömülmüş, parçalarına ayrılmış ve tümör hücresi, saptama için anti-GFP antikor ile boyandı. Üst panel, yıldız santral venlerin çevresinde non-spesifik hepatosit boyama gösterir karaciğer boyunca dağılmış koyu kahverengi lekeli tümör hücrelerinin (oklar) göstermektedir; ölçek çubuğu = 300 mikron. Alt paneller hala yakından damarsal ile ilişkili 90 dakika sonrası enjeksiyon tümör hücrelerinin temsilcisi görüntüleri gösterir; Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

: fo class = "jove_content"
Şekil 2: Portal Ven Enjeksiyon sonrasında Karaciğer Fare Meme Tümör Hücre Hatlarının akıbet. A) farelerde metastaz sağkalım oranları gösteren Kaplan-Meier eğrisi 2,000-10,000 4T1, D2A1 veya D2.OR fare meme tümör hücreleri enjekte. Fareler tümör hücreleri enjekte edilmiş ve tımar eksikliği, soluk gözler ve ağırlık değişiklikleri dahil olmak üzere, metastaz belirtileri için gözlendi. Metastaz otopsi zamanında karaciğer ve histolojik bölümler üzerinde H & E ile teyit edilmiştir. N = 2 4T1 2.000 hücreleri; 2 4T1 10,000 hücre. N = 2 D2A1 2.000 hücreleri; 3 D2A1 10,000 hücre. N = 3 D2.OR 2.000 hücreleri; 3 D2.OR 10,000 hücre. Temsilci H & E B görüntüleri) 4T1 lezyonlar 10,000 hücre, C) D2A1 lezyonların 21 gün enjeksiyon sonrası 10.000 tümör hücrelerinin 26 gün sonrası enjeksiyon de, ve D) D2.OR lezyonlar da10.000 hücre 59 gün sonrası enjeksiyon; Ölçek çubukları 75 mikron =. 2000 4T1 veya D2A1 tümör hücreleri enjekte edildiğinde Benzer lezyonlar görülür. Resim lezyonlar 2.000 D2.OR hücreleri ile tespit edilmiştir. diğer organlarda ya da cerrahi kesi yerinde metastaz hiçbir kanıt bu çalışmalar üzerinde herhangi bir fare belli oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Multiplex Immunofluorescence kullanarak Fare Karaciğer Tek Hücreler ve metastatik lezyonların saptanması. Kapı toplardamarı enjeksiyonu modeli kullanılarak 90 dakika enjeksiyon sonrası bir Balb / c fare karaciğerinde D2A1 tümör hücrelerinin A) Örnek çoklu immünofloresan. Boyama, çoklu bir takım kullanılarak yapılır. Soldan sağa DAPI göstermektedir; CD45 lökosit işaretlemek için; Heppar-1 marhepatositleri k; ve CK18 tümör hücrelerini, hepatositler ve safra kanalı epiteli işaretlemek için. CD45 ^{- -} yakın bir portal üçlü ilişkili D2A1 tümör hücreleri birleştirilmiş görüntü CK18 ⁺ Heppar-1 'deki bir varsayımsal kümesini göstermektedir. Ok = D2A1 tümör hücreleri, yıldız = safra kanalı epiteli; Ölçek çubuğu 25 mikron =. B) A tümör hücreleri ile aynı boyama panelini kullanarak temsili bir açık D2A1 metastatik lezyonu CK18 ⁺ bitişik hepatositler CK18 ⁺ Heppar-1 ⁺ iken; Ölçek çubuğu 25 mikron =. Görüntüler mikroskop yazılımı kullanılarak, x 0.8 20 ile bir mikroskop 40 x 1.3 ve 60 x 1.4 amaçları ve CCD kamera ele geçirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

BALB / C fare modeli, kapı toplardamarı enjeksiyonu karıştırıcı çoklu organ metastazının yokluğunda karaciğerde ve tam bağışıklık yetkin konukçuda meme kanseri lezyonlarının çalışmasına izin verir. Bizim protokol doğrudan karaciğer ^16,55,56 halinde tümör hücrelerinin enjeksiyonu için portal ven erişime izin daha önce yayınlanmış bir cerrahi prosedürlerin gelişmedir. Yaptığımız tek bir ilerleme anlamlı 10,000 tümör hücrelerini / enjeksiyon  için ≥ 1 x 10 ⁵ hücre / enjeksiyon aşağı ^16,55,56 enjekte tümör hücrelerinin sayısını azaltmaktır. Biz de karaciğere meme kanseri metastazı çalışma için modelini genişletmiştir. Bu protokol kullanılarak, bilinen metastaz potansiyeli olan iki meme kanseri hücre çizgileri, daha pasif meme tümörü hücre çizgisinde daha kısa gecikme ile karaciğer metastazları geliştirir. Ayrıca, erken zaman noktalarında, tümör hücreleri tek ce tek veya küçük gruplar olarak karaciğer parankimi boyunca dağıtılanTümör hücresi enjeksiyonundan sonra LLS. karaciğerde-mikro metastatik ve açık metastatik hastalık gelişimine katkıda bulunan tüm fenotipleri - Model tümör hücre ekstravazasyonu, hücrenin hayatta kalması dinlenmesi ve çoğalması da dahil olmak üzere metastatik verimlilik soruları için hazırlanıyor.

Çalışmaların başlatılması öncesinde portal ven enjeksiyon protokolünün sayısız yönlerini dikkate almak önemlidir. Dikkatle hücre hatları, hücre konsantrasyonu, toplam hücre sayısı ve daha küçük keşif çalışmalara dayalı ilgi son noktaları karar şiddetle tavsiye edilir. Ayrıca, bağışıklık yetkili ana ve genetik olarak özdeş hücre hatlarının kullanımı konak-tümör hücre etkileşimleri anlamak için büyük önem taşımaktadır. Ön hipofiz bezinden yeni geliştirilen "parlayan kafa" EGFP ifade fare ve lusiferaz eksojen eGFP ve lusiferaz ev sahipliği yanıtları ortadan kaldırmak için önemli bir araçtır, proteinler genellikle meme tümör hatları ⁷⁵ etiketlemek için kullanılır . "Parlayan kafa" fare ve genetik olarak özdeş kullanımı tümör hücreleri eGFP veya lusiferaz inflamatuar yanıtların endişesi olmadan İHK tarafından tek yaygın hücrelerin kolay tanımlama ve mikrometastatik odaklar kolaylaştıracaktır etiketlenmiş. Benzer şekilde, en az anti- veya ilaç tedavi rejimi yanlısı tümör etki sağlamak için dikkatle ağrı yönetimi stratejileri seçme şiddetle tavsiye edilir. Bu herhangi bir sonuç bulandırabilir olarak bu protokol kritik adımlar, oluşmaz enfeksiyon sağlamak için ameliyatları boyunca steril koşullar yakalamak yer alıyor. Iğnenin doğru tümör hücrelerinin karaciğer teslim edilmesini sağlamak portal vene yerleştirilmiş olması da önemlidir. Böyle Hindistan mürekkep gibi boyalar ile protokol Pratiği bu konuda yardımcı olacaktır. cilt insizyonu yerinde tümör büyümesi uygunsuz iğne yerleştirme oluştuğunu en iyi göstergesidir. Son olarak, portal ven kan kaybı yeterince kontrol edilmesi önemlidir ve suturi tamamen önce sona ererhayvan ng. hemostatik gazlı bez kullanımı büyük ölçüde enjeksiyonu takiben portal venden kontrolsüz kan kaybı riskini azaltır. Bizim ellerde nedeniyle portal ven aşağıdaki enjeksiyon kan kaybına usul ilgili mortalite hemostatik gazlı bez kullanımı ile farelerin% 2% 30 düşürülmüştür.

Portal ven enjeksiyon modeli tam metastatik kaskad çoğaltma değil dikkat etmek önemlidir, ancak ekstravazasyon ve tümör büyümesinin aşağıdaki tümör hücresi ekstravazasyon, tümör hücre niş etkileşimleri çalışmaya sınırlıdır. hastalarda ortaya gibi doğru karaciğere tam metastatik kaskad çoğaltmak Modelleri, acilen ihtiyaç vardır. Portal ven enjeksiyon modeline üzerinde ek bir sınırlama hastalığın ilerlemesini ^76,77 etki bilinen yara iyileşmesi, ana bilgisayar üzerinde cerrahi etkisi ile karıştırılmakta olmasıdır.

kapı toplardamarı enjeksiyonu modeli diğer enjeksiyon bir gelişmeyi temsil ederModeller intrakardiyak ve intrasplenik modelleri dahil olmak üzere karaciğer metastazı, çalışmak için. Özel olarak, kapı toplardamarı enjeksiyonu modeli genellikle diğer dokularda birlikte metastazı ile sınırlıdır intrakardiyak modeli, daha hastalığın ilerlemesinin daha büyük bir aralık çalışma sağlar. intrasplenik modelde yapıldığı gibi Ayrıca, portal ven modeli, dalak uzaklaştırılarak karmaşık değildir.

portal ven enjeksiyon modeli genel olarak karaciğer metastazı çalışma için yararlı bir araç ispat edebilir. Karaciğer metastazı> özellikle yüksek pankreas kanserlerinde oranları (metastaz% 85'i karaciğerde vardır), kolon ve rektum adenokarsinomların (>% 70) yanı sıra mide ve yemek borusu ile (genel 30 adenokarsinomlarında metastaz en sık sitedir %) ^1. Pankreas ve kolon adenokarsinomların kendiliğinden ve ortotopik primer tümör modelleri daha kolay karaciğer ^78,79 metastaz rağmen, portal ven enjeksiyon modeli prov olabilirTümör hücrelerinin kontrollü teslimat olarak bu kanserlerin metastatik süreci anlamak için yararlı e tümör hücre geldikten sonra belirli zamanlarda, biyokimyasal, moleküler ve histolojik değerlendirmeler izin verir. Özet olarak, kapı toplardamarı enjeksiyonu modeli meme kanseri uygun karaciğer metastazı modellerinde önemli bir gelişmeyi temsil eder, ve aynı zamanda, genel olarak, karaciğer metastazı alanına uygulanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
anti-CD45 antibody	BD Pharmingen	550539	Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chemical Depilatory			Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
anti-CK18 antibody	Abcam	ab53118	Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
anti-Green Fluorescent Protein antibody	Vector Laboratories	BA0702	Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines
L-Glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose
Heating Pad, x 2 - 3			Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers
Hemocytometer	Hausser Scientific	1483	For use in cell culture to count cells
Hemostatic Forceps			Stainless steel; multiple suppliers
anti-Heppar-1 antibody	Dako	M7158	Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci
Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge	BD	324702	For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Light Source			Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers
Neutral buffered formalin, 10%	Anatech Ltd.	135	Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology
Opal™ 4-color fIHC kit	PerkinElmer, Inc.	NEL794001KT	Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver
Operating Scissors			Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers
Penicillin/Streptomycin, 100x	Corning	30-002-Cl	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose
Phosphate-buffered Saline			Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sodium Hypochlorite			Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery
Trypan Blue	Life Technologies	T10282	For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x)	Gibco	25300-054	Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates