Tüm kan İnsan monosit türevli dendritik hücrelerin oluşumu

Özet

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Özet

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Giriş

Dendritik hücreler (DC), bağışıklık sisteminin en önemli özel antijen sunan hücrelerdir. Olgunlaşmamış DC'ler (iDH'ler) deride veya mukozal dokularda bulunan ve işgalci patojenlere ile etkileşim ilk bağışıklık hücreleri arasında bu nedenle. Bu patojen tespiti, aşağıdaki T- ve B-hücresi tepkilerini aktifleştirme çünkü DH'ler, doğal ve adaptif bağışıklık sisteminin ¹ arasında bir köprü oluşturmaktadır. Bundan başka, çünkü bu tür IL-1, IL-6 ve IL-12 gibi sitokinler yüksek miktarda salgılanması pro-enflamatuar bağışıklık tepkilerinin katkıda bulunur. DH'ler NK hücrelerini aktive ederek ve kemotaksi neden olduğu enfeksiyona sitesine başka bağışıklık hücrelerinin çeker.

DH'ler olgun olmayan dendritik hücreler (iDH'ler) ve bunların yapısının ve fonksiyonunun göre olgun dendritik hücreler (MDC) ² ayrılabilir. Birçok örüntü tanıma reseptörlerinin biri (örn, paralı-benzeri reseptörler, C tipi yabancı antijenlerin alımdan sonralektinleri veya bol hücre yüzeyi üzerinde ifade edilen) reseptörleri güzelleştirmek, iDH'ler büyük değişiklikler geçmesi ve olgun başlar. Antijen sunumu için gerekli moleküllerin ³ yukarı regüle edilir ise, bu olgunlaştırma işlemi sırasında, antijen tutma reseptörleri, aşağı regüle edilir. Olgun DH'ler ana histokompatibilite kompleksi I ve II (MHC I ve II) yukarı doğru regüle, T lenfositlerin antijen sunumu ve aktivasyonu için gerekli olan CD80 ve CD86 gibi eş-uyarıcı moleküller. Buna ek olarak, hücre yüzeyi üzerinde kemokin reseptör CCR7 ekspresyonu lenf düğümlerine periferik dokularda DC'lerin geçişini sağlayan, indüklenir. Taşıma lenf düğümlerine ^4-6 bir kemokin ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) ve kemokin ligandı 21 (CCL21 / SLC) degrade boyunca DClerin "döner" ile kolaylaştırılır.

Göç eden, MDC ve böylece ini, CD4 ⁺ ve CD8 ⁺ T hücreleri naiv işlenmiş antijeniistilacı patojen ⁷ karşı edinilmiş bağışıklık tepki tiating. Lenf düğümlerindeki T hücreleri ile bu etkileşimi de virüsü ⁸ yayılması ile ilişkilidir. Diğer in vitro çalışmalar DC'ler verimli yakalamak ve güçlü bir enfeksiyon ^9-12 Bu iletim sonuçlarına T hücrelerine ve HIV aktarmak olduğunu ortaya koydu. Bu deneyler lenf düğümlerine çevreden servisleri olarak in vivo HIV patlatır DC'ler vurgulayın. Antijen sunumu sırasında DH'ler efektör T yardımcı hücrelerinin farklılaşmasını şekil ve bu nedenle, mikrop karşı tüm bağışıklık tepkisinin sonucu bu çok etkileşim belirlenir önemli interlökinler salgılar. Yanı sıra tip 1 (Th1) ve tip 2 (Th2) efektör T hücreleri, CD4 ⁺ T yardımcı hücreleri (örneğin, tip 17 (Th17) ve tip 22 (Th22) T hücreleri) tarif edilmiştir ve diğer alt-gruplar ve bunların gidiş ve fonksiyon iyice incelenmiştir. DH'ler, ayrıca katılandüzenleyici T hücreleri (Tregs) ^13,14 nesil. Bu hücreler bağışıklık ve durdurmak ya da indüksiyon veya efektör T hücrelerinin çoğalmasını aşağı düzenleyen ve böylece bağışıklık ve hoşgörüyü geliştirmek için çok önemli olabilir.

İnsan konvansiyonel DC'ler (CDCS) bir miyeloid kökenli hücrelerin çeşitli alt kümelerini oluşturan (yani, Langerhans Hücreleri (LCs) ve dermal ve interstisyel DC'ler) veya lenf kökenli (yani, plazmasitoid DC'ler (PDC)). In vitro deneylerde veya DC aşılama stratejileri, monosit kökenli DH'ler rutin dermal DC'ler için bir model olarak kullanılmaktadır. Bu hücreler, geleneksel miyeloid dendritik hücrelerin fizyoloji, morfoloji ve fonksiyon benzerlikler göstermektedir. Bunlar, sağlıklı vericilerden ^12,15-18 izole monositlere interlökin 4 (IL-4) ve granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) eklenerek oluşturulur. Dendritik hücreler, doğrudan dermal ya da mukozal biopsiden izole edilmiş ya da olabilir b edilebilire CD34 ⁺ eski utero elde göbek kordonu kan örneklerinden izole edilen hematopoetik progenitör hücrelerden geliştirdi. Burada, monositler izole edilmiş ve yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla periferal kan tek-çekirdekli hücresi (PBMC), zenginleştirme sonra anti-pıhtılaşmış insan kanından uyarılır gösterilmektedir. 5 gün için inkübe edildikten sonra, özel koşullar altında insan monositleri iDH'ler ayrılırlar olmayan bir klinik deney prosedürleri için hazırdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Etik deyimi: bilgilendirilmiş onam Yazılı Kan Transfüzyon & İmmünolojik Bölümü, Innsbruck, Avusturya Merkez Enstitüsü tarafından tüm katılımcı kan vericilerden elde edildi. bilimsel amaçlarla anonim artık örneklerinin kullanılması Innsbruck Tıp Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı.

Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 1. zenginleştirilmesi (PBMC)

1. Santrifüj ile PBMC'lerin konsantre.
   1. Alınan kan miktarına göre steril 50 ml santrifüj tüplerine kan paketi ve split kan açın.
   2. Gerekirse, steril Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) ile her bir tüp için 50 ml göre ayarlayın.
   3. Bir santrifüj tüpleri yerleştirilir ve fren oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca 400 x g'de bunları dönerler.
   4. boundar bırakarak, steril 10 ml serolojik pipet kullanarak plazma ve trombosit içeren üst katman kapalı Beraberliky tabakası rahatsız.
      Not: FCS yerine otolog plazma kültür ortamının ek kullanılırsa, plazma toplandı gerekir ve bu adımda ısı ile inaktive edilmiş.
   5. iki adet 50 ml'lik santrifüj tüplerine alınan mononükleer hücreler (sınır tabakaları) toplamak ve bir steril 10 ml serolojik pipet kullanılarak bir steril 50 ml tüp içine transfer edin.
   6. Steril D-PBS kullanarak her bir tüp için 50 ml ses seviyesini ayarlayın.
   7. Bir santrifüj tüpleri yerleştirin ve frensiz oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 400 x g'de onları dönerler.
   8. bozulmamış sınır tabakası bırakarak, steril 10 ml serolojik pipet kullanarak plazma ve trombosit içeren üst katman kapalı çizin.
   9. 50 ml santrifüj tüplerine alınan mononükleer hücreler (sınır tabakaları) toplamak ve bir steril 10 ml serolojik bir pipet kullanarak, iki steril 50 mi toplama tüpleri içine aktarın.
   10. Steril D-PBS ile her tüp için 50 ml ses seviyesini ayarlayın.
2. ayrılıkyoğunluk gradyan santrifüjü ile PBMC'lerin (Şekil 1).
   1. Her tüpe yoğunluk gradyan ortamı dört adet 50 ml tüpler ve pipet 15 mi hazırlayın.
   2. toplama tüpüne (adım 1.1.10) toplanan hücre / kan 25 ml alın ve dikkatle yoğunluk gradyan orta kaplaması.
   3. Bir santrifüj tüpleri yerleştirilir ve fren RT'de 30 dakika boyunca 700 x g'de bunları dönerler.
3. Toplama ve PBMC saflaştırılması.
   1. steril 10 ml serolojik pipet kullanarak plazma ve trombosit, rahatsız PBMC tabakası bırakarak içeren üst katman kapalı çizin.
   2. Tüm tüplerden PBMC interfaz toplamak ve steril bir 25 ml serolojik pipet kullanarak, iki steril 50 ml tüpler hücreleri havuz.
   3. Steril D-PBS ile her tüp için 50 ml ses seviyesini ayarlayın. Bir santrifüj tüpleri yerleştirilir ve fren ile, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 400 x g'de bunları dönerler.
   4. Süpernatantı aspire ve yeniden askıyaSteril, D-PBS içinde hücreleri. Her iki tüpe hücreleri havuz ve steril D-PBS ile 50 ml ses seviyesini ayarlamak.
   5. santrifüj tüpleri yerleştirilir ve fren ile, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de bunları dönerler.
   6. Süpernatantı aspire ve steril D-PBS hücrelerin yeniden askıya. D-PBS 450 ul ihtiva eden 1.5 ml bir tüp steril D-PBS ile 50 ml ve pipet 50 ul hacim ayarlayın.
   7. Vortex 1.5 ml tüp şiddetle ve Neubauer odasına veya diğer herhangi bir hücre sayım enstrüman hücreleri saymak.
   8. santrifüje 50 ml tüpler yerleştirin ve fren ile, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de bunları dönerler.

Anti-insan CD14 Manyetik Parçacıklar tarafından Monositler 2. izolasyonu

1. Manyetik parçacıklar ile PBMC'lerin etiketleme.
   1. Yalıtım tamponu kullanılarak 8 x 10 ⁷ hücre / ml PBMC konsantrasyonu ayarlayın.
   2. Vorteks anti-insan CD14 manyetik parçacıklar thoroughly ve her 1 x 10 ⁷ PBMC'ler için parçacıkların 50 ul ekle.
   3. İyice hücre partikül süspansiyonu karıştırın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe.
2. Pozitif ve negatif fraksiyonların ayrılması.
   1. izolasyon tamponu kullanılarak 12 ml hacim kadar ayarlayın.
   2. Her tüpe, hücre parçacık süspansiyonu altı steril yuvarlak tabanlı tüp ve pipet 2 ml hazırlayın.
   3. Hemen mıknatıs tüpler yerleştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
   4. mıknatıs üzerinde tüpler tutun ve dikkatle süpernatant çizin. Süpernatan negatif kısmını içerir.
   5. mıknatıstan tüpü çıkarın ve izolasyon tampon 2 ml ekleyin.
   6. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri yeniden askıya.
   7. geri mıknatıs üzerinde tüpler yerleştirin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
   8. mıknatıs üzerinde tüpler tutun ve dikkatle süpernatant çizin. Süpernatan negatif kısmını içerir.
   9. Mıknatıs tüpleri çıkarın ve her bir tüpe yalıtım tamponu 2 ilave edin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme hücreleri yeniden askıya.
   10. steril bir 50 ml tüp pozitif kısmını aktarın ve steril D-PBS kullanarak 50 ml ses seviyesini ayarlamak.

IL-4 ve GM-CSF ile izole edilmiş monositlerin 3. uyarılması

1. santrifüj tüpü yerleştirin ve fren ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 xg'de döndürün.
2. Aspire süpernatan ve D-PBS, 50 ml hücrelerin yeniden askıya.
3. D-PBS 450 ul içeren bir 1.5 ml tüp içine Pipet 50 ul. Vortex 1.5 ml tüp şiddetle ve Neubauer odasına ya da başka bir hücre sayım enstrüman hücreleri saymak.
4. santrifüj içine 50 ml tüp yerleştirin ve fren ile 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 xg'de döndürün.
   NOT: periferik kan lenfositleri (PBL) içeren negatif fraksiyon, ayrıca gerekiyorsa, yıkama gerçekleştirmek ve sayma t benzer adımlarPozitif fraksiyonun hortum (3.1-3.5 adımlar).
5. Önceden ısıtılmış bir kültür ortamı (RPMI 1640,% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS ve% 1 L-Glutamin çözeltisi ile desteklenen ortamda) ve pipet 3 ml / 6-çukurlu plakalara 1 x 10 ⁶ / ml hücre yoğunluğu ayarlayın.
   NOT: ısı ile inaktive otolog plazma kullanıyorsanız, deneysel set-up göre,% 1-5 otolog plazma ile% 10 FCS değiştirin.
6. Kültür ortamı içine doğrudan sitokin pipetleme rekombinant insan IL-4 (250 U / ml) ve rekombinant insan GM-CSF (1000 U / ml) ile monositlerini uyarma. 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 _CO2.
7. Kültür ortamı içine doğrudan sitokin pipetleme 48 saat sonra IL-4 (250 U / ml) ve GM-CSF (1000 U / ml) ile hücrelerin yeniden teşvik eder.
   NOT: orta pH göstergesi ile gösterilen asitlenme herhangi bir işaret varsa, önceden ısıtılmış kültür ortamı ile orta yarısı değiştirin.
8. Hasat için, 5. günde dendritik hücreler olgunlaşmamışaşağı akım 6 oyuklu plaka üzerinden bir 50 ml santrifüj tüpüne kadar kültür ortamı pipetle sonra bir kaç kez aşağı kültürlenmiş hücreler pipetleme deneyler.
9. hücrelerin sayısı ve CD11b, CD11c karşı anti-insan antikorları izole monositler bir örnek leke ve birlikte bir hücre canlılığı boya ile DC-SIGN / CD209. Yüzey boyama sırasında antikorların özgül olmayan bağlanma önlemek için, reaktif ya da sığır serum albümini (BSA) tampon Fc reseptör bloke edici kullanılması önerilir.
10. Oluşturulan iDH'lerin saflığını ve canlılığını değerlendirmek için akış sitometri gerçekleştirerek, üreticinin protokolüne göre, hücre canlılığı boya kullanılarak örnek analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir sükroz yastık kullanılarak anti-pıhtılaşmış kanın santrifüje edilmesinden sonra, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), yoğunluk gradyan ortamı (Şekil 1) üstüne bir arayüz içinde zenginleştirilmiştir. PBMC'ler çekilir sonra FACS analizi soyu belirteçler kullanılarak PBMC (örneğin, CD3 T lenfositlerin, CD14 monositler için ve CD19 B lenfositleri için) olan farklı hücre popülasyonları için gerçekleştirilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, manyetik nanopartikül bazlı analiz kullanılarak anti-pıhtılaşmış kandan alınan insan monosit yalıtımla monosit türevli dendritik hücreler (MDDCs) üretimini tarif eder. Bu protokol, santrifüj adımları PBMC fraksiyonu bir zenginleşmeye yol açan hücre izolasyon prosedürü, üst baş tarafında ifa edilir. Hücreler santrifüj sırasında kaybolur, ancak, yoğunluk gradyanlı ortamının 200-300 ml gerektirecektir yoğunluk gradyan ortamında bütün bir kan paket içeriğini kaplamak için...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19	BD Biosciences	555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA (Albumin Fraction V)	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Costar	3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet	Corning	357551
Falcon 25 ml Serological Pipet	Corning	357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes	Corning	352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)	Tonbo biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)	BD Biosciences	552362
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin	VWR	211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2	BD Biosciences	555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020