Kalp Fonksiyon Çalışmaları Diseksiyon ve Bal Arısı Dorsal Vessel Gözlem

Özet

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Özet

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Giriş

Bu metodoloji genel amacı araştırmacı hızlı ve kolay gözlemlemek ve farmakolojik ajan bal arılarının kalp atım hızı üzerindeki etkisini ölçmek için izin vermektir. Arılar, diğer böcekler gibi, hemocoel olarak bilinen vücut boşluğuna boyunca, hemolimf, kan böcek eşdeğer yaymaktadır açık dolaşım sistemi var. Hemolimf dolaşımı besin bağışıklık faktör, atık ürünleri, hem de nörohormonlar ve diğer sinyal molekülleri ¹ taşınması için gereklidir. Ödünç böcek dorsal orta hat, hem de bir aksesuar pulsatil organları boyunca uzanır dorsal kabında ile kolaylaştırılır. dorsal damar, iki fonksiyonel bölüme ayrılırdı karın kalp ve göğüs ve baş aorta belirlenir. Göğüs ve kafa doğru kalp pompası hemolimf yayılır kasılmalar, aksesuar pulsatil organları ekstremitelerde hemolimf akışını sağlamak ise.

Böcek kardiyak fonksiyon böceğin boyutu, fizyoloji, ya da yaşam aşamasına bağlı olarak, çeşitli yöntemler kullanılarak görülebilir. Larva veya daha küçük böcekler kalp hızı gözlemlemek için ortak bir yaklaşım intravital görüntüleme ² kullanımıdır. Bu açık bir şekilde karın duvarından sırt damarı görüntülemek için zor olabilir Bu yöntem, bununla birlikte, yetişkin arı daha az kullanışlıdır. Böcekler dahil olmak üzere, arıların çeşitli kalp hızını kaydetmek için bir yöntem haline, kardiyak darbelerini ^3,4 algılamak için böceğin dış kısmına uygulanmıştır termistör kullanan iletişim termografi, kullanılmasıdır. Yetişkin arıların kalp hızı da bir elektrik empedans sinyali ^4,5 ölçmek için bir elektrofizyolojik tekniği kullanılarak kaydedilmiştir. Bu teknik, kalp yanında hayvana elektrotların yerleştirilmesi ve kalp atışları ⁴ kaydetmek için bir empedans dönüştürücü kullanılmasını gerektirir. Benzer şekilde, elektrokardiyogram DETEC için kullanılmaktadırkalp tarafından üretilen ve kardiyak aktivitenin ⁶ değişiklikleri gözlemek için arının video kaydı ile birlikte elektrik sinyallerini t. Bu yaklaşımların belirgin bir avantajı kalp hızı oldukça konuda fizyolojik yanıtlar dizi kullanılabilirliğini sağlamak için yardımcı olan bir disseke numune, daha, dokunulmamış, canlı bir arı değerlendirilir olmasıdır. Bu yaklaşımların zorlukları konu, kalp hızını değiştirmek, hem de farmakolojik ajanların test ederken uygun bir dağıtım yöntemi belirleme olabilir dış değişkenler ve uyaranlara sınırlamak için ihtiyaç immobilizasyon veya anesthetization için muhasebe sayılabilir.

Arı kardiyak aktivite eğitimi için kullanılan bir başka yaklaşım kısmen bir kuvvet yer değiştirme dönüştürücü ^7'yi kullanarak dorsal damar kasılmaları daha sonra, kalp maruz ölçmek için böcek incelemek etmektir. Bu protokol, kalp sürekli çalışan serum fizyolojik ve test işbirliği ile yıkanıyormpounds konu ⁷ uygulaması için bu çözelti içinde çözündürülebilir. Bu yöntem ve bu, daha önce tarif edildiği arasındaki önemli bir fark, ventral sinir kablosu, merkezi sinir sistemi, kalp hızı ⁵ modüle oynadığı gösterilmiştir ki rol ortadan kaldırılmış olmasıdır. Sonuç, genellikle oldukça düzensiz bazal kalp atışı, çok daha düşük frekansta stabilize ve genlik daha tipik bir canlı böcek ^5,7 gözlenen olmasıdır. Ne bu yöntemlerin hepsi ortak noktası ise yapılacak üzere, uzmanlık belirli bir seviyeye ek olarak, son derece özel ve genellikle pahalı ekipman gerektirir olmasıdır. Belki de en büyük dezavantajı, bu yaklaşımların hiçbiri, özellikle bu potansiyel cardiomodulatory bileşiklerin bir kütüphanenin taranması gibi konularda çok sayıda test ihtiva eden deneyler için uygun olmasıdır.

Burada anlatılan yaklaşımın en büyük gücüsadeliği. protokol ayarı az yer kaplar, usta nispeten kolaydır, ve sadece minimal mali giriş gereklidir. yöntem bazı arılar, birkaç cerrahi aletler, izotonik solüsyon biraz daha gerektirir ve bir dijital mikroskop veya dijital kamera ile geleneksel mikroskop ya. Arılar dorsal gemi görselleştirmek için disseke ve dijital video öncesi ve farmakolojik ajanlar ile tedavi sonrası kalp hızını kaydetmek için kullanılır. Video kayıt kalp hızı değişiklikleri gözlemlemek için aslında gerekli değildir, ancak, büyük ölçüde verim artar (yani, belirli bir zaman miktarı işlenebilir konuların sayısı). Araştırmacı seferde videoların çok sayıda kayıt ve daha sonra bir daha uygun bir zamanda bu videoları puanlama verimliliği en üst düzeye çıkarabilirsiniz. Bu yaklaşımın bir diğer avantajı videoları araştırmacı puanlama süreci kesintiye gerektiğini, baştan başlamak ve v için daha kolay hale getirmek için izin olduğunuiewer önyargı azaltmak için tedaviye kör edilmesi.

Protokol

1. Toplama ve Test Konularının hazırlanması

1. koloni arı uygun sayıda toplayın.
   NOT: Gerekli sayı boyutu ve deney kapsamında, aynı zamanda araştırmacının beceri sadece bağlıdır. 2 tedavi grubu, grup başına 10 arı istenen örneklem büyüklüğü ile varsa Örneğin, bir makul yetenekli araştırmacı başarısız diseksiyonlardan hesap ve skoru 20 Yararlı videolar ile sonuna kadar en az 30 arı toplamak olabilir.
2. toplanması ve diseksiyon arasında geçen süreyi en aza indirin.
   NOT: Arılar gün önce diseksiyon için laboratuvarda muhafaza edilebilmesine rağmen, diseksiyonları başarı oranı (bir disseke dorsal geminin istikrarlı bir kalp hızını sürdürmek olasılığı yani) zaman miktarına göre azaldığı gözlenmiştir edildiğini arılar uzakta koloniden yerleştirilmiştir.
   1. Laboratuvarda muhafaza ederken su ve yiyecek kaynağı ile arıları sağlamak. EXA içinmple, en azından (bu en az 6 saat süreleri için yeterli olan) su içinde sükroz çözeltisi (ağ / hac)% 50 erişimi sağlar. uzun süreler için, arılar bal erişim sağlar.
   2. Yaklaşık 32 ° C ve% 60-80 bağıl nem sıcaklıkta laboratuar gecede Ev arılar stresi azaltmak ve dehidratasyonu önlemek için.
3. Diseksiyon önce, taşıma yardımcı olmak için kısaca arıları uyutmak.
   NOT: Bu diseksiyonları başarı oranını azaltmak ve verimi azaltabilir.
   1. buz üzerinde yerleştirerek ya da sadece yeterince uzun işlemede yardımcı olmak amacıyla hareketi azaltmak için bir buzdolabına ya arıları Chill.
   2. Alternatif olarak, kısaca ele alınmasında yardımcı olmak amacıyla CO ₂ arılar maruz bırakmaktadır.
      NOT: soğuğa maruz kalma Genişletilmiş diseksiyonları başarı oranını azaltabilir. Genişletilmiş veya ayrıca diseksiyonları başarı oranını azaltabilir CO ₂ maruz kalma tekrarladı.

2. DiseksiyonDorsal Karın Duvarı

NOT: Arılar diseksiyon anda hayatta olması gerekir.

1. forseps ve / veya mikrodiseksiyon makas, kaldırmak bacaklarını ve kanatlarını kullanarak karın diseksiyonu kolaylaştırmak için. Küçük bir beher veya disseksiyonlar arasındaki aletleri durulama amacıyla yakın damıtılmış su ile dolu benzer tutunuz.
2. Forseps ile arı frenleyici olsa da, birinci ve ikinci tergites arasındaki dorsal karın duvarı boyunca yanal kesmek için mikrodiseksiyon makas kullanmak (Şekil 1).

Şekil 1: Arı karın Dorsal görünümü. kırmızı çizgi ile gösterildiği gibi sadece ilk kesi, birinci ve ikinci tergites arasında yapılmalıdır. Ölçek çubuğu = 1 mm. Onu tıklayınızE bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

3. Hafifçe forseps ile ikinci tergite posterior kenarını sıkarken, stinger başlangıç kesi arı her tarafı boyunca uzunlamasına kesilmiş (bakınız Şekil 2). gastrointestinal sistem delinmesiyle önlemek için kesim dikkatli olun.

Şekil 2: Arı karın Yanal görünümü. kırmızı çizgi ile gösterilen şekilde, ikinci ve üçüncü kesikler, karın her iki tarafı boyunca yapılmalıdır. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4. ince forseps ikinci bir set için makas değişimi ve dikkatle geri kalanı o gelen dorsal karın duvarı ayırmak için onları kullanmakKarın f. Yavaşça stinger ve dorsal karın duvarında asılı kalır gastrointestinal sistemin herhangi bir kısmını çıkarmak. içindekiler dorsal geminin görselleştirme engel kat karın duvarı ve olduğu gibi, gut kırılması kaçının.

Şekil 3: dorsal geminin görünümü. Bağırsak ve ısırgan otu çıkarıldıktan sonra, dorsal damar disseke dorsal karın duvarı orta hat boyunca görülebilir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

5. Dorsal damar görülebilecek şekilde kamera altında istenen yönde dorsal karın duvarı düzenleyin (bakınız Şekil 3). herhangi bir aşırı ab uzak trim için mikrodiseksiyon makas yararlanındorsal geminin görselleştirme engellemektedir dominal duvar. Düzgün yer alan zaman dorsal karın duvarının şekli sığ fincan veya kase benzer olmalıdır.
   1. dorsal damar arının sondaki karın segment içine uzatmak olmadığından, sırt geminin görselleştirme geliştirmek amacıyla son tergite kaldırın.
6. ayarlanabilir bir birim mikropipet kullanarak, fizyolojik koşulları sürdürmek ve sürekli bir yayın sinyali sağlamak için bir izotonik çözelti 10 ul ile sırt damarı kapsamaktadır.
   Not: önerilen çözüm çeyrek gücü Ringer çözeltisi (0.120 g / l kalsiyum klorür, 0.105 g / L potasyum klorür, 0.050 g / L sodyum bikarbonat ve 2.250 g / L sodyum klorid) sabit bir şekilde kolaylaştırılması için bulunmuştur edilmiştir, sürekli kalp atışı.

3. Gözlem ve Kalp Hızı modülasyonu

1. istikrarlı, sürekli kalp atışı elde edilene kadar dorsal damar rahatsız oturmak için izin(Genellikle 300 saniye içinde).
   NOT: Kalp atışı dorsal geminin ritmik kasılmalar olarak görüntülenmiştir. Başlangıçta, arı anestezi edildi, özellikle hiçbir kalp atışı orada görünebilir, ancak kalp genellikle birkaç dakika için izotonik çözelti içinde dinlendikten sonra dayak devam edecektir ve saatlerce dayak devam edebilir, bu çözelti içinde kalmış kalır sağladı.
2. dakika (BPM) başına atım sayısı bakımından kalp hızını ölçün.
   1. 60 saniye süresince gözlenen kasılma numarasını kaydedin. Bu süreci kolaylaştırmak için bir el taksitli sayacı ve bir zamanlayıcı kullanın.
3. önce ve cardiomodulatory bileşik ile tedavi sonrasında gözlenen BPM'i kaydederek kalp hızındaki değişimi ölçer.
   Not: zaman test edilen bileşiğe bağlı olarak değişebilir, kalp hızı üzerinde bir etkiye gözlemek için gerekli olsa da, kalp hızı değişiklikleri genellikle birkaç dakika içinde görülür.
   1. hemen önce bazal kalp hızını belirleyinHerhangi bir test bileşiğinin eklenmesi.
      NOT: Tedavi sonrası kalp hızı genellikle 90 ila 120 saniye sonra tespit edilebilir.
   2. Dorsal damar yıkanmak için kullanılan aynı izotonik çözelti içinde eritilmesi suretiyle potansiyel cardiomodulators (ör octopamine) hazırlayın.
   3. Bir Mikropipet kullanarak dorsal kabı çevreleyen çözüm test bileşiklerinin ekleyin.
4. daha doğru ve daha yüksek verim için, her bir test konusunun bir video kaydı yapmak ve daha sonra daha sonra kalp atış hızını puan videoları kullanın.
   NOT: Bu videoların neredeyse sürekli üretimi kolaylaştırmak amacıyla diseksiyonu sendeleyip tek araştırmacı sağlar. Video kaydederken, önerilen minimum uzunluk herhangi bir test bileşiği ile yaklaşık 240 saniye 60 saniye işareti eklenir ediliyor. Bu araştırmacı bazal kalp hızı ve daha sonra tedavi sonrası kalp hızı 120 saniye puanlama için başka 60 sn penceresi puanlama için 60 sn penceresi sahip olmasını sağlartedavi sonrası.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak test edilebilir, farmakolojik olarak aktif bileşiklerin bir çoğu, suda çözünür olmadığı için, test bileşikleri dorsal damar yıkanmak için kullanılan izotonik çözeltisi ile iletilecektir sağlayacak güvenilir bir çözücü olması gerekmektedir. Dimetil sülfoksit (DMSO), yaygın olarak hayvan ⁸ deneysel ilaçları ve diğer bileşiklerin sağlanması için bir araç olarak kullanılan bir çözücü olduğunu ve bal arısı kalp akt...

Tartışmalar

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments