yetiştirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Laboratuvarı Üç boyutlu

Özet

Biz NGT-3D ve NGB-3D olarak adlandırılan 3D nematod yetiştirme sistemlerini inşa etmek basit bir yöntem mevcut. Bu standart 2D laboratuvar C. elegans kültür plakaları daha doğal Caenorhabditis elegans habitatlar daha benzer habitatlarda nematod fitness ve davranışları incelemek için kullanılabilir.

Özet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Giriş

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

Protokol

1. NGT-3D ve NGB-3D Çözümler hazırlayın

1. Aşağıdaki steril çözeltiler hazırlayın: 0,1454 M NaCl çözeltisi 1 L'lik, 1 M _CaCl2, 1 M MgSO ₄ ile 1 L 1 L lizojeni Broth (LB), KH _2, 1 M KPO ₄ tampon (108.3 g, 1 L PO ₄ ve K ₂ 35.6 g HPO ₄ ve dolgu _H2O 1 l). Bu çözümleri kullanarak NGM üretimi bir önceki protokolde ¹⁰ bulunabilir.
2. 121 ° C, 15 dk Otoklav çözümler.
3. Steril 5 mg / ml, kolesterol çözeltisi 50 ml hazırlayın. 50 ml'lik konik bir tüp içinde, kolesterol 0.25 g ve% 99.99 50 ml etanol karışımı ve iyice karıştırın. Otoklavlamayın. 0.45 um'lik bir şırınga filtresi ile 50 ml'lik bir şırınga kullanarak, kolesterol solüsyonu sterilize edin. Bu aynı zamanda herhangi bir çözülmemiş kolesterolü ortadan kaldıracaktır.
4. 2'-deoksi-5-f (FUDR) stokunun 150 mM 10 ml hazırlayın (İsteğe bağlı). 15 ml konik tüp içinde, 0,3693 g mixFudR ve damıtılmış su, 10 ml. İyi çalkala.

2. NGT-3D ve NGB-3D Bakteriler Kültür hazırlayın

1. Bakteri 10 mi LB suyu inoküle. Besleme C. elegans için kullanılan standart bakteri E. coli OP50 olduğunu.
2. Kültür gece boyunca bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C sıcaklıkta bakteriyel aşılama.
3. Seri seyreltme için hazırlık olarak, steril 15 ml konik tüp içine NaCl solüsyonu tümböleni 9 mi. Örneğin, 7 tüpler toplam içine kısım 9 mi OP50 soyu, E. coli 10 ^-7 seyreltme yapmak.
4. NaCl çözeltisi 9 ml steril yeni bir tüp içine steril 1000 ul pipet, pipet bakteri kültürü 1 ml ya da seyreltilmiş bakteri kültürü kullanılarak ve de 10 mi karışımı girdap. İstenilen bakteriyel seyreltme ulaşana kadar tekrarlayın.
   Not: İstenilen bakteriyel seyreltme Çeşidi ve durum bakterilerin yanı sıra tam deney koşullarına bağlıdır.Örneğin, bir 10 ⁶ - 6.5 mi NGT-3D tüp başına 200 bakteri kolonilerinin - OP50 soyu, E. coli 10 ^-8 seyreltme 1 üretilmesi için yeterli idi. Solucanlar güvenilir geliştirilen ve kolonilerin sayısı 10 ^-6 dilusyondaki meydana geldiği, 60 üzerinde iken normalde yeniden - 10 ^-7. NGB-3D, 10 ^-8 bir seyreltme kullanın.

3. yapma NGT-3B ve NGB-3D (200 mi)

1. bakteri kültürü hazırlandıktan sonra, 0.6 g NaCl, 1 g granüle agar ve 500 ml'lik bir şişe içinde 0.5 g pepton karıştırın. şişeye, bir manyetik karıştırma çubuğu ile yerleştirin.
2. 195 ml damıtılmış su ekleyin ve alüminyum folyo ile balonun ağzını kapsamaktadır.
3. 15 dakika boyunca Otoklav 121 ° C.
4. bir heyecan plaka üzerine sıcak otoklava balon yerleştirin ve en az 2 saat süreyle orta hızda karıştırın. 40 ° C'ye kadar balon soğutun. Bitmiş agar Clouding yol açabilir burada yüksek sıcaklıklarda devam eden olarak yeterince soğumasını emin olun.Bununla birlikte, daha düşük sıcaklıklar agar zamanından önce sertleşmesini neden olabilir.
   1. (İsteğe bağlı), soğutma sürecini hızlandırmak bir heyecan plaka üzerinde yerleştirmeden önce 40 ° C su banyosunda 15 dakika içinde balon yerleştirin.
5. Agar ortamı sıcaklığı 40 ° C'ye ulaştığında çözelti, karıştırılmaya devam ederken, 200 ul 1 M _CaCl2, 5 mg / ml, kolesterol çözeltisi 200 ul, 200 ul 1 M MgSO ₄ ve 5 ml 1 M KPO ₄ tampon eklemek 1 mM _CaCl2, 5 ug / ml kolesterol, 1 mM MgSO _4, 1 mM KPO ₄ son konsantrasyonlara.
   1. NGT-3D ömrü deneyi için (İsteğe bağlı) 120 ^{uM, 12} bir son konsantrasyona kadar, 150 mM FudR 80 ul ekle.
6. doğrudan balona adım 2.4 bakteri kültürü seyreltilmiş 10 ml 6 ml ekleyin.
   1. , NGT-3D için (İsteğe bağlı) adım 3.6 önce agar medya 6 ml çıkarın ve ayrı sıcak tutmak. Bu ortam için kullanılacak bakterilerden arındırılmışÜst tabaka.
7. Steril prosedürler kullanılarak, steril bir kültür odasına ortamı dağıtmak. Emin odasının kapağı sıkıca kapatır emin olun.
   1. (İsteğe bağlı), agar üst yüzeyinde şekillendirme bakteri kolonileri önlemek 3.7 tamamen sertleşir adımdan medyada önce üst aşama 3.6.1 bakteri serbest ağar medya bir katman yapmak için. Bu NGT-3D üstündeki bir bakteri serbest bölge oluşturur.
   2. NGT-3D, bir bakteri ağar katman yapmak ve dikkatle ince bir bakteri yapmak için yarı sertleştirilmiş 3D medya üstünde bakteri özgür medya 200 ul dağıtmak için 8 ml şeffaf plastik test tüpleri içine 6,5 ml medya dökmek üstünde ücretsiz tabaka.
   3. NGB-3D, 25 cm ² şeffaf plastik hücre kültürü şişe içine medya 65 ml dökün. Bu miktar 25 cm ² hücre kültürü şişe gövdesini doldurmalıdır.
8. Bakteri kolonileri büyümesine imkan vermek üzere bir hafta süreyle dikey oda sıcaklığında odaları boşen az 1 mm çapında önemli bir boyuta.
   1. NGT-3D ömrü deneyi için (İsteğe bağlı), alüminyum folyo ile kapak odaları FUDR ışık bozulmasını önlemek için.

NGT-3D (Bağıl Brood Boyut Testi) üzerine Solucan Nüfus 4. Tedbir Spor

1. almak ve bir bakteri ücretsiz NGM plaka transfer platin tel kullanarak bir L4 sahne solucanı almak. Solucan serbestçe bünyesine bağlı bakteri kaldırmak için bir kaç dakika dolaşmak için izin verin.
2. adımı 4.1 tekrarlayın ve solucan bakterilerden arınmış olduğundan emin olun. Genellikle, 4.1 iki tekrarlar yeterlidir.
3. Dikkatlice bir platin tel çekme ile 3D medya yüzeyine temiz solucan yerleştirin. Solucan sonunda 3D agar matrisi içine agar girmelidir.
4. Kapak gevşek bazı hava tüpüne almak için izin ancak agar medya kurumasını önleyen kapatın.
5. 20 ° C'de 96 saat süreyle inkübe edilir.
6. 4 gün sonra, sıkıca kapaklarını kapatın ve koyun88 ° C su banyosu içine NGT-3D kültür odası agar eritmek için. Isı solucanlar öldürür ama vücutları sağlam kalır.
   Not: NGT-3D 8 ml tüpler kullanılarak, 20-30 dakika kuluçka genellikle yeterlidir.
7. Cam bir pipet kullanılarak, 9 cm plastik petri kabı üzerine erimiş ortamı aktarın. solucanlar genellikle onlara sopa gibi plastik pipetler, tavsiye edilmez.
8. Bir iletim stereo diseksiyon mikroskobu kullanılarak, L3, L4 solucanlar, ve yetişkin aşamaları sayısını. F1 ve F2 nesil burada karışabilir olarak, L2 sahne ve genç solucanlar saymayın. Böylece, bu testte göreceli kuluçka boyutu tahlil yerine toplam kuluçka büyüklüğü testtir.

5. Görüntü ve Kayıt Worm Davranışı NGB-3D

1. platin tel kullanarak bir L4 sahne solucanı almak almak ve bir bakteri ücretsiz NGM plaka transfer ve serbest bir kaç dakika hareket sağlayan yüzeye yapışmış herhangi bakterileri yok.
2. Adımı yineleyin 5.1 wo emin olmak içinrm bakterilerden arınmış.
3. Dikkatlice bir platin tel çekme ile şişenin boyun yakın NGB-3D agar yüzeyinin merkezi üzerine temiz solucan yerleştirin. Solucan sonunda 3D agar matrisi içine agar girmelidir.
4. Agar medya kurumasını önlerken kapak gevşek, bazı hava tüpüne almak için izin kapatın.
5. Görüntü veya iletim stereo mikroskop altında solucan kaydedin. solucan 3D matris boyunca hareket ederken odağı ayarlayın.

Sonuçlar

NGT-3D inşaat agar (Şekil 1A) boyunca aralıklı küçük bakteri kolonileri ile bir agar dolu test tüpünde sonuçlanan basit ve kolay bir protokoldür. Solucanlar serbestçe bakteri kolonileri bulma ve tüketen, ağar matriks boyunca taşıyabilirsiniz. C. elegans çoğaltmak ve NGT-3D normal büyüyebilir olmadığını teyit etmek, biz doğurganlık ve standart 2D NGM plakalar ile 3D larva gelişimi karşılaştırıldı. Göreceli yavru boyutu deneyde, y...

Tartışmalar

Klasik nematod büyüme ortamı plakaları kullanılarak C. elegans laboratuvar ekimi sağlamıştır C. elegans araştırma önemli keşiflerinden yüzlerce önemliydi. Burada, daha doğru kendi doğal üç boyutlu habitatları yansıtan bir ortamda C. elegans yetiştirmek için yeni yöntemler sunuyoruz. Diğer yöntemler 3D ¹³ C. elegans gözlemlemek için kullanılmışsa da, bu katı 3 boyutlu matris solucanlar ekimi sağlayan ilk protokoldür. Burada gösterilen iki y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000