JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, dişi C57BL / 6J fareler, tümör büyümesi izlenmesinde sıçangil ortotopik mesane tümörlerinin üretimini tarif eder.

Özet

Bu protokol, insan prostat spesifik antijen (PSA) salgılar üzere tadil edilmiş olan murin mesane kanseri hücre çizgisi MB49 kullanılarak dişi C57BL / 6J farelerde mesane tümörlerine üretimini tarif eder, ve tümör implantasyonundan teyidi için prosedür. Kısaca, fareler enjektabl ilaçlar kullanılarak anestezi uygulanır ve dorsal pozisyonda yatıyordu yapılır. İdrar mesaneden boşalan ve poli-L-lisin (PLL), 50 uL yavaş yavaş 24 g, IV, kateter kullanılarak 10 mL / 20 s bir hızda damlatılır. Bu kateter tapayla kapatılması ile 20 dakika için idrar torbasında bırakılır. Sonda çıkarılır ve PLL mesane hafif basınç boşalan edilir. Bu murin mesane kanseri hücre çizgisi 10 uL / 20 s bir hızda (1 x 10 5 hücre / 50 uL) bir damlatma izlemektedir. Kateter erken tahliye önlemek için kapatılmakta. 1 saat sonra, fareler bir ters ilaç ile yeniden canlandırılması ve mesane boşalması. Yavaş instilasyon oranı, önemli olanbu tümörler, üst idrar yollarında ve böbreklerde oluşmasına neden olabilir veziko-üreteral reflü, azaltır. hücre hattı da bu implantasyondan sonra düzensiz tümör boyutları yol gibi, hücre topaklanma azaltmak için yeniden askıya alınmalıdır.

Bu teknik, yüksek verimlilik ile tümörleri neden olmaktadır. Tümör büyümesi, üriner PSA salgılama ile izlenir. PSA markör izleme mesane tümör varlığının tespiti için ultrason veya floresan görüntüleme daha güvenilirdir. tedavi edilmediği takdirde 4 hafta - farelerde tümörler genellikle yaklaşık 3 ile maksimum boyutu olumsuz etkiler sağlık ulaşır. tümör büyümesini izleyerek, başarılı tümörlerinin implante değil olanlardan tedavi fareler ayırt etmek mümkündür. Sadece uç nokta analizi ile, ikincisi yanlışlıkla terapi ile tedavi edilmiş kabul edilebilir.

Giriş

Bu yöntemin amacı, fare ortotopik mesane tümörleri üretmek ve tümör implantasyonu olmadan fareler uç noktası analizinde tedavi sanılan değildir bu yüzden, mümkün olduğu kadar doğru implante tümörleri izlemektir. Genel olarak, yöntem deneysel analiz için farelerin çok sayıda ihtiyacını azaltmak ve tedavi sonuçlarını belirlemede büyük doğruluğunu sağlayacaktır gösterilen.

implante tümör hücreleri deri altına klinik hastalığın çevreyi özetlemek veya tedavi stratejilerinin geliştirilmesini sağlamak değil gibi kanser için ortotopik bir model geliştirilmesi önemlidir. Mesanenin mimarisi doğrudan minimal sistemik etkileri ile mesane içine mesane kanseri tedavilerinin damlatma izin verir. Bu durumda, bu ortotopik bir model olarak, bu ortam özetlemek hayvan modelleri, yeni tedavilerin değerlendirilmesi için önemlidir. herhangi bir deneysel set-up çıkarılan sonuçlar bağımlı hazırlık vardırModelin sınırlamalar üzerine t.

Çeşitli teknikler farelerde ortotopik mesane tümörlerinin üretimi için geliştirilmiştir. Bunlar, mesanenin glikozaminoglikan tabakası zarar implante edilecek tümör hücrelerinin sağlayan güveniyor. Kullanılan teknikler mesane 1,2 tek bir sitede tümör gelişimine yol açan, mesane duvarı hasar tek bir noktada sonuçlanır elektrokotere içerir. Bununla birlikte, elektrokoter kullanılarak tümör implantasyonu başarı oranı operatöre bağlıdır 10 arasında değişen bir -% 90, ve periton boşluğu içinde gelişen tümörlerin neden mesane duvarı delinmiş olan tehlikesini içerir. Kimyasal koter gümüş nitrat, zarar mesane duvarı 3 kullanılarak gerçekleştirilir. Benzer şekilde, asit, mesane duvarı 4 zarar kullanılmıştır. Tripsin da iyi 5 ile mesane zarar kullanılmıştır. Bu yöntemler, mesane birden fazla tümör oluşmasına da neden olabilir.kimyasallar çok uzun süre mesane duvarı ile temas halinde bırakılırsa Ayrıca, mesane ciddi hasar tehlikesi vardır. Ninalga ve arkadaşları tarafından geliştirilen bir yöntem. pozitif yüklü poli-L-lisin (PLL), kat mesane duvarı 6 molekülleri kullanır; Bu mesane glikozaminoglikan tabakası sadık negatif yüklü tümör hücreleri sağlar. Bu yöntem, genel olarak mesanede geliştirme birden fazla tümör ile sonuçlanır, ancak tümör implantasyonu 80 olan -% 100 4,7. Teknik olarak, bunu gerçekleştirmek için en kolay prosedür aynı zamanda. geliştirilmesi tümörler da boyutu oldukça emin olmak için, tümör hücreleri implantasyondan önce, büyük yığınlar halinde gruplanmaz önemlidir.

terapötik etkinliğini değerlendirmek amacıyla, oldukça benzer boyutlu tümörleri olan fareler bu çalışma yapmak için uygundur. Böylece, implantasyon hemen sonra tümör boyutu ölçmek için iyi bir algılama sistemi çok önemlidir. Çeşitli stratejiler arıN tümörleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu manyetik rezonans görüntüleme (MRI), 8-10, floresan 11 biyoluminesans 12,13, ultrason 14 ve enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), 15,16 bulunmaktadır. MR ve ultrason tümör hücrelerinin değişiklik gerektirmeyen birlikte, MRI hassas ekipman ve kontrast maddeleri için bir ihtiyaç vardır. lüminesans, Floresan-, ELISA bazlı deneyler, bu yöntemler ile saptanabilir işaretleyici proteinleri ifade etmek için, tümör hücrelerinin değişiklik gerektirir. lüminesans, bir alt-tabaka lusiferaz aktivitesinin saptanması için gereklidir; Bu şekilde, ilave bir aşama ve artan maliyeti vardır. Hem parlaklık ve floresan özel ekipman gerektirir. floresan üretmek için moleküler oksijen ile katalize edilir, yeşil flüoresan proteini (GFP) siklizasyon, gereklidir. Böylece, GFP ifade bu oldukça güvenilmez işaretleyici yaparak, oksijen erişimi bağlı bir tümör kitlesi içinde değişken olabilir 17. Bir belirteç Başka bir strateji olarak murin mesane kanseri hücre çizgisi MB49 modifikasyonu insan prostat spesifik antijen (PSA) 15,16 salgılamaya. Bu belirteçler, deneyin sonunda tümör varlığını teyit olanağına immünohistokimyasal alternatif yapma için alternatif yollar sağlar. Bu çalışma, ortotopik tümör implantasyonundan PLL metodu bildirir ve tümör algılama sistemleri, yani ELISA, floresan ve ultrason görüntüleme bir karşılaştırmasını göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Singapur Ulusal Üniversitesi hayvan kullanımı ve (Protokol numarası 084/12) kullanımına ilişkin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uyulması tüm hayvan çalışmaları.

1. İn Vitro MB49-PSA Hücreleri Büyüyen ve PSA salgılanmasına Ölçme

  1. Bakım tamamlandı Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş (DMEM), 2 mmol / L L-glutamin, mesane kanseri hücreleri MB49-PSA 15, murin ve bir kuluçka makinesi içinde 0.05 mg / ml Penisilin-Streptomisin 37 ° C'de ° C ve% 5 CO2. 200 ug / ml Higromisin B, PSA salgılayan hücrelerin seçimi basıncını korumak için ekleyin.
  2. PSA salgısını, plaka 6 oyuklu bir kültür plakasına 1 x 10 6 hücre tespit etmek ve 48 saat boyunca% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de inkübe etmek.
  3. İki gün sonra, PSA ölçümleri için supernatant toplamak.
    1. Pasteur pipeti kullanarak, sup aktarmak15 ml bir santrifüj tüpüne ernatant.
    2. yüzen hücreleri ve enkaz kaldırmak için 250 xg'de 5 dakika santrifüj. 1.5 mL bir mikrosantrfuj tübünde 30 ° C - PSA deney farklı bir günde gerçekleştirilir ise, süpernatan saklayın. Değilse, hemen bir sonraki adıma geçin.
    3. Insan-serbest PSA ELISA kiti 7 kullanarak PSA konsantrasyonunu belirleyin.
  4. kaplama hücreleri numaralandırmak.
    1. Pasteur pipeti kullanarak, yavaşça DMEM 1 mL yıkama hücreleri. Aspire ve tamamen ortamı çıkarın.
    2. taze medya 1 ml ekleyin ve iyice hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı ile hafifçe kazıyın.
    3. Bir mikrosantrifüj tüp hücreleri aktarmak ve bir tek hücre süspansiyonu sağlamak için iyice yeniden askıya.
    4. Hücre süspansiyonu ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi eşit hacimlerde karıştırın. hemasitometre kullanarak (boya kadar yapmayız) canlı hücreleri saymak.
  5. ng olarak PSA ifadesini hesaplamakPSA / ml ortam / 10 6 hücre. 120 ng / ml / 10 6 hücre - farelerde implantasyon için MB49-PSA hücrelerinin PSA ifadesi 80'dir.

2. ELISA ve Real-time PCR analizi ile PSA Ölçümleri Hassasiyet belirlenmesi

  1. Oyuk başına 1 x 10 6 hücre (yani, 10 0, 10 1, 10 2, 10 maksimum olduğu şekilde ebeveyn MB49 hücrelerin farklı miktarları ile 6 oyuklu bir kültür plakasına tam DMEM ortamında plaka MB49-PSA hücreleri 3, 10 4, 10 5, veya 10 6 MB49-PSA hücreleri) 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, ya da 10 0 MB49 hücreleri, sırasıyla 10, 6 kültürlenir.
  2. aşama 1.3 'de tarif edildiği gibi, bir gün sonra, PSA ölçümleri için supernatant toplamak. Insan-serbest PSA ELISA kiti 7 kullanarak PSA konsantrasyonunu belirleyin.
  3. hücrelerinden RNA ekstrakte edin.
    1. LyseRNA ekstraksiyonu, reaktif 1 mL eklenerek doğrudan plaka hücreleri.
    2. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe bir mikrosantrifüj tüpüne hücre lizat aktarın. kloroform 0,2 ml ilave edilir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde numuneler girdap. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca inkübe.
    3. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri. Dikkatlice interfaz bozmadan yeni bir tüp üst akıcı faz (0.5 mi) aktarın.
    4. izopropil alkol, 0.5 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri. tüpün alt RNA çökelti bozmadan, tamamen süpernatantı.
    5. % 75 etanol içinde bir kez 1 mL pelet yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7500 x g'de santrifüjleyin. Tüm etanol çıkarın ve 10 dakika için havayla kurumaya pelet sağlar.
    6. nükleaz içermeyen su 30 uL RNA çözülür. bu nedenle geliştirmek için 60 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübelubility.
    7. 260 nm'de (A260) ultraviyole (UV) spektroskopisi kullanılarak absorbans ölçülerek RNA miktarını belirler. RNA saflık değerlendirmek için, 280 nm (A280) absorbans ölçmek ve 1.6 üzerinde olmalıdır A260 / A280 oranı hesaplanır.
  4. RNA 2 ug cDNA Ters yazıya.
    1. buz üzerinde reaksiyon karışımı hazırlayın ve 0.2 ml tüpler aktarmak.
    2. Kısaca içeriğini aşağı doğru döndürün ve hava kabarcıklarını yok etmek için tüpler santrifüj.
    3. aşağıdaki şartlarda termal döngü tüpleri yükleyin ve ters transkripsiyon yerine 95 ° C de 5 dakika süre ile 37 ° C'de 60 dak. çalışma tamamlandığında, 4 ° C'de cDNA örnekleri tutmak.
    4. Uzun süreli depolama için 30 ° C - Örnekleri saklayın.
  5. PSA ve sitoplazmik P aktin için gerçek zamanlı PCR analizi gerçekleştirmek. Beta aktin örnekleri normalize etmek için kullanılır. 96 oyuklu bir pla ters transkribe RNA 100 ng ile tahlil gerçekleştirmete. üç kez tüm örnekleri deneyi. aşağıdaki parametrelerle 40 döngü yapın: 2 dk 50 ° C, 95 ° C de 10 dakika da, denatürasyon için 95 ° C 'de 15 saniye ve 60 ° C'de 1 dakika. Bir döngü eşik 35 (BT) de algılama en düşük sınırını ayarlayın; böylece, 35 ötesinde bir CT değeri ile herhangi bir örnek algılanamaz olarak kabul edilir.

3. MB49-PSA Hücre Hattı tümörigenikliğini bakımı

Not: in vitro uzun süreli büyüme tümöre neden olması arasında bir kaybına yol açar. tümörigenisite korumak için, MB49-PSA hücre hattı 2 yılda en az bir kez fare ile pasajlanır edilir.

  1. Hücreler.
    1. Hasat katlanarak steril bir hücre kazıyıcı ile onları hafifçe kazıyarak hücreleri büyüyor. Hücre süspansiyonu ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisi eşit hacimlerde karıştırın. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayımı. Hücrelerin% 20'den fazla ölü olup olmadığını implante etmeyin.
    2. (1 x 10 gerekli canlı hücre miktarını hesaplayın7 hücre / ml) ve 15 ml bir santrifüj tüpüne transfer edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj ve süpernatant atılır. DMEM boş medya hücre pelletini yeniden askıya. implantasyon öncesi FBS tüm izlerini silmek için yıkama üç kez tekrarlayın.
    3. Fareler implantasyon için hazır olana kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.
  2. subkutan dorsal kanadında farelerde tümör hücrelerini implant.
    1. Vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL periton içine enjekte edilen bir anestezik ketamin karışımını medetomidini (75 mg / kg ve 1 mg / kg, sırası ile) ile 4 ila 6 haftalık C57BL6 / J fareleri, anestezisi.
    2. Cildi ortaya çıkarmak için sağ kanadına tıraş.
    3. Forseps bir çift kullanarak, subkutan 24 G iğne ile altta yatan kas ayırın ve hücre süspansiyonu (1 x 10 6 hücre) 0.1 mL enjekte cilt kaldırın. iğne çıkartılırken, tümör hücreleri yapmak, böylece 5 ila 10 saniye boyunca enjeksiyon bölgesini tutamenjeksiyon yerinde dışarı sızmasını.
    4. Vücut ağırlığı 10 g 0.1 mL atipamezol (1 mg / kg) deri altından enjeksiyonu ile fare canlandırmak.
  3. kaliperler kullanarak tümör çapının ölçülmesiyle her iki günde bir tümör büyümesini izleyin. Tümör hacmi, "a" mm, hem en büyük boyutu ve "B" dik genişliği olduğu formül V = (AB 2) / 2, kullanılarak hesaplanır.
  4. Tümör hacmi en az 50 mm 3 (yaklaşık 7 gün) olduğunda, CO 2 ile fare euthanize. DMEM bir aseptik koşullarda steril forseps ve makas çifti ve yeri ile tümör kitlesi tüketim.
  5. 6-çukurlu bir kültür plakasına steril neşter kullanılarak küçük parçalar halinde tümör kıyma. ayrıca tümörü parçalara ayırma için "havan" olarak 1 ml şırınga pistonu kullanın.
  6. Tam DMEM 3 ml ilave edilir ve muhafaza hücreleri bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de ve% 5 CO2.
  7. Hücreler plat uymak keze (bir iki gün arasında), steril bir Pasteur pipeti ile yavaşça aspire ortamı, enkaz ve yapışmayan hücreler çıkarıldı. DMEM ile iki kez yıkanır. Hücreleri rahatsız özen gösterin.
  8. DMEM 1 ml ekleyin ve bir hücre kazıyıcı ile onları kazıma hücreleri hasat. 96 oyuklu bir kültür plakasına oyuk başına bir hemasitometre ve plaka 1 hücre kullanarak hücreleri sayın seçmek ve tek koloniler genişletmek için. Kültür, 37 ° C'de 200 ug / ml Higromisin B DMEM hücre ve% 5 CO2.
  9. ortamı değiştirmek ve her 4 antibiyotik - 5 gün. Onlar yaklaşık% 80-90 konfluent olana kadar hücreleri izleyin. Yeniden plaka pipetleme ile 24 oyuklu kültür plakası üzerine hücreler, hücreleri çıkarmak için.
  10. 24 oyuklu bir kültür plakasına hücreler konfluent olduğunda, bir hücre kazıyıcı ile ovalama ile onları çıkarmak ve 6 oyuklu bir kültür plakasına bunları plaka.
  11. PSA salgılanması için farklı klonları taramak, adım 1'de açıklandığı gibi yüksek PSA ile gizli klonu Cryo-korumakiyon ve gelecekteki fare deneyleri için kullanabilirsiniz.

4. Tümör implante

NOT: Her fare mesane 50 uL DMEM boş medya 1 x 10 5 MB49-PSA hücreleri ile implante edilir. Nedeniyle kateter ölü boşluğa, her zaman ekstra hacim (fare başına ilave en az 100 ul) hazırlamak. Alternatif bir yaklaşım, Kasman ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi bir hava dolu şırınga kullanmak olacaktır. 5 yerine şırınga daha.

  1. Hücreler.
    1. Hücreler, yaklaşık% 80 konfluent geçit tam DMEM ortamında MB49-PSA, tümör hücreleri Bir gün implantasyondan önce, (% 10 FBS, 2 mmol / L L-glutamin, 0.05 mg ile takviye / ml Penisilin-Streptomisin ve 200 1 'lik bir ayırma oranı ile 37 ° C' de ug / ml Higromisin B) ve% 5 CO2: 2'dir.
    2. Prosedürün gününde, steril bir hücre kazıyıcı ile onları hafifçe kazıyarak hücreler hasat. Hücre süspansiyonu, eşit hacimleri birleştirilir ve% 0.4 tripan mavi çözelti. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayımı. Hücrelerin% 20'den fazla ölü olup olmadığını implante etmeyin.
    3. (2 x 10 6 hücre / ml) gerekli olan canlı hücre miktarını hesaplayın ve bir 15 mL santrifüj tüpüne transfer edin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj ve süpernatant atılır. DMEM boş medya hücre pelletini yeniden askıya. implantasyon öncesi FBS tüm izlerini silmek için yıkama üç kez tekrarlayın.
    4. Fareler implantasyon için hazır olana kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.
  2. 4- ila 6-haftalık dişi C57BL / 6J fareleri işlem öncesi bir hafta süreyle ortama alışmaları için izin verin. Tüm hayvan çalışmaları steril koşulları sağlamak için bir biyolojik güvenlik kabini yapılmalıdır.
    1. Her bir fare tartın ve vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL intraperitoneal anestezi (75 mg / kg ketamin ve 1 mg / kg medetomidini) enjekte edilir. Canlı ağırlıkları 17 ve 22 g arasında olmalıdır. Hiçbir RESPO gözlemleyerek anesthetization onaylayınnse bir ayak tutam sonra.
    2. tanımlama, bir kulak yumruk kullanarak kulak işaretleyin.
    3. Hidrasyon için 2 saat - vücut ağırlığı 10 g, her 1 için 0.1 mL periton içine Hartmann'ın çözeltisi ya da bileşik, sodyum laktat enjekte edilir.
    4. Yanıp sönen refleks anestezi altında kayıp ve gözleri kurumasına olduğundan, steril pamuk ampul kullanarak her iki göze steril oftalmik merhem sürün. gerektiğinde yeniden uygulayın.
    5. vücut ısısını korumak için (havayla temas ile aktive) bir ısı paketi üzerinde kağıt havlu üzerine yatar pozisyonda fareler yatırın ve aşağı arka ayakları bantlayın.
  3. bir parmak ile, alt karın bölgesinde hafif bir basınç uygulanır ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe mesaneden idrarı toplamak. Bu örnek idrar PSA bazal değer olarak hizmet vermektedir.
  4. 1 ml şırınganın içine steril poli-L-lizin (PLL) çekiniz ve çıkarılmış iğne stile ile, 24 ayar IV kateter takın. kateter ve ins ucuna kadar yağ sürünkateterizasyonu rehberlik forseps kullanarak mesane içine üretra yoluyla kateteri ert. direnç hissedilir zaman durdurun. NOT: Araştırmacılar uygulanan intravezikal için anestezik ve işlem sonrası analjezik kullanımı ile yağlama jel kullanımı için ihtiyacı konusunda kendi veteriner kadrosu ile tartışmak gerekir.
  5. Veziko-üreteral geri akış 18 önlemek için, 10 ul her 20 saniyede bir oranda yavaş yavaş PLL 50 uL aşılamak. dışarı akışını önlemek için bir tıpa ile 20 dakika için idrar torbasında kateter bırakın.
  6. 20 dakika sonra, kateter kaldırmak ve nazikçe alt karın bölgesinde basarak herhangi bir içeriğin mesaneyi boşaltmak. Boş 1 ml şırınga kullanarak, kateter dışarı kalan içeriğini yıkayın.
  7. pipetle iyice MB49-PSA hücreleri karıştırın ve 1 ml şırınga içine çekin. kateter takın ve kayganlaştırıcı uygulayın. 10 uL her 20 saniyede bir düşük hızda 1 x 10 5 hücre 50 uL aşılamak. tıpa DeğiştirKateter. Kontrol farelere tuzlu 50 uL verin.
  8. 1 saat sonra, sonda ve bir içerik mesane boşaltmak. arka ayakları üzerinde bandını çıkarın ve ventral tarafta fareler yerleştirin. Vücut ağırlığı 10 g 0.1 mL ters ilaç (1 mg / kg atipamezol) enjekte deri altından fareler canlandırmak.
  9. motilite görülmektedir kadar fareler izleyin. kafeslerine fareler dönün.
  10. Tümör tespiti protokolü (Bölüm 5, 7 ya da 8), CO2 kullanılarak fareler euthanize tamamlanmasından sonra. Post-mortem tümör tespiti 6. bölümde tarif edilmektedir.

ELISA ile 5. İzleme Tümör Büyüme

NOT: Tümör varlığı ve büyüme idrar PSA salgısını ölçülerek farelerde izlenir. Araştırmacılar hayvan sağlığı ve refahı sonrası tümör implantasyonu ve insancıl uç noktaları izleme kendi veteriner kadrosu ile danışmalısınız.

  1. farelerin idrar toplamak için iki yöntem vardır.
    1. dışkı malzemeden idrar ayırmak için tasarlanmış bireysel metabolik kafeste tek bir fare koyarak idrar gecede toplayın. ayar soğutma sahip değilse, bir gece boyunca PSA bozulmasını önlemek için, idrar toplama tüpüne bir proteaz inhibitörü (100 uL) ilave edilir. Bununla birlikte mevcut metabolik kafesler sayısı idrar toplama bu yöntemin kullanımını sınırlar.
    2. o (örneğin ABSL2 odalarında gibi) metabolik kafesleri kullanmak için lojistik imkansız olduğu durumlarda, aşama 4.2.1 anlatıldığı gibi fareler anestezi ise alt karın bölgesinde nazik baskı için parmağını kullanarak nokta idrar toplamak. Terapi telkin önce bu genellikle yapılır. Bizim deneyim, idrar en az 150 ul anestezi sonrası 1 saat alınabilir.
  2. Hemen buz üzerine toplanan idrar yerleştirin. Hematüri tümör implantasyonu sonrası ikinci haftasından itibaren görülebilir. Son derece hemolize numuneler ELISA analizini etkileyebilir. Bu nedenle, idrarbuz üzerine yerleştirilmiş ve toplandıktan sonra hızlı bir şekilde işlenmesi gerekir.
  3. hücreler veya artıkları çıkarmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 6,700 x g'de idrar tüpleri santrifüjleyin.
  4. Yeni tüpler içine idrar idrar fareler arasındaki çıktı, kısım farkı normalleştirmek ve bir deney seti 7 kullanarak bir ELISA kiti 7 kullanarak PSA ve kreatinin analizler gerçekleştirerek kadar -30 ° C'de bunları saklamak için. farenin PSA üretmeyen da, ELISA kullanılarak saptandı spesifik olmayan bağlanma düşük seviyelerde mevcuttur. Numune pozitif kabul edilebilir olması için, bir eşik, normal farelere + 3 standart sapma (SD) 15 daha yüksek değerlerde ayarlanmalıdır.

Gerçek zamanlı PCR ile 6. algılama Tümör Varlığı

  1. bitiminde, fare karın boşluğuna incelemek ve mesane bulun. mesane tüketim ve cryovial içine yerleştirin. sıvı nitrojen içinde hemen dondurun.
  2. bir RNA extr dokuların homojenize RNA ekstrakteaksiyon reajanı.
  3. Bölüm 2'de tarif edildiği gibi, PSA ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı PCR analizi gerçekleştirmek.

Floresans Görüntüleme 7. İzleme Tümör Büyüme

  1. Yakın-kızılötesi floresan boya 19 1 x 10 7 MB49-PSA hücreleri etiketleyin.
  2. Hücreler 20 flow sitometri canlılığı ve floresan korumak if-Re plaka ve gün 4, 7, 11, 14, 18 etiketli hücreleri hasat ve 21 kontrol etmek için.
  3. bölümünde 4 yukarıda tarif edildiği gibi, farenin mesane etiketli MB49-PSA hücreleri implante.
  4. her iki günde bir floresan görüntüleme sistemi kullanılarak tümör büyümesini izleyin.
  5. görüntüleme günde, ağır ve vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL periton içine enjekte edilen bir anestezik ketamin karışımını medetomidini (75 mg / kg ve 1 mg / kg, sırası ile) kullanılarak fareler anestezi.
  6. Cildi ortaya çıkarmak için karın bölgesini tıraş.
  7. görüntüleme odasında fareler yerleştirin ve kazanmakgörüntüleme sistemi ile sağlanan yazılımı kullanarak mesanelerin görüntüler.
  8. Vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL bir ters ilaç (1 mg / kg atipamezol) enjekte deri altından fareler canlandırmak.

Yüksek frekanslı ultrason Görüntüleme 8. İzleme Tümör Büyüme

  1. bölümünde 4 yukarıda tarif edildiği gibi farelerde implant tümörler.
  2. Her iki gün, ultrason görüntüleme kullanılarak tümör büyümesini izlemek.
  3. görüntüleme günde, ağır ve vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL periton içine enjekte edilen bir anestezik ketamin karışımını medetomidini (75 mg / kg ve 1 mg / kg, sırası ile) kullanılarak fareler anestezi.
  4. Cildi ortaya çıkarmak için karın bölgesini tıraş.
  5. 24 ayar IV kateter kullanılarak mesane içine steril% 0,9 tuz 100 uL aşılamak. tuzlu mesaneyi gerilmek ve ultrason görüntüleme sırasında görünürlüğünü artırmak olacaktır.
  6. ultrason platformu üzerinde fare yerleştirin ve l iletken jel uygulayınower karın.
  7. Cilde el probu indirin ve görüntüleme platformu 21 mesanenin B-mod görüntü kazanır.
  8. Vücut ağırlığı 10 g başına 0.1 mL miktarında deri altından enjekte ters ilaç (1 mg / kg atipamezol) fareler canlandırmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

MB49 hücrelerinden PSA salgılama büyüme ortamı ile değişir bulunmuştur. Bu artan PSA salgılama (Şekil 1A) ile sonuçlanır, çünkü MB49-PSA DMEM ortamında yetiştirilir. PSA ELISA ve gerçek zamanlı PCR duyarlılığını tespit etmek için, MB49-PSA salgılayan hücrelerin farklı sayıda MB49 ebeveyn hücre ile karıştırıldı. Gerçek zamanlı PCR analizi, 100, PSA salgılayan hücre / 1 x 10 6 hücre (Şekil 1C)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Protokolde en kritik adımlar 1) başarıyla hücre hattı tümörigenikliğini bakımını yapmak; 2) farelerde, tümör hücresi implantasyonundan önce ölçülebilir PSA salgısını sağlanması; Tümör büyüklüğünün değişik azaltacak şekilde 3), implantasyon için tek bir hücre süspansiyonu üretilmesi; ve 4) böbrekte tümör hücre implantasyonu ile sonuçlanır veziko-üreteral reflü önlemek için yavaş bir hızda hücrelere aşılamak.

In vitro olarak uzun s?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
MB49-PSA cellsN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mediaBiowestL0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South AmericanBiowestS1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, PremiumBiowestS181B
Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutamineBiowestX0550
Penicillin-StreptomycinBiowestL0022
Hygromycin BInvitrogen10687-010
free PSA (Human) ELISA kitAbnovaKA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction Ambion15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
C57BL/6J female miceIn Vivos4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)Local pharmacy
Ear punchElectron Microscopy Sciences72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactateB Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointmentAlcon
Heat pack - HotHands handwarmersHeatmax Inc
Introcan Certo IV catheterB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jellyLocal pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001
Quantichrom Creatinine Assay KitBioAssay SystemsDICT-50 
Fluorescent dye - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition SolutionAmbion4427575
NameCompanyCatalog numberComments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR SystemApplied Biosystems
7500 Software v2.3Applied Biosystems
Metabolic CageTecniplast Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system BD Biosciences
BD FACSDiva software v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 imaging system VisualSonics 

Referanslar

  1. Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
  2. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  3. Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
  4. Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
  5. Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181(2013).
  6. Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
  7. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684(2011).
  8. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
  9. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
  10. Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3(2016).
  11. Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
  12. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
  13. Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
  14. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
  15. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
  16. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  17. Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
  18. Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172(2012).
  19. Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075(2007).
  20. Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
  21. Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718(2015).
  22. Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
  23. Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
  24. Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
  25. Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
  26. Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
  27. Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
  28. Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
  29. Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Cancer ResearchSay 119mesanet m rfarelerortotopikmodelalg lamaidrar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır