Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Özet

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Özet

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) hastalığı modelleme ve rejeneratif tedaviler için büyük umut tutun. Daha önce periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PB MNC) Entegrasyon içermeyen iPSCs oluşturmak için epizomal vektörlerin (EV) kullanımını bildirdiler. Kullanılan epizomal vektör, sırasıyla, memeli hücrelerinde plazmid replikasyonu ve uzun süreli tutuculuk izin Epstein-Barr (EB) virüs oriP ve EBNA1 serisi elemanları ile dahil, DNA plasmidleri bulunmaktadır. Daha fazla optimizasyonu ile, iPSC koloni binlerce periferal kan 1 mL elde edilebilir. yüksek yeniden programlama verimi elde etmek için iki kritik faktörler şunlardır: 1) 2A kullanımı "öz-bölünme" peptid böylece iki faktörün ekimolar ifadesini elde, Oct4 ve Sox2 bağlamak; 2) İki vektörün kullanımı myc ve Klf4 ayrı ayrı ifade etmek. Burada entegrasyon-Free IP üretmek için bir adım-adım protokolü açıklamakErişkin periferik kan örneklerinden SC'ler. artık epizomal plazmidler beş pasajlar sonra saptanamaz olarak üretilen iPSCs entegrasyon içermez. yeniden programlama verimliliği Sendai virüsü (SV) vektörler ile karşılaştırılabilir olduğu, ancak, EV plasmidleri çok daha ekonomik bir ticari olarak temin edilebilir SV vektörler daha vardır. Bu uygun fiyatlı EV yeniden programlama sistemi rejeneratif tıp klinik uygulamalar için potansiyel tutar vb entegrasyon serbest mezenkimal kök hücrelerin, nöral kök hücreler, PB çokuluslu şirketlerin doğrudan yeniden programlama için bir yaklaşım sağlar.

Giriş

birkaç transkripsiyon faktörlerinin zorla ifade sonra (Yani Oct4, Sox2, MYC ve Klf4), somatik hücre yenileyici tıp ve hücre replasman tedavisinde ^1-3 uygulamalar için büyük umut tutun kaynaklı pluripotent Kök Hücre (iPSCs), için yeniden olabilir. Bugüne kadar, çeşitli yöntemler ^4-7 yeniden programlama başarı oranını arttırmak için geliştirilmiştir. Viral entegrasyon yeniden programlama faktörleri, yüksek düzeyde stabil ekspresyon yol açtığı için viral vektörler kaynaklı yeniden programlama yaygın iPSCs verimli üretimi için kullanılır. Ancak, hücre genomuna vektör DNA kalıcı entegrasyon sokma mutagenezi ⁵ indükleyebilir. Buna ek olarak, yeniden programlama faktörleri yetersiz inaktivasyon iPSCs farklılaşmayı ⁸ rahatsız edebilir. Bu nedenle, yeniden programlama faktörleri katılımı olmadan iPSCs kullanımı, özellikle, hücre terapisi uygulamalarında kullanımı için zorunludur.

Epizomal Vektörleri (AGH) yaygın entegrasyon serbest iPSCs üretilmesinde kullanılmaktadır. En yaygın olarak kullanılan EV, Epstein-Barr (EB) virüs ⁹ iki elemanları, viral replikasyon (oriP) EB Nükleer Antijen 1 (EBNA1 serisi) kökeni içeren bir plazmiddir. EBNA1 serisi elemanı konakçı hücrenin bölünmesi sırasında epizom bölünmesi sağlar kromozomal DNA'ya oriP içeren plazmid DNA tethers ise oriP elemanı, memeli hücrelerinde plazmid replikasyonunu teşvik eder. Sendai virüsü (SV) ve RNA transfeksiyonu da dahil olmak üzere diğer entegrasyon içermeyen yaklaşımlar ile kıyaslandığında EVS çok sayıdaki avantajları, ^5,6,10 sahiptirler. Onları son derece uygun hale plazmid DNA olarak, AGH kolayca üretilebilir ve evde güncellenmiştir. Buna ek olarak, EV yeniden programlama çeşitli RNA transfeksiyon başarı yeniden programlama için gerekli olan ise EVs tek bir transfeksiyon, iPSC üretimi için yeterli olan daha az olan bir emek-yoğun bir işlemdir.

DErmal fibroblastlar birçok yeniden programlama çalışmalarında kullanılmıştır. Ancak, deri biyopsisi invaziv ve ağrılı bir süreç değil, aynı zamanda yeniden programlama için yeterli miktarlarda hücreleri genişletmek için zaman alıcı değil sadece. Daha büyük bir endişe, yetişkin donörlerin deri hücreleri genellikle böylece deri fibroblastları ^11,12 türetilen iPSCs başvurularını sınırlayıcı, tümörlerle ilişkili mutasyonlara yol açabilir uzun süreli UV ışık radyasyon, maruz kalmıştır. Son zamanlarda, normal insan derisi hücreleri somatik mutasyonlara ve deri skuamöz hücreli karsinom anahtar sürücülerin çoğu dahil olmak üzere birçok kanser genleri, birikir olduğu bildirilmiştir, güçlü pozitif seleksiyon ¹³ altındadır.

1) kan hücreleri kolayca minimal invaziv bir proses ile elde edilebilir, çünkü deri fibroblastları tersine, periferik kan (PB) hücreleri yeniden programlama için bir hücre tercih kaynağıdır, 2) periferal kan hücreleri, hematopoetik kök hücre soyu olanKemik iliğinde bulunan, böylece zararlı ışınlarından korunmalıdır. Periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PB MNC) Ficoll-Hypaque (1.077 gr / ml) ile basit bir gradyan santrifüj aşağıdaki ince beyaz tabaka katmandan bir saat içinde toplanabilir. Elde edilen PB uluslu şirketlerin lenfositler, monositler ve birkaç hematopötik projenitör hücrelerin (HPC) ¹⁴ oluşur. Insan T lenfositleri, PB büyük hücre tipleri bulunmaktadır olgun karşın T hücreleri, T hücre reseptörünün (TCR) genlerinin yeniden düzenlemeleri içerir ve bu nedenle uygulama ^15,16 için potansiyellerini sınırlayıcı sağlam bir genom yoksundur. Ancak, iPSC nesil yoluyla T hücrelerinin gençleştirme Kimerik Antijen Reseptör (SYR) T-hücre tedavisi ^17-19 potansiyel uygulamalar olabilir. Buna karşılık, HPC sağlam bir genom ve kolaylıkla yeniden programlanabilir bulunmaktadır. Sadece 0.01 olmasına rağmen - periferik dolaşımda% 0.1 hücreleri HPC bulunmakta, bu hücreler genişletilebilir ex vivo eritroid ortamda kızarıklara çoğalmasını yana olduğunuoid progenitör hücreler ^14.

Daha önceki çalışmamızda, biz PB yeniden programlama verime ²⁰ 10x artışa neden Yamanaka faktörleri (Oct4, Sox2, MYC ve Klf4), ek faktör BCL-XL kullanılır. Ayrıca BCL2L1 şekilde bilinmektedir BCL-XL, kaspaz ^21,22 aktivasyonunu inhibe ederek hücre ölümüne güçlü bir inhibitörüdür. Fakat, BCL-XL ayrıca pluripotensini ^21,22 sürdürülmesinde önemli bir rol oynayabilir. Son zamanlarda, biz daha fazla ayrı ayrı yeniden programlama verimliliği ²³ yaklaşık 100x artışa yol açar iki vektörleri ile MYC ve Klf4 ifade ederek bizim EV yeniden programlama sistemi optimize ettik. Sağlıklı vericilerden 0.5% - Bu yöntem kullanılarak, transfeksiyon hücre sayısını başlangıç ​​bölünmesiyle koloni sayısı ile tanımlanan yeniden programlama etkinliği, 0.2'dir. aşağıdaki gibi biz PB entegrasyonu ücretsiz iPSCs üretmek için detaylı deneysel prosedürü açıklar.

Protokol

insan PB örneklerin tüm yerel araştırma etik kurul onayı ile Tianjin Kan Merkezi'nden edinilebilir hiçbir kimlik bilgileri ile anonim yetişkin vericilerden elde edilmiştir.

1. Endo içermeyen plazmid hazırlama

1. Üreticinin protokolüne uygun olarak E. coli'nin epizomal vektör elde etmek için ticari bir Plazmid Saflaştırma Maxi Kiti kullanın. Nihai adım için, endotoksin içermeyen steril su ile yerine TE tamponu DNA pelet çözülmesi için.
2. Ticari bir UV / Vis spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçün. konsantrasyonu genellikle A260 / A280 sırasıyla 1.8 ve 2.0, daha fazla A260 / A230 oranları daha büyük 1 ug / ml, bir.

2. Kültür Medya

1. eritroid orta hazırlayın: hematopoetik kök hücre genleşme maddesi, 100 ng / ml insan kök hücresi faktörü (SCF), 10 ng / ml Interleukin-3 (IL3), 2 U / mL Eritropoietin ile desteklenmiş (EPO), 20 ng / ml insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1), 1 uM deksametazon ve 0.2 mM 1-tiogliserol. 0.22 mikron şırınga filtre ile sterilize filtre. Eritroid ortamı bir aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
2. iPSC orta hazırlayın: DMEM / F12 ortamı 1x L-glutamin, 1 x penisilin / streptomisin, 1 x esansiyel olmayan amino asitler, çözelti, 50 ng / ml Fibroblast Büyüme Faktörü 2 (FGF2 ile desteklenmiş (Dulbecco Değiştirilmiş Eagle ortamı / Besin Karışımı, F-12) ), 1x İnsülin-Transferrin-selenit takviyesi (ITS), ve 50 mg / ml askorbik asit. 0.22 mikron şırınga filtre ile sterilize filtre. iPSC ortamı bir aya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
3. , 1 x penisilin / streptomisin ve% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (yüksek glukoz DMEM): MEF orta hazırlayın. 0.22 mikron şırınga filtre ile sterilize filtre. MEF ortamı en fazla bir ay boyunca 4 ° C'de saklandı veya yeni kullanımdan önce 1 x L-glutamin ilave edilebilir.
4. Ponarılması iPSC Soğukta saklama ortamı (2x): 37 ° C su banyosu içinde, steril 30 mL su içinde D-trehaloz 5 g çözündürülür. 4 ° C'ye sıcaklığına getirmek ve daha sonra FBS ve 10 mL dimetilsülfoksit 10 mL (DMSO) ekleyin. 0.22 mikron şırınga filtre ile sterilize filtre. 3 aya kadar ²⁴ için 4 ° C'de saklayın.

Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 3. izolasyonu (PB MNC)

1. 50 ml tüp içine 10 ml taze PB numunesi ve 10 ml PBS tamponu birleştirin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığına PBS getirmek ya da 37 ° C, kullanımdan önce.
   Not: Yaklaşık 1-3 x 10 ⁶ uluslu şirketler (taze veya dondurularak saklanmış) PB 1 mL elde edilebilir. Kültür sırasında olgun hücrelerin ölümü nedeniyle 1 x 10 ⁶ toplam hücre - kültürü 6 gün sonra, 0.5 olmasını bekliyoruz. Yaklaşık 1 x 10 ⁷ hücre taze PB 10 mL elde edilebilir.
2. uzun bir iğne takılı bir 10 ml şırınga kullanılarak tüpün dibine 10 ml Ficoll ekleyin. bu prori Ficoll katman PB ile karıştırmak olmadığından emin olmak için yavaş yavaş yapılmalıdır.
3. düşük hızlanma ve yavaşlama oranında, 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, PB ÇUŞ'ları PB plazması ve Ficoll arasında yer alan beyaz bir tabaka (buffy coat) bulunmaktadır.
4. Yavaş yavaş aspire ~ buffy coat katmanı bozmadan 10 ml PB plazma. Dikkatle yeni 50 ml tüp için 1 ml pipet kullanarak beyaz bir tabaka hasat. 6 ml - beyaz tabaka toplanan hücrelerin toplam hacmi 3 arasında olacaktır.
5. 30 mL toplam hacim getirmek ve 10 ml bir pipet ile iyice karıştırın PBS ekleyin. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
6. 20 ml kültür ortamı (yani, Iscove Modifiye Dulbecco Ortamı, IMDM) supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın ve iyice karıştırın. 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj trombositlerin büyük bir kısmı bertaraf.
7. Süpernatantı ve 1 hücre pelletini - 2 ml IMDM. Hücreler f kullanılabilirya da acil bir kültür ya da daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir aşağı. dondurarak saklama için kriyoprezervasyon orta eşit miktarda ekleyin. hemen ° C derin dondurucuda bir -80 - (şişe başına 1 ml 0.5) ve transfer cryovials cryovials içinde Kısım hücreleri. PB uluslu şirketlerin birkaç hafta -80 ° C'de derin dondurucuda saklanabilir ya da uzun süreli depolama için bir sıvı azot tankına transfer edilebilir.
   NOT: donmuş hücreleri çözülme zaman bizim dondurma orta hücre canlılığı sürdürmek olsa, hücre sayısı çözdürme işlemi sırasında hücre ölümüne bağlı olarak azalabilir. 10 x 10 ⁷ hücre Her flakon donmuş olacak 1 - tavsiye edilir.

Eritroid Ortamda PB ÇUŞ'larının 4. Genişleme

1. 15 ml bir tüp içinde 5 ml IMDM ortamı hazırlar. Hızlı bir şekilde 37 ° C su banyosu içinde dondurulmuş PB ÇUŞ'larına çözülmesi ve daha sonra IMDM ortamı tüp aktarın.
   Not: su banyosunda süre dondurulan hücre ve cryovial u bağlıdırsed. Genellikle, dondurulmuş hücre 1 dakika içinde çözülme olacak.
2. 10 dakika - 5 için 400 xg'de santrifüj. Süpernatantı ve eritroid ortamda hücre pelletini. 10 ul hücre süspansiyonu, 10 ul Tripan mavi solüsyon ilave edin ve iyice karıştırın. 3 dakika - Tripan Mavi 1 içinde ölü hücreleri boyar. hemasitometre kullanarak mikroskop altında hücreleri saymak.
3. Olmayan bir doku kültüründe Kültür PB uluslu şirketlerin (non-TC) 'in bir hücre yoğunluğunda, oyuk başına 2 ml ortam ile 6-çukurlu plaka muamele ~ 5 x 10 ⁶ hücre / mL, 37 ° C de% 5 _CO2 içinde nemlendirilmiş bir kuluçka cihazı.
4. D 3 ve 5 de ortam değiştirilmeden her bir oyuğa, doğrudan 1 ml taze eritroid orta ekleyin.
5. D 6, nucleofection için PB ÇUŞ'larına hasat.

5. PB MNC Nucleofection ve yeniden programlanması

1. nucleofection bir gün önce, ön-kaplama, 20 dakika boyunca 37 ° C 'de,% 0.1 jelatin ile 6 oyuklu plakalar TC-işlemden geçirildi. Çözülme inaktive Fare Embriyonik FibroBlast (MEF) besleyici 37 ° C su banyosu içinde hücreleri hemen MEF ortam 5 ml ihtiva eden bir 15 ml tüp aktarın.
2. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve süpernatant kaldırmak. , 6-çukurlu plaka jelatin kaldırma MEF ortamda hücre pelletini, ve jelatin önceden muamele edilmiş 6-çukurlu plaka aktarın. Her bir tohum 2'de - 4 X 10 ⁵ etkisizleştirilmiş MEF hücreleri 2 ml MEF ortamı içinde askıya alınmıştır.
3. Kültür, bir% 5 _CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C'de MEF besleyici hücreleri.
4. nucleofection gününde, MEF orta aspire ve 1 mL eritroid ortamı ile değiştirin. % 5 _CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dakika için 10 - kültürü plakası önceden dengeye.
5. 2 ug Maksimum boyanma-OCT4-2A-Sox2; 1 ug pEV-myc, 1 ug pEV-Klf4 ve 1.5 ml steril bir Eppendorf tüpü içinde 0.5 ug pEV-BCL-XL. 5 dakika kirlenmesini önlemek ve oda sıcaklığına kadar soğuması için 50 ° C'de tüp ısıtın. Eklemek57 ul tampon, 13 ul ilave nucleofection.
6. Hasat, 7 dakika boyunca 200 x g 'de santrifüj ile 5 ml tüp 2 x 10 ⁶ kültürlenmiş PB uluslu şirketlerin. Süpernatantı ve hücre pelet plazmid ve nucleofection tampon karışımı ekleyin. parmağınızla tüp hafifçe vurarak iyice karıştırın.
   Not 2 x 10 ⁵ hücre olduğunca düşük nucleofection kullanılabilir, ama daha düşük bir yeniden programlama verimlilik ve beklenmelidir.
7. kitte sağlanan küvete DNA ve hücre süspansiyonu aktarın ve küvet kap. nucleofection cihazda Program U-008 seçin. tutucu içine küvet yerleştirin ve U-008 programı uygulamak için OK tuşuna basın.
8. hemen önceden dengelenmiş MEF plaka 1 ml önceden ısıtılmış eritroid her küvet içinde orta ve aktarım hücrelerini - tutucudan küvet alın, 0.5 ekleyin. Nedeniyle değişen hücrelerin farklı sayıda tohumlu yüksek yeniden programlama verimliliği ve donör değişimi, 1-10 x 10 ⁵ hücrelerinden per de son derece teşvik edilmektedir.
9. Hipoksiyaya odasına plaka aktarın ve _1,% 92 _N2,% 5 _CO2 ve% 3 O ₂ oluşan karışık bir gaz ile bölme yıkayın - 20 L / dakikalık bir hızda 2 dk. 37 ° C'de odası, kültür hücreleri sızdırmazlık sonra.
10. D2 sonrası nucleofection, her kuyuya doğrudan 2 mL iPSC orta ekleyin.
11. D 4 sonrası nucleofection anda, orta 3 mL kaldırmak ve 2 ml taze iPSC orta ekleyin. D 4 sonrası nucleofection, canlı hücrelerin en besleyici katmanına eklenmiş olacaktır.
12. 18 - D 6 post-nucleofection sonra uL orta geçirdi 500 bırakarak ve D 14 kadar 0.25 mM sodyum bütirat ile desteklenmiş 2 ml taze E8 orta ekleyerek ORTA her 2 günde bir değiştirin.
    Not: Ek besleme hücreleri besleyici hücreler müstakil edilmiştir gözlemleyerek her kültür çukurlarına ilave edilebilir. MEFS (5.1 ve 5.2) çözündükten sonra, (E8 orta küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon hücre pelletini, yani ~ 0.daha sonra bir 6-yuvalı plaka oyuk) ve 2 mL kültür oyuklarına MEFS ekleyin. Yaklaşık% 2 FBS hücre eki geliştirmek için ilave edilebilir. Seçenek olarak ise, MEF-koşullandınlmış madde de kullanılabilir, ancak bu daha zahmetli olabilir.

iPSCs 6. Genişleme

NOT: - 10 sonrası nucleofection Çoğu durumda, iPSC kolonilerin sayıda D 8 görünür. D 14 sonra büyük iPSC kolonileri genellikle toplamak için hazır.

1. koloniler çekme önce, besleyici ya da Matrigel kaplı 24 oyuklu plakanın bir kuyuda, ROCK inhibitörü, Y27632 (10 uM) ile takviye edilmiş 500 uL E8 orta ekleyin. çizilmeye ve mikroskop altında koloniler almak için 10 ya da 20 uL pipet kullanın. Kültür ortamı içeren çukurlara, her koloninin parçaları aktarın.
   Not: Matrigel konsantrasyonu bir partiden diğerine farklılık göstermektedir. Matrigel 100 seyreltme: Genellikle, biz 1 kullanın.
   1. Çapraz bulaşmayı önlemek için, çekmebüyük ve iyi diğerlerinden ayrılır olan koloniler. % 5 _CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de kültür iPSCs.
      Not: Bu, 6 gözlü bir plakanın her bir düzinelerce veya koloniler yüzlerce olduğunda iPSC nüfusu bağlı hücre göçü poliklonal olabilir dikkat gerekir.
2. İlk 2 gün boyunca orta değiştirmeyin. ROCK inhibitörü küçük koloniler ²⁵ hayatta kalmasını teşvik edebilir.
3. itibaren D 2, harcanan orta kaldırarak ve de her 500 uL taze E8 orta ekleyerek her gün orta değiştirin.
4. koloniler yeterince büyük olduğunda yaklaşık 1 hafta sonra, orta kaldırmak ve 1 37 ° C'de, 300 ul hücre ayrılma çözeltisi (PBS içinde 0.5 mM EDTA) ile hücrelerin tedavi - 3 dk. Hücre dekolmanı çözüm çıkarın ve iPSCs askıya ROCK inhibitörü (10 uM) içeren E8 orta ekleyin. aşırı hücre ölümüne yol açabilir tek hücre içine kolonileri yıkmak yok. 50 hücre - 5, hücre kümeleris iPSC geçişi için uygundur.
5. besleyiciler ve Matrigel ile kaplanmış olan bir 12 ya da 6-çukurlu bir levhanın her çukuruna hücre süspansiyonu% 100 - başına 50.
6. Matrigel kaplı plakalar uzun süreli kültür (6.1 nota bakın), her gün orta değiştirin. Hücre konflüansa 40 ulaştığında -% 60, ~ 3 dakika için 37 ° C 'de 1 ml hücre kopması çözeltisi (PBS içinde 0.5 mM EDTA) ile hücrelerin tedavisi. koloniler kıvrılıp başladığınızda, hücre dekolmanı çözüm kaldırmak ve iPSCs askıya E8 orta içeren ROCK inhibitörü (10 uM) ekleyin. Passage 4 bir yarma faktörü ile hücreleri - 8'e hayatta artırmak için hücrelerin pasaj zaman ROCK inhibitörü ilave edilmeli ve farklılaşma önlemek için 1 d sonradan kaldırıldı.
7. üreticinin protokolüne uygun olarak 5 dakika - dondurularak aşağı iPSCs, 3, 37 ° C'de hücre kopması çözeltisi ile hücre tedavisi. iPSC kolonileri kıvrılıp başladığınızda, tampon aspire ve 0.5 eklemek - 1 ml E8 orta.
8. hücre süspansiyonu için dondurarak saklama ortamına ait eşit bir hacmi ilave edin ve iyice karıştırın. Dondurulmuş iPSCs birkaç hafta ya da uzun süreli depolama için sıvı azot içinde bir -80 ° C dondurucu içinde saklanabilir.

Artık Epizomal Plazmidler olmadan iPSCs 7. Seçimi

1. geçit 5, hasat iPSCs sonra ve genomik DNA ayıklayın.
   Not: Genellikle kültür 5 geçiş sonrası, artık epizomal plasmidleri saptanamaz. Böylece, neredeyse tüm 5 (yani geçidin 10) Yukarıdaki pasajlar da iPSC kolonilerinin kalan epizomal plasmidleri eksiktir.
2. Bir negatif kontrol olarak transfekte edilmemiş PB çok uluslu genomik DNA testi. hücre başına PEV plazmid bir kopyası ile hücreleri taklit etmek için 1 mcg negatif kontrol DNA'ya 1.6 pg PEV-OCT4-2A-Sox2 plazmid ekleyin.
3. (Ileri 10 mcM her ve geri primerler) 100 ng genomik DNA ve 1 uL spesifik primerler dahil 9 ul PCR sınıf su ekleyin 10 uL Yüksek Sadakat PCR Master Mix içine. am normaleGAPDH tarafından DNA'nın Miktarı. EBNA1 serisi-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT, EBNA1 serisi R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG, WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT, WPRE R GTTGCGTCAGCAAACACAGT, GAPDH-F GAGTCCACTGGCGTCTTC, GAPDH R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC: PCR için, aşağıdaki primerler kullanın.
4. 60 saniye için 98 ° C 'de reaksiyon karışımının inkübe; 10 s, 30 s, 60 ° C'de ve 30 saniye 72 ° C'de 98 ° C eklenmiştir. 30 döngü sonrasında, 5 dakika boyunca 72 ° C'de reaksiyonu uzanır.
5. Yük bir% 1 agaroz jeli her çukuruna 5 uL PCR ürünleri. V. ileri kültür ve aşağı analiz için EBNA1 serisi ve WPRE için saptanamayan bantları ile iPSC klonlar seçin 100 ° C'de 30 dakika - 20 jel çalıştırın.

8. Akım Sitometri

1. tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 5 dakika - 3, 37 ° C'de Accutase ile muamele etmek suretiyle hasat iPSCs. Ekle 1 uL PE-konjuge anti-TRA-1-60 ya da anti-SSEA4 ya İzotipik antikoru hücre süspansiyonunun 100 uL (1 eFluor 570 konjuge - 5 x 10 ⁵ hücre) 5 ml tüplerinde. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlık bir yerde inkübe edin.
2. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca boyama sonra, 5 dakika boyunca 400 x g'de ml PBS ve santrifüj 2 ekleyin. Hücre analizörü sitometri akışı ile floresan-aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) analizi için, 300 ul PBS içinde yeniden süspanse hücreleri. ^23,26

9. Konfokal Görüntüleme

1. Matrigel kaplı oda slaytlar Tohum iPSCs.
2. Sonra 3 - kültür 4 gün büyüme ortamı çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit (PFA) ile tespit edin. PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
   Not: PFA toksik ve zararlı.
3. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 0.1 Triton X-100 (PBS-T) ile hücrelerin tedavi edin. PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
4. 1 saat boyunca oda sıcaklığında: bloke edici tampon (V PBS içerisinde% 5 keçi serumu, V) hücreleri bloke.
5. bloke adımı sırasında, bloke edici tampon içinde birincil antikor (100x) seyreltin.
   NOT: Antikorlar bilgi Malzemelerin Tablo listelenir / Ekipman.
6. 4 ° de CO / N seyreltilmiş antikor ile inkübe hücreleri.
7. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez, ardından 15 dakika boyunca PBS-T ile iki kez yıkanır.
8. 2 saat boyunca oda sıcaklığında seyreltilmiş bir florofor-konjuge sekonder antikor ile inkübe hücreleri.
9. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez, ardından 15 dakika boyunca PBS-T ile hücreler iki kez yıkanır.
10. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde DAPI (1 ug / mL) ile çekirdeği leke.
11. 15 dakika boyunca PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.
12. konfokal mikroskop görüntüleri yakalayın. ^23,27

10. Teratom Deneyi

Seyreltilmiş 200 uL DMEM / F12 hücre ayrılma çözeltisi (PBS içinde 0.5 mM EDTA) ile tekrar süspansiyon hücreleri ile hasat 1 x 10 ⁶ iPSCs (1: 1) Matrigel.

1. Subkutan NOD / SCID bağışık yetmezliği olan farelere arka haunch içine hücreleri enjekte edilir.
2. 8 at - iPSC enjeksiyonundan sonra 12 hafta, incelemek ve% 10 formalin teratom düzeltin. ²⁸
3. microsectioning sonrahematoksilen ve eozin (H & E) ile boyama, örnekleri analiz eder. ²⁹

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, 1 x 10 ⁵ nucleofected PB ÇUŞ'ları gelen kolonilerin yüzlerce elde edebilirsiniz (Şekil 1A ve 1B). % 0.5 ve koloniler Pluripotency belirteçleri (Şekil 1C ve 1D) ifade - yeniden programlama verimi yaklaşık 0.2 olduğunu. açıklanan protokol kullanılarak oluşturulan iPSCs entegrasyon içermez ve teratom 3 germ tabakalarını (Şekil 1E ve 1F)

Tartışmalar

Sağlıklı donörlerden veya hastalardan alınan kan örnekleri Kazanılması temel araştırma ve klinik hücre terapisi için çekici bir hücre kaynağı yapma, rahat ve non-invaziv olduğunu. Burada periferik kan örneklerinden entegrasyon serbest iPSCs yüksek verimli üretimi için bir protokol tanımlanmıştır. Bu tekrarlanabilir ve uygun fiyatlı bir yaklaşım iPSC alanını yararına olmalıdır.

Biz yüksek verimli PB yeniden programlama ³⁰ sorumlu iki kritik faktör...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium	Sigma	S0192	Store at 4 °C
Human Stem Cell Factor (SCF)	Peprotech	300-07	Store at -20 or -80 °C
Interleukin-3 (IL-3)	Peprotech	AF-200-03	Store at -20 or -80 °C
Erythropoietin (EPO)	Peprotech	100-64	Store at -20 or -80 °C
Insulin Growth Factor-1 (IGF-1)	Peprotech	100-11	Store at -20 or -80 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Store at -20 or -80 °C
1-thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145	Store at -20 or -80 °C
DMEM/F12 medium	Gibco	112660-012	Store at 4 °C
L-glutamine (100x)	Gibco	25030-081	Store at -20 °C
Penicillin/Streptomycin (100x)	Gibco	15140-122	Store at -20 °C
Non-essential Amino Acids solution (100x)	Gibco	11140-050	Store at 4 °C
Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2)	Peprotech	100-18B	Store at -20 or -80 °C
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS, 100x)	Gibco	41400-045	Store at 4 °C
Ascorbic acid	Sigma	49752	Store at -20 °C
DMEM (high glucose) medium	Thermo	SH30243.01B	Store at 4 °C
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SV30087.01	Store at -20 °C
Ficoll	GE Healthcare, SIGMA	17-5442-02	Store at RT
Trehalose	Sigma	T9531	Store at 4 °C
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650	Store at RT, protect from light
Endofree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362	Store at RT
IMDM	Gibco	21056-023	Store at 4 °C
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit	Lonza	VPA-1003	Store at RT, nucleofection buffer and supplement should be stored at 4 °C
Sodium Butyrate	Sigma	B5887	Store at -20 or -80 °C
ROCK inhibitor - Y27632	STEMGENT	04-0012-10	Store at -20 °C
Essential 8 basal medium (E8)	Gibco	A15169-01	Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80 °C
Matrigel	BD	354277	Store at -20 or -80 °C
2x EasyTaq PCR SuperMix (+dye)	TransGen Biotech	AS111	Store at -20 °C
Cell detachment solution	STEMGENT	01-0006	Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single-cell suspension
DAPI	Sigma	D9542-1MG	Store at 4 or -20 °C
Anti-Nanog AF488	BD	560791	Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when used
Anti-OCT4	abcam	ab19857	Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when used
AF488 donkey anti-mouse IgG	Invitrogen	A21202	Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence,  dilute 1/500 when used
PE anti-human TRA-1-60-R antibody	Biolegend	330610	Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
eFluor 570-conjugated anti-SSEA4	eBioscience	41-8843	Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Isotype antibody	eBioscience	11-4011	Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry
Alkaline Phosphatase Detection Kit	SiDanSai	1102-100	Store at 4 °C
Genomic DNA Extraction Kit	TIANGEN	DP304-02	Store at RT
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	Store at RT
Flow cytometry cell analyzer	BD	LSRII
Spinning Disk Confocal microscope (SDC)	PerkinElmer	UltraVIEW VOX	for confocal imaging
Nucleofection device	Lonza	Nucleofector 2b	for the nucleofection of PB MNC
ImageQuant LAS-4010	GE		to take photos of AP staining in bulk