Bir Tüysüz fare kulak memesi içinde intravital Mikroskopi ve trombüs İndüksiyon

Özet

Tüysüz SKH1-Hr ^hr fare kulak modeli incelendiğinde mikrovasküler yatakta önce cerrahi hazırlık yapmadan mikrosirkülasyonun ve fototoksik trombüs indüksiyon Intravital floresan mikroskopisi sağlar. Bu nedenle, tüysüz fare kulak mikrovasküler trombus oluşumu, trombüs evrimi ve tromboliz sırasında karmaşık etkileşimleri incelemek için in vivo model bir mükemmeldir.

Özet

Vasküler hastalıkların trombotik komplikasyonlar sanayi ülkelerinde morbidite ve mortalite bir önde gelen nedenidir. Nedeniyle trombus oluşumu sırasında hücresel ve hücresel olmayan kan bileşenleri arasındaki karmaşık etkileşimler, fizyoloji ve tromboz patofizyolojisi güvenilir çalışmalar sadece, in vivo olarak gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, bu makale tüysüz farelerde bir kulak modeli sunar ve mikrosirkülasyonun, trombüs oluşumu ve trombüs evrim in vivo analiz odaklanmaktadır. İntra vital floresan mikroskobu ve ilgili floresan boyalar intravenöz (iv) uygulama kullanılarak, kulak içinde bir mikrodolaşım tekrar analiz kolayca cerrahi hazırlamaya gerek kalmadan, gerçekleştirilebilir. Bundan başka, bu model, yara iyileşmesi, reperfüzyon hasarı, veya anjiyojenezin de dahil olmak üzere, farklı sorunları in vivo çalışmalar için uyarlanabilir. Özetle, tüysüz farelerin kulak içinde viv için ideal bir modeldirfizyolojik veya patofizyolojik koşullarda ve farklı sistemik veya topikal tedavilere yönelik reaksiyonun değerlendirilmesinde cilt mikro o çalışması.

Giriş

Bu makalenin amacı direkt gözlem ve mikrodolaşımında analizi, trombüs oluşumu ve trombüs evrim için tüysüz fare aurikula uygulanan intravital mikroskopi tekniği tanımlamaktır. 1,000'de 1 olan bir insidans oranı ile, venöz tromboz hala morbiditenin yaygın bir nedenidir. Teşhis, önleme stratejileri ve tedavileri son yıllarda geliştirilmiş olmasına rağmen, venöz tromboz üçte biri bir pulmoner emboli ¹ olarak tezahür eder. Arter trombozu sanayi ülkelerinde en yaygın ölüm nedenidir kardiyovasküler hastalıklar, kritik bir rol oynar. aterosklerotik plakların kopması dayalı Arter trombozu kalp krizi, mezenterik enfarktüsü ve felcin katılır. Her ameliyat, kan bileşenlerine subendotelyal yapıları ortaya çıkarır kan akışı dinamiklerini değiştiriyor ve hastayı hareketsiz hale getirir. Alt bacak, organ t endoprostetik cerrahisinderansplantation ve flep cerrahisi tromboz komplikasyonlarının sık nedenleridir. özellikle mikrovasküler tromboz sık olarak klinik semptomların olmaması nedeniyle, geri dönüşü olmayan bir hasara neden olur. Benzer şekilde, mikrovasküler tromboz diğerleri arasında trombotik trombositopenik purpura, sepsis, yayılmış damar içi pıhtılaşma, antifosfolipid sendromu, kronik venöz yetmezliği de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir kural oynar.

terapi ve tromboz önlenmesi için çeşitli yeni ilaçlar son yıllarda geliştirilen, ancak antiplatelet ilaçlar ve antikoagülanlar hala yan etkileri, eksikliği antagonistleri var ve uzun süreli etkileri vardır. Bu eksiklikler, acil tıbbi bakım problemlerine yol açar. Bu nedenle, daha fazla araştırma hiç in vitro taklit edilebilir tromboz, esnasında cereyan eden kompleks işlemleri ortaya çıkarmak için gereklidir.

Tüysüz SKH1-Sa ^sa fare Londra'da bir hayvanat bahçesinde 1926 keşfedildi.Nedeniyle kromozom 14 üzerinde bir gen hatası nedeniyle, hayvan Bu gemilerin intravital mikroskopi için erişilebilir iyi kanlanan kulak kepçesi yapar doğum sonrası 10. günde sonra kürk kaybeder. kulak ortalama kalınlığı 300 um'dir. Bu kıkırdak ayrılmış dermisin iki katmandan oluşur. kıkırdak dışbükey sırt tarafında, 3 iletim demetleri kulak memesi girin. Apikal vasküler yaylar ve bazal şant üç demetleri bağlayın. venüller 200 um (bazal) ve 10 um (apikal) arasında çaplara sahiptirler. Dar örgülü kılcal boş saç ² folikülleri çevreler. Tüysüz SKH1-Hr ^hr fare anatomi kulak kepçesi tromboz araştırma için güçlü ve uygun maliyetli bir model yapar.

Protokol

All in vivo deneyler (7221.3-1-006 / 15) Hayvanların korunması ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı için NIH Kılavuzu (Laboratuar Hayvan Kaynakları Enstitüsü, Ulusal Araştırma Konseyi) Alman mevzuatına uygun olarak yapılmıştır.

Hayvanların 1. Genel tutulması

1. 4 ila 6 hafta arası erkek SKH1-Hr ^hr farelerle deneyler yapın. 20 ve 25 g arasında ağırlığa sahip hayvanlar kullanın.
2. Su ve yiyecek istedikleri kadar hiç istikrarlı erişimi olan bir patojen içermeyen tesiste ve 26 ° C'ye kadar 24 standartlaştırılmış koşulları ve yaklaşık% 60 bağıl nem altında hayvanları tutun.
3. bir kafes içinde beş erkek hayvanlar kadar tutun. Onların iyiliği için hayvanların barınma sırasında yatak ve zenginleştirme malzemeyi sağlamak.

Hayvanlar 2. prearrangement

1. (Örneğin, kanabinoid, 5 m fare tartılır ve ilgili ilaç yükbir insülin şırıngasına g / kg vücut ağırlığı (BW)). trombus indüksiyonu öncesinde ilaç 30 dakika yönetmek.
2. başparmak ve işaret parmağı ve küçük parmak fare kuyruğu arasındaki farenin boynunu tutarak, hayvan germek ve karın sol alt kadranda içine ilaç intraperitoneal (ip) enjekte edin. 15 dakika boyunca kafesine geri hayvan koyun.
3. ketamin (90 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (25 mg / kg vücut ağırlığı) ile anestezi hazırlayın. trombus indüksiyonuna 15 dakika önce, fare anestezi. Kafesteki fareyi koyun hafifçe kuyruk çekin ve bir insülin şırınga ile anestezikler ip enjekte edin.
4. Anestezi başlangıcından kadar geri kafesin içine fare koyun. Yeterli anestezi doğrulamak için, forseps ile kuyruk çimdik.
5. bir insülin şırıngasına (% 5, 150 kDa, FITC-dekstran) çözüldü floresin izotiyosiyanat-etiketli dekstran yük 0.05 ml. şırıngayı doldururken, hava kabarcığı, kalmasını sağlamak hatta küçük intravenousl çünküY, (iv) idaresindeki hava kabarcıkları hayvan için ölümcül olabilir.
6. aşağı dönük pozisyonda bir ısıtma plakası üzerinde anestezi fare yerleştirin. 37 ° C'ye ısıtma plakası ayarlayın.
7. fare kornea üzerinde göz merhemi koyun. cilt dezenfekte ve steril aletler kullanılır.
8. Sağ kulak kranial ve kaudal kenarına polipropilen 7/0 iki dikiş Dikiş. Mümkün olan (Şekil 1B) gibi bir baz olarak kenarına yakın ve proksimal olarak dikiş yerleştirin.
9. sırtüstü için fareyi Shift. yapışkan şeritler kullanılarak acrylglass platforma tüm bacaklar sabitleyin. ön dişleri altında bir dikiş kanca ve yapışkan şeritlerle acrylglass sütürü yapışarak dorsifleksiyonda baş pozisyonu.
10. operasyon stereomicroscope altında platformda hayvan transloke. 16X büyütme kullanın.

Sol jügüler damar ve FITC-dekstran Enjeksiyon 3. hazırlanması

Not: mikrofon içinSağ kulak roscopy, sol juguler ven hazırlar.

1. Bir bisturi kullanılarak, bir kranyokaudal yönünde boyun sol tarafında deri 5 mm'lik bir insizyon oluşturmak. Bir microforceps ve microscissors deri altı doku inceleyin. Polyester 8/0 dikiş veya elektrokoagülasyon ile ligatı geçiş kaplar ya.
2. gemi dokunmadan microforceps ve microscissors kullanarak kendi adventisyanın gelen damar boşaltın.
3. Floresan boyasının, enjeksiyon için hazırlanmış insülin şırınga kullanın. Dikkatle damarı delinmeden, mikroforcepslerle damar duvarını yakala. şırınga ile gerilmiş damar duvarına penetre ve FITC-dekstran iv enjekte edilir.
4. bir pamukla şırınga çekilmesi sonrasında kanamayı durdurun. kan kaçının ve kulağın kirlenmesini boya.

Intravital Floresan Mikroskopi Sağ Kulak 4. Konumlandırma

1. Bir acrylglass c ısıtma plakası üzerinde hayvan aktarmaIsıtma plakası için bir yarık ve kulak konumlandırılması için bir 0.5 cm yüksekliğindeki düzlem ile onstrüksiyon.
2. yapışkan şeritler kullanılarak ısıtma plakası üzerinde hayvan yüzü aşağı bakacak şekilde düzeltildi. Kulak apikal kısmı düzlemde düz yerleştirilmiş olabilir, böylece kulak (Şekil 1B) 0.5 cm yüksekliğindeki düzlem yanında kulağın kökünde nispeten güçlü ve dışbükey kıkırdak yerleştirin.
3. kulak konumlandırmak üzere acrylglass düzlemine Oda sıcaklığında% 0.9 NaCl, bir damla ekleyin. içbükey ventral tarafta önceden düzenlenmiş dikiş% 0.9 NaCl damla, aşağı doğru bakacak şekilde, sağ kulak yerleştirin. Pamuklu çubuk kullanarak, NaCl damlasını emmesi ve kılcal kuvvetler acrylglass için kulak uçağı eklemek edelim.
4. kulağın pozisyonunu düzeltmek için acrylglass için dikiş kaydet.
5. kulak dışbükey dorsal tarafına% 0.9, oda sıcaklığı NaCI bir damla ekleyin. Dikkatle th giren bazal damarları sıkıştırmadan kulakta, bir lamel (0.5 cm çaplı) koymakE kulak. pamuklu bez kullanılarak, lamel ve kulak hedef damarlar arasındaki mesafeyi en aza indirmek için coverslip altında mümkün olduğu kadar NaCl çıkarın.

Sağ Kulak 5. intravital Floresan Mikroskopi ve Trombüsü İndüksiyon

1. (-;: 510; LP: 520 FT 490 nm, 450), FITC-dekstran görselleştirme için intravital floresan mikroskobu ayarlayın. bir ışık kaynağı olarak bir değişken 100 W cıva buharlı bir lamba kullanarak. Bir DVD kaydedici yüksek çözünürlüklü, siyah-beyaz CCD kamera bağlayın.
2. İntra vital floresan mikroskop masasına sabitlenen kaçırılan kulak ısıtma plakası içeren acrylglass üzerinde hayvan aktarın.
3. çapında ve 400 anterograd kan akımı ile 60 um - - 600 mm / s 20X büyütme (20X / 0.95 sayısal açıklığı) ve% 20 ışık yoğunluğu kullanılarak, bir venöz damar için 50 arayın.
4. 63x magnificatio su daldırma için lamel oda sıcaklığında su bir damla eklemen, hedef (63X / 0.95 sayısal açıklık). 1 mm çaplı kanül olan bir şırınga kullanın ve mikroskop amacı olduğunda damla yerleştirin. su damlası ile lamel ve objektif temas için yeterli su ekleyin.
5. Hemen su damlası uygulanmasından sonra, çapı ve kan akışı çevrimdışı ölçümü için% 20 ışık yoğunluğuyla 20 s için kabı kayıt başlar.
6. FITC-dekstran ile enjekte edilmesinden sonra trombus indüksiyon 5 dakika başlatın. Bu amaçla,% 100 ışık yoğunluğunu yükseltmek.
7. trombus indüksiyonu sırasında, kan akışını kontrol etmek için 30 saniyelik bir süre içinde, 2 saniye süreyle mikroskop açıklığı kapatmak. Kan akışının devam etmesi durumunda, daha açıklığı açmak. durdu kan akışı durumunda, 30 saniye boyunca gemi gözlemleyin.
   NOT: Akış 30 sn veya daha uzun süre veya kan retrograd akar eğer hala duruyor sanki damar tıkalı olarak sınıflandırılır. ortograd kan akışı yeniden başlarsa, tamamen açıklığı ve Contin açmak yukarıda tarif edildiği gibi vi damar oklüzyonu kadar trombus indüksiyon meydana gelir. Erken trombus indüksiyonu sırasında, açıklık kan akışını kontrol etmek için kapalı süreleri neredeyse sürekli epi-aydınlatma sağlamak amacıyla mümkün olduğu kadar kısa olduğundan emin olun. Daha sonra, trombüs büyüme sırasında, gemi az bir floresan boya ile perfüze, bu yüzden sürekli gözlenebilir.
8. Seçip kulağa başına 5 damarlarını tıkayabilir. FITC-dekstran ile enjekte edilmesinden sonra, yaklaşık 1 saat için mikroskop altında trombus indüksiyon süresi sınırlar.

6. Takibi Etkinlikleri

1. transkütanöz polipropilen 6/0 sütür kullanılarak boynun bir yara kapanmasını gerçekleştirin.
2. anestezi kurtarma sırasında, kafesine geri fare koymak ve kızıl ötesi ışık kullanarak hayvan ısıtın.
3. damar ve kan akışının hızının çapının ölçümü sağlayan yazılıma DVD kaydedici kaydedilen verileri aktarın.

Sol Kulak _title "> 7. Sınav

1. hayvan eski ve 48 saat tüm enjekte FITC-dekstran ortadan olsun.
2. Yukarıda açıklanan adımları, sağ juguler ven ve sol kulağını hazırlarken bu kez yeniden çalıştırın.

8. Doku Asservation

1. sol kulağın intravital floresan mikroskobu sonra, numune 0.5 mL göz retrobulbar damar pleksustan kan bir cam kılcal kullanılmıştır. Venöz kan kılcal akar kadar dikkatlice, vidalama hareketi ile iç palpebral açısı nüfuz eder. bir etilendiamintetraasetik asit (EDTA), kan tüpü içinde sonda toplayın.
2. kan örneği alındıktan sonra, kuyruk damarına 500 mg / kg vücut ağırlığı ketamin enjekte edilerek hayvan kurban.
3. lökositler eritrosit, trombosit, hemoglobin ve hematokrit kantitatif bir değerlendirme için bir hematoloji analiz cihazı kullanarak kan hücreleri sayın.
4. 10 m 2.500 x g'de oda sıcaklığında geri kalan EDTA kan santrifüjiçinde. Pipet ve daha ileri araştırmalar için kan plazması dondurmak.
5. makas kullanarak, kulakçıkları kesilmiş ve histolojik inceleme için% 4 formaldehit bunları düzeltin.

Sonuçlar

Trombogenezis üzerinde Kannabinoid Tedavinin Etkileri

FITC dekstran 0.05 mL enjeksiyonundan sonra, fototoksik trombüs indüksiyon (Şekiller 2 ve 3). Bir endotel lezyon ve parietal trombosit tıkacın oluşumuna yol açar Bu çalışmada, ip kanabinoid enjeksiyonu (5 mg / kg vücut ağırlığı) ya da araç daha sonra trombus indüksiyon tüm venüllerde trombotik damar tıkanması (Ş...

Tartışmalar

SKH1-Sa ^sa farelerin kulak memesi başarılı trombüs indüksiyon için pek çok kritik adım vardır. Sorun giderme için, protokolün ilgili adımlar parantez içinde belirtilmiştir.

6 hafta ve epidermis düşük kornifikasyonu ile - Sınav koşulları 4 yaşında genç hayvanlarda idealdir. Büyük hayvanlarda, damarların görüntülenmesi kalitesi nedeniyle cilt yüzeyi ile hedef damarlar (adım 1.1) arasında daha yüksek mesafeye daha kötü ve daha karşılaştırılabil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
acrylglass pad			integrated heating, 0.5 cm high plane