Hazırlama ve Değerlendirilmesi<sup&gt; 99m</sup&gt; Bioorthogonal Kimya Kullanarak Öncesi hedeflemek için üç dişli Şelatlar Tc-etiketli

Özet

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate ^99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Özet

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing ^99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with ^99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the ^99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Giriş

^99m Tc dünya çapında yılda ^{1, 2, 3} başına yapılan 50 milyon görüntüleme işlemleri ile teşhis nükleer tıpta kullanılan baskın radyoizotop kalır. Klinik olarak kullanılan ^99m Tc ajanların çoğunluğu perfüzyon tipi radyofarmosötik. ^99mTc, bir hedef yapıya ligasyon aracılığıyla belirli bir biyomarker bağlamak için yönlendirildiği aktif hedef bileşiklerin sınırlı vardır. Hedeflenen ^99m Tc radyofarmasötik oluşturulması genellikle ilgi biyobelirteci bağlamak için hedef molekülün yeteneği ^99m Tc-ligand komplekslerinin etkisiyle tarafından engellendiği ya da izotoplar yarı ömrü daha yüksek molekül ağırlıklı biyomoleküllerin kullanım için yeterince uzun değildir antikorlar gibi. görüntüleri Tiss olmayan hedefinden temizlemek biyomolekülün için sırayla edinilen önce ikincisi genellikle birkaç gün gerektirir ues. Ön hedefleme bu zorlukların üstesinden gelmek için alternatif bir yaklaşım sunuyor.

Bioorthogonal kimya ile birlikte ön hedefleme hem floresan ve radyo-görüntüleme ^{4, 5, 6, 7, 8} yeni moleküler görüntüleme probları geliştirmek için etkili bir yol olduğu görülmüştür. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, 1,2,4,5-tetrazin (Tz) ve trans -cyclooctene (TCO) türevleri arasında ters elektron talebi Diels-Alder (IEDDA) Reaksiyon, ^6, özellikle etkili olduğu gösterilmiştir. Bu bileşenleri ile IEDDA reaksiyonu ve yüksek seçicilik, in vivo ön hedefleme uygulamalar ^{9, 10} için idealdir ₍₂ ≈ 6,000 M ^-1 s ^-1 k) PBS içinde hızlı kinetik sergileyebilirler.

e_content "> en sık kullanılan yaklaşım TCO türetilen hedefleme vektör uygulanması ve yeterli bir gecikme süresinden sonraki kapsar, bir radyo-etiketli tetrazin uygulanır. Radyoaktif tetrazinler olmuştur ¹¹ ° C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ Zr ve ¹¹¹ In dayalı ^{, 13, 12, 11, 14, 15} bildirilmiştir. Buna karşın, in vivo olarak proteine bozulmasını önlemek için ko-ligand kullanımını gerektiren HYNIC tipi ligand kullanılarak hazırlanmıştır Tz ^Tc-99m etiketli, tek yayın vardır ^16. bir alternatif olarak, ⁺ çekirdek _[3 ^99mTc (CO)], bir kararlı üç dişli kompleksleri oluşturan bağların bir ailesi kullanılarak tetrazinler etiketli burada ^99mTc (I) 'in sentezi açıklanmıştır.

Şekil 1: tetrazin ve trans -cyclooctene arasındaki bioorthogonal IEDDA reaksiyonu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Hazırlanan ligandlar ailesi polarite ve metal bağlanma bölgesi ve Tz (Şekil 2) arasında bağlayıcı grubun doğasına değişir üç dişli şelatları içerir. Amaç, yüksek hedef-to-hedef dışı oranları elde etmek amacıyla, Tc-tetrazin etkin bir şekilde lokalize ve TCO-etiketli in vivo siteleri ve bağlı değilken hızla net ile reaksiyona olabilir inşa eden ^99m belirlemektir. Ligandları test etmek için, bir bisfosfonat bir TCO-türevi (TCO-BP) ¹⁷ kullanılmıştır. Bu TCO-BP aktif kemik metabolizmasının bölgelerine lokalize ile reaksiyona girerek daha önce göstermiştirin vivo ¹⁸ radyo-etiketli tetrazinler. Bu tek bir aşamada hazırlanabilir ve deneyler lokalizasyon esas olarak eklem (diz ve omuz) meydana gelir, normal farelerde gerçekleştirilebilir, çünkü yeni bir tetrazinler test etmek için uygun bir reaktiftir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan çalışmaları Hayvan Bakımı Kanada Konseyi (ccac) kurallara uygun olarak McMaster Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

^99m Tc ile Tz-üç dişli Ligandlar 1. Radyo-etiketlenmesi

DİKKAT: Aşağıdaki prosedürler radyoaktif bileşikler kullanılmasını gerektirir. İş sadece güvenliği ve atılması düzenlemelerine bağlılık ile lisanslı laboratuarda yapılmalıdır. Mikrodalga reaksiyonları, özellikle, kimyasal sentez için tasarlanmış mikrodalga yapılmalıdır.

1. Sentezi ^[99mTc (CO) _{3 (H2O) 3]} ^{+ 19, 20}
   1. Bir mikrodalga şişeye olarak, kombine 8 mg K _{2 [BH3 CO2],} 15 mg Na ₂ CO _3, 20 mg Na ₂ B ₄ O ₇ · 10H _2, O, 25 mg KOCO [CH (OH)]₂ COONa · 4H ₂ O Boşaltma argon gazı ile 10 dakika boyunca bir tüpe konulmuştur.
   2. Şişeye% 0.9 tuzlu su içinde (~ 1.100 MBq, ~ 30 mCi) ^- toplam maliyet masrafı ₄ ^99m 4 ml.
   3. reaktiflerin bir karışım elde etmek karıştırma 10 saniye sonra, 110 ° C'de 3.5 dakika boyunca bir mikrodalga reaksiyon ısı.
   4. ~ 400 uL 1 M HCI kullanılarak 3.5-4 çözeltinin pH'ının ayarlanması. pH kağıdı kullanarak doğrulayın.
2. Tetrazin radyo-etiketlenmesi, 1-5 ligandları
   1. 250 uL, MeOH ²¹ her ligandın 2 mg (bileşikler 1-5) içinde çözülür.
   2. 250 uL ekleyin ^[99m Tc (CO) ₃ (H ₂ O) _3] ⁺ (~ 74 MBq ~ 2 mCi) her çözüm.
   3. 60 ° C'de 20 dakika boyunca bir mikrodalga kullanarak reaksiyon karışımı ısıtılır.
      Not: Bu adım, tüm 5 tetrazinler için aynıydı.
   4. Bileşikler 2-5 için, solvent ve yeniden dissol buharlaşması1 h / h, DCM: TFA 1 1 mL elde edilen ürünler ve.
   5. 6 dakika boyunca (2-4) ya da 10 dakika (5) için bir mikrodalga içinde 60 ° C sıcaklıkta çözülmüş, reaksiyon ürünleri (2-5) ısıtın.
   6. Oda sıcaklığına kadar soğutulduktan sonra, bir buharlaştırıcı kullanılarak çözücü (36 ° C, 8 mbar, 3 dakika, 6000 rpm) ve buharlaştınlarak 1 kurutulmuştur bileşiği çözmek: 1 ACN: _H2, O ya da 1: 1 MeOH: _H2O, HPLC ile arıtma öncesi.
   7. HPLC _(C18 ters fazlı) ile, etiketlenmemiş tetrazin ligand etiketli ürünün ayrılması dahil olmak üzere, ^{99mTc-etiketli} bileşikler (1-5), saflaştınlır. Tipik haliyle, 30:70 ACN gradyanı kullanılmaktadır: _H2O (her ikisi de% 0.1 TFA ile birlikte) 40:60 ACN: _H2O 20 dakika boyunca (18 dakika) ve bir _C18 analitik 4.6 x 100 mm kolonu üzerinde. UV (254 nm) ve gama algılama hem de kullanın.
      1. Her bir işaretlenmiş ürünün küçük bir örneği alın ve bir ko-inj edilene olan HPLC alıkoyma süresi karşılaştırınyansıtılmaktadır, radyoaktif olmayan, standart yeniden etiketli (% 20 0.125 mg _{metanol-H2O).} Yeniden etiketli standart bir UV HPLC izi tespit edilir ve γ-HPLC izleme ^{99mTc-etiketli} bileşik ile aynı zamanda Zehir. Bu ko-enjeksiyon bileşik Tc-etiketli ^99m kimliğini doğrulayan, karşılaştırılabilir tutma zamanlarda doruklarını gösterir.
   8. bir evaporatör (36 ° C, 8 mbar, 3 dakika, 6000 rpm) kullanılarak HPLC fraksiyonlardan çözücü buharlaşır.
   9. % 0.5 BSA ve% 0.01 Tween-80 ihtiva eden, 7,4 kBq / PBS uL konsantrasyonunda saflaştırılarak bileşik formüle.
   10. Etiketli bileşikler stabil olmasını sağlamak için, bir in vitro stabilitesi çalışma gerçekleştirin. stabilitesini değerlendirmek için, her zaman noktasında HPLC karışımın küçük bir miktar (3.7 MBq) enjekte, 1, 4 ve 6 saat boyunca 37 ° C 'de formüle edilen bileşiğin inkübe edin.

2. Ön hedefli Bio-dağıtım Çalışmaları

Hayvanların i> hazırlanması
1. 7-9 haftalık dişi Balb / c fareleri kullanılarak (n = 3), kuyruk ven enjeksiyon yoluyla TCO BP tuzlu su (20 mg / kg) (5 ug / ml) içinde formüle uygulanması.
2. fiziksel kısıtlama cihaz fare yerleştirin ve kuyruk yan yüzeylerinde bulunan damarları belirlemek ve alkollü bir bezle silin. kuyruk ucundan yaklaşık 2 cm, ven sığ bir açı paralel bir 30-gauge iğne takın. Yavaşça, enjekte iğneyi çıkarın ve kanama durana kadar hafif basınç ile enjeksiyon yerinde temiz gazlı bez sünger uygulamak için piston bastırın.
3. TCO-BP 1 saat sonra enjeksiyon da tatbik ~% 0.5 BSA, 100 uL içinde formüle ^{99mTc-tetrazin} 0.74 MBq (20 uCi),% 0.01 Tween-80, PBS içinde, kuyruk ven enjeksiyon yoluyla.
1. Biyo-dağılım çalışmaları
   1. İstenilen zaman noktasında (t = 6 saat),% 3 izofluran ve% 2 oksijen gaz karışımı kullanılarak Fareler uyuşturan. bir gösterinanestezi fare e tutam çekilme anestezi cerrahi düzlemine altında olduğundan emin olmak için.
   2. bir şırınga heparin ile ön-muamele ile kalp ponksiyonu ile kanı (1 mL) içinde toplayın. devam anestezi burun konisi burun sırtında yer fare ve hayvan üzerinde kılıç şeklinde sürecini bulun.
      1. 20 ° açıyla biraz kılıç şeklinde süreci kapsamında hayvanın orta hatta sol, 25 G iğne takın. Tam iğneyi ve yavaş yavaş kalp delinmiş eğer iğne hub kan görmek için piston geri çekin. Gerekirse kalbi delmek, dalgıç tutarken biraz iğneyi yeniden ayarlayın. Yavaş yavaş şırınga içine kan çizmek.
   3. anestezi altında iken, servikal dislokasyon ile hayvan Euthanize.
   4. Bir plastik torba içinde her hayvan koyun ve tüm vücut aktivite düzeyini ölçmek için bir doz kalibrasyon cihazı ^(99m Tc ayarı) kullanın.
   5. aşağıdaki doku ve sıvı toplama öncesi ağırlığındakan, kemik (diz ve omuz), safra kesesi, böbrekler, karaciğer, (içindekiler) ile mide, (içindekiler) ile ince bağırsak, kalın bağırsak ve (içeriği ile) caecum, tiroid ve trakea, idrar ile idrar kesesi: ed tüpleri sayma ve kuyruk.
   6. Uygun sayım tüpleri dokuları yerleştirmeden önce kan kaldırmak ve kuru leke PBS (kan, safra kesesi ve idrar kesesi hariç) uygun dokuları durulayın.
   7. plastik bir torbaya hayvan karkas yerleştirin ve bir doz kalibratörü ile artık tüm vücut aktivitesini ölçmek.
   8. Doku örneği içeren her tüp tartılır. Tüpün çıkarma başlangıç ​​ağırlık doku kütlesi elde edilmiştir.
   9. Her bir fare için enjeksiyon esnasında bir test numunesi (100 uL) etkinlik miktarını ölçmek için, bir doz kalibrasyon cihazı ^(99mTc ayarı) kullanın.
      Not: Bu test örneği, böylece enjeksiyon esnasında aktivite sayımı veren enjeksiyon hacmine eşittir.
   10. Doku ölçümü bir zamandadaha önce kullanılmış olan test örneğinin liquot 5 uL. Bir çok dedektörlü gama sayacı ^(99m Tc ayarı) kullanın ve 5 uL test örneği için dakika (CPM) başına sayımı elde etmek saymak.
   11. Bir dönüşüm faktörü (CPM uCi ^-1) elde etmek için denklem 1 kullanılarak aktivite ve CPM ilişkiyi hesaplamak için 2.2.9 ve 2.2.10 elde edilen iki değer kullanın.
       (1)
   12. Her bir doku veya sıvı örneğinde radyoaktivite miktarını ölçmek için gama sayacını kullanın.
   13. toplam enjekte edilen dozun ölçüm nisbetle zamanda her bir doku veya akışkan içinde etkinlik miktarını hesaplamak için Denklem 1 kullanın. Bu değer daha sonra, organ ağırlığı ile normalize ve doku gramı başına enjekte edilen doz yüzdesi (yani,% ID / g) olarak rapor edilir.
   14. Absen ^99m Tc-etiketli tetrazin ligandlar kullanılarak negatif kontrol deney yapmak için adımları 2.2.13'ün için 2.1.2 izleyinTCO-BP ce. Kurban fareleri (n = 3) ve 0.5, 1, 4 ve 6 saat sonra enjeksiyonda doku ya da yukarıda tarif edildiği gibi sıvı elde.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Ligandlar ticari olarak temin edilebilen tetrazin ^{22, 23,} ürünün bağlanması ve ardından basit bir indirgeyici aminasyon stratejisi (Şekil 2), üzerinden farklı bağlayıcılar ve kenetleyiciler kullanılarak sentezlenmiştir. Radyo-etiketlenmesi bütün bileşikler aynı yöntem kullanılarak gerçekleştirilir ve yüksek oranda çoğaltılabilir oldu. % 83 (1),% 45 (2),%...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Farklı kutuplar tetrazin-bağlı üç dişli şelatların koleksiyonu hazırlandı ve in vivo olarak bir TCO türevi ile IEDDA reaksiyonunda kendi ^99mTc komplekslerinin yardımcı değerlendirildi. Etkili ve tekrarlanabilir ^99mTc etiketleme yöntemi ligand konsantrasyonu etiketleme adım (Bileşikler 2-5), t-butil gruplarının korumasının kaldırılması izledi 10 ^-3 M, beş tetrazin-çelatları için geliştirilmiştir. Ligandın konsantrasyonu yü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argon gas	Alphagaz	---	---
Na2CO3	EMD Millipore	106395	---
Na2B4O7·10H2O	Anachemia	S9640	---
KNaC4H4O6·4H2O	Anachemia	217255	---
Technelite 99mTc generator	Lantheus medical imaging	---	Source of 99mTcO4-
0.9% Saline	Lantheus medical imaging	---	To elute generator
1 M HCl	Lab Chem	---	---
MeOH	Caledon	---	---
ACN	Caledon	---	HPLC grade
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	---
DCM	Caledon	---	---
TFA	Caledon	---	---
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1x
BSA	Sigma Aldrich	A7906	---
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	---
Isoflurane	CDMV	108737	Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)	---
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5	Waters	186003115	XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm x 100 mm
Microwave Reactor	Biotage	Initiator 8	---
Biotage V10 Evaporator	Biotage	Serial # V1041	---
Dose calibrator	Capintec, Inc.	CRC-25R	---
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard 1470 Automatic Gamma Counter	---
Animal room scale	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	---
Microwave vials	Biotage	355629	0.5-2 mL