Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Özet

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Özet

Yüksek verimli tarama (HTS) halen biyokimyasal reaksiyonları veya hücresel süreçleri modüle edebilen bileşiklerin kimyasal tanımlanması için dayanak noktası. biyoteknolojiler ilerlemesi ve küçük moleküllerin yüksek öteleme potansiyeli ile ilaç keşfi yenilikçi yaklaşımların bir dizi HTS kullanımında dirilen ilgi açıklıyor, gelişmiştir. onkoloji alan şu anda transplantasyon ilişkili komplikasyonlar ya da otoimmün hastalıkları hedefleyen yeni immünmodülatör bileşikler belirlenmesi için yapılan hiçbir büyük bir atılım ile ilaç taraması için en aktif araştırma alanıdır. Burada, nitro sıçangil floresans esasına dayalı bir lemfosit deneyinde yeni kolayca yeni bağışıklık bileşimlerin belirlenmesi için uyarlanmış sunuyoruz. Bu deney, Nur77 promotör T veya B-hücresi reseptör uyarılması üzerine GFP ekspresyonu sağlayan transgenik bir fare, elde edilen T veya B hücreleri kullanır. GFP yoğunluğu yansıtırhedef hücre aktivasyonu / transkripsiyon aktivitesi, bizim deney hücre / biyolojik yanıt verilen bileşik (ler) etkilerini incelemek için yeni bir araç tanımlar. Örneğin, bir birincil tarama bağışıklık aktivitelerini gösteren 160 potansiyel hit tanımlanmasına yol açan bir "hedef hipotezi" yokluğunda 4.398 bileşikler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu durumda, bu deneyde kullanılması, in vitro / in vivo doğrulama çalışmaları daha da önce geniş kimyasal kütüphanelerin keşfetmek ilaç keşfi programları için de uygundur.

Giriş

Yüksek verimli tarama (HTS) yaygın yeni tedavi moleküllerin tanımlanması için ya da yeni tıbbi endikasyonlarda FDA onaylı ilaçların yeniden konumlandırılması için kabul edilen kanıtlanmış bir stratejidir. ^1. Şu ana kadar elde edilen HTS başarısı, daha önce keşfedilen ilaçların bolluk ile ölçülebilir. Örneğin, bir tirosin kinaz inhibitörü, Lapatinib, göğüs kanseri, sitagliptin tedavisinde kullanılan; dipeptidil peptidaz-4 (DPP-4) inhibitörü, bir anti-hiperglisemik ilaç olarak kullanılır ve kronik miyeloid lösemi tedavisi için, oral Bcr-Abl tirozin kinaz önleyici dasatinib başlangıçta tarafından keşfedilen onaylanmış ilaçlar uzun bir liste birkaç örneği temsil eder HTS. İlaç endüstrisinin verimliliği son zamanlarda yeni kimyasal yapılar keşfi eksikliğinden muzdarip olmasına rağmen ^2, başarılı ilaç keşfi olasılığı klinik öncesi Candida sayısında bir artış ile geliştirilebilirdüzenleyici biyolojik / biyokimyasal özelliklerini gösteren tes. Buna göre, fenotipik tarama için uyarlanmış yeni HTS tahlillerin gelişimi yeni ilaç hit keşfi için önemli farmakolojik araçlar sağlamak için potansiyel sunabilir. ^{3, 4, 5, 6} Ayrıca, HTS şimdi nedeniyle özel tasarlanmış esnek robot tesisler, roman okuma-out teknolojileri ve kapsamlı minyatür dahil son yıllarda önemli teknolojik dönüşümlere daha hızlı bir tempoda yapılabilir. Fenotipik tarama (aka ileri farmakoloji) kullanımında artan ilgi katkıda faktörler arasında ^{2, 7} fonksiyonel etkileri ziyade moleküler hedeflerin (hedef tabanlı tarama / biyokimyasal reaksiyonların) ile ilgili basitleştirilmiş indirgemeci varsayımlara odaklanarak daha muhtemel olduğunu algı sho için w klinik etkinliği. Böylece, fenotipik tarama yeni potansiyel tedavi bileşikler ve şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların moleküler yollar ortaya çıkarmak için umut vaat ediyor. ²

Düzgün bir şekilde, belirli bir moleküler hedef ya da hücre fonksiyonu için inhibitörler ya da aktivatörler belirlemek için, son derece hassas ve güvenilir bir analiz niyetli lan ve yanlış pozitif arasında ayrım yapmak için gereklidir. Peki, iyi bir tahlil yapar? Belirli bir testin önce kalite (Z faktörü yansıtıldığı) sinyal-gürültü oranı ile değerlendirilmelidir. ⁸ İkinci olarak, hedeflenen etki veya ekranın hedefi açıkça belirlenmelidir. spesifik ligand-reseptör değerlendirmek için tasarlanmış bir tahlil karşı Örneğin, fonksiyonel hücre bazlı yaklaşımlar reseptör taranması için önemli avantajlar sunabilir. Bunun nedeni ikinci yaklaşım agonist ve antagonist ligandlar ayırt edemez olmasıdır.P = "xref" tersine> 9, hücre bazlı bir yaklaşım, reseptör fonksiyonu, biyolojik bir fenotip ile değerlendirilebilir daha etkili olması muhtemeldir (çoğalması, hücre döngüsünün durması, apoptoz ve / veya farklılaşma). Bununla birlikte, belli bir hücre içi hedef ihlal olarak biyokimyasal denemelerde, fenotipik testlere göre önemli avantajlar sağlayabilir belirtmek gerekir. Daha sonra eylem ilaç moleküler mekanizmasına ilişkin soruşturmalar basitleştirilmesi sırasında bir iyi optimize biyokimyasal tahlil genellikle fenotipik tarama daha az veri dağılım olacaktır. Bununla birlikte, hedef bazlı veya biyokimyasal deneylerin büyük dezavantajı, bir biyolojik sistem (orijinal biyokimyasal deneyde incelenmiştir özgüllük kaybı) test edildiğinde, spesifik olmayan hedeflerini etkileyen yanlış pozitif isabet oranı çoğaltabilen şanstır. ¹⁰ negatif ve pozitif isabet arasında köklü bir kesme noktası yanlış pozitiflerin sayısını en aza rağmen benn primer tarama gibi sağlam hücreler, tüm doku veya bütün hayvan gibi yerli hücresel ortamı taklit bir fizyolojik ilgili sisteminin kullanılması tahlil tasarımı sarkacın çekirdek kalır. Bu nedenle, fenotipik tarama bileşiğin etkinliğinin ya da etki mekanizmasına önceden bilgi sahibi olmadan tanımlanmış ilaç hedefleri ile hastalıklar için arzu / biyolojik fenotipik etkileri ile baş keşif sağlar. ¹¹

ticari olarak satılan fare modeli ve kimyasal bileşiklerin bir kümelenmiş alt ailesi: Burada çalışma iki önemli bileşenleri dayalı optimize edilmiş ve tekrarlanabilir fenotipik tarama geliştirme ve test ilgilidir. Hayvan modeli ile ilgili olarak, deney yeşil flüoresan protein (GFP) sentezleme th tarafından tahrik edilen, bir fare suşu (Nur77 ^GFP) bir kaset içeren bir bakteriyel suni kromozom barındıran türetilen lenfositlerin kullanımına dayanıre Nur77 promoteri. ^12, bu uyarım damgasını Nur77 T-hücre reseptörü (TCR) veya B-hücresi reseptörü (BCR) uyarımını takiben up-regüle hemen erken gen olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Tarama yöntemi kendisi de ^12, bir yaklaşım büyük kimyasal kütüphane (> 10 ⁵ bileşikler) değerlendirmek için gerekli olan zamanı en aza indirirken, önemsiz analoglarının tarama kaçınarak yardım etmek için kullanıldı. Bunu yapmak için, bir sanal eleme araçlarını kullanarak ilaç kimyacılar tarafından seçilmiş kimyasal bir bileşik veritabanı referans olarak bilinen aktif tohum yapıları kullanan topolojik içindeki bileşiklerin belirlenmesi için kullanılabilir edildi. Bu yaklaşım bize 136.000 üzerinde kimyasal varlıkların genel bir kütüphane temsil 4.398 bileşiklerin taranması için izin verdi.

Protokol

Tüm hayvan protokolleri Université de Montréal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Fareler Hayati işaretler, servikal dislokasyon gözlenene kadar, CO ₂ aşamalı inhalasyonu ile ötenazi yapıldı. Prosedür hayvanlar insani bir şekilde ötenazi ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi önerileri doğrultusunda emin olmak için bir sertifikalı kişi tarafından yürütülmüştür.

Splenocyte Orta ve Akış sitometri Buffer 1. Hazırlık

1. % 70 etanol-temizlenir biyolojik kaputun altındaki tüm adımları uygulayın.
2. önceden ısıtılmış Roswell Park Memorial Enstitüsü 70 mL (RPMI) steril bir tüp içinde (piyasada mevcut ve filtre 500 ml hacim steril şişelerde verilir) ve yer 1640 1x ortamı çıkarın. kaldırıldı orta protokolünde daha sonra kullanılacaktır.
3. 50 mi ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 5 ml penisilin / streptomisin, 5, RPMI kalan 430 ml 1.640 1x EkmL Hepes, 5 mi temel olmayan amino asitler, 5 ml sodyum piruvat, ve süzüldü 0.05 ml (1 M) 2-merkaptoetanol.
   NOT: Isı şok hücreleri önlemek için 37 ºC ayarlanmış bir su banyosu kullanılarak Pre-sıcak splenosit ortamı. Bu hücresel apoptoz indüksiyonu önlemek için önemlidir.
4. Akış sitometri tampon hazırlanması 98 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile FBS 2 ml ilave edilir ve kullanıma kadar (tercihen içinde üç gün) frigorifik tutmak.

Nur77 ^GFP fare dalak gelen Splenocyte Hücre Süspansiyon 2. Nesil

1. Bir septically 6-8 haftalık dişi Nur77 ^GFP fare dalak izole eder.
   1. Bunu başarmak için, steril kaputun altında çalışırlar. % 70 etanol kurban fare kürk, makas ve forseps bekletin.
   2. Onun sağ tarafında fare Lay sol üst kadranda cilt ve kasları kesti. gözle görülür daha sonra dalak bulun onu kesip kesi alanını kontrol edin. dalak tutmakhazır olana kadar buz üzerinde splenosit ortamında bir sonraki adımı gerçekleştirmek için.
2. Önceden ısıtılmış splenosit ortam 5 ml ihtiva eden bir 10 ^cm2 hücre kültürü Petri kabındaki dalak (ler) yerleştirin.
3. çözüm bulanık olana kadar steril bir şırınga pistonu kullanarak dalak püre. Bir dalak kollajen matriks prosedürü sonuna kadar kalmalıdır.
4. splenosit ortamında geniş ezme ardından, hücre süspansiyonu toplamak ve filtre-out herhangi bir enkaz veya pıhtı 50 ml tüp yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden geçirin.
5. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. yüzen sıvısı atıldıktan sonra, in-house üretilen veya ticari kırmızı kan hücresi lizis tamponu 2-3 mL hücre pelet yeniden askıya. Aşağıdaki pipet (2-3 kez) 20-30 s için süspansiyon dinlendirin.
6. g ve x 500, 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj 5 ml PBS ya da seçim uygun bir tampon ekleme.
7. kırmızı renkte olmalıdır (Süpernatantı kırmızı b lize içerir olarakLood hücreleri) ve yeniden askıya splenosit ortamının 2 ml hücre pelletini.
8. hemasitometre kullanarak, canlı ve ölü (nekrotik) hücreleri ayırt tripan mavisi ile boyanmış hücrelerin sayısını.

Splenocyte Celi Süspansiyon 3. T-hücresi izolasyon

1. x g 500 ° C'de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. 10 x 10 ⁶ hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için, serum içermeyen RPMI ortamında hücreleri (adım 1.3 50 mi) yeniden askıya.
2. 5 ml polistiren tüp hücreleri transferi ve arıtma basamağının sonunda kenara saflık değerlendirmesi / karşılaştırma için dalak 100 uL alikot olarak ayarlayın.
3. T hücresi izolasyon antikor kokteyli (50 uL / ​​mL) ile 50 ul / ml hücre süspansiyonuna normal sıçan serumu ekleyin.
4. hücre süspansiyonu karıştırın ve 10 dakika bekletin. Bu adım, antikor kokteyli tüm istenmeyen hücreler bağlamak sağlar.
5. streptavidin hızlı küreleri ekleyin (mıknatıs2.5 dakika için IC boncuklar), daha sonra, serum içermeyen ortam kullanılarak, 2.5 mL hacmi getir.
6. 3 dakika için bir hücre izolasyon mıknatıs tüp yerleştirin.
7. mıknatıs tutan ve tek bir hareketle çözüm dökerek yeni bir polistiren tüp içine T hücresi süspansiyonu aktarın.
   NOT: İzole süspansiyon saflaştırılmış T hücrelerini içerir. Tüm istenmeyen hücreler manyetik streptavidin boncuk bağlı tüp tarafında yapılır.
8. Tripan mavisi ve hemasitometre kullanarak izole edilmiş T hücreleri saymak.
   NOT: Bu adımda izole edilmiş T hücrelerinin saflığı önce ve akış sitometrisi ile, T hücresi izolasyon sonra CD3 ⁺ etkinlikleri yüzde analizi ile (isteğe bağlı) kontrol edilebilir. ¹³
   1. Kısaca, santrifüj 500 x g'de splenosit hücre süspansiyonu 1 mi. Süpernatantı atın ve 1 x 10 ⁶ hücre / ml konsantrasyonda akım sitometri tampon hücreleri askıya.
   2. Floresan etiketli anti-Mous ekleme1: 100 arasında bir konsantrasyonda e CD3 antikoru. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. bir kez yıkayın, santrifüj ve akış-sitometri ile analiz için akım sitometri tamponu (400 uL) içinde yeniden askıya.

Splenocyte Hücre Süspansiyon 4. B-hücresi İzolasyon

1. T hücreleri (3.1-3.8 adım), fakat bir B-hücresi izolasyon kiti kullanılarak için anlatılan ile aynı protokol takip edin. Saflık değerlendirmesi için, bunun yerine CD3 antikoru CD 19 antikoru kullanımı. ¹³
   1. (Isteğe bağlı) saflık değerlendirmesi için, CD3 antikoru yerine CD 19 antikoru kullanımı. 500 x g splenosit hücre süspansiyonu santrifüj 1 ml. Süpernatantı atın ve 1 x 10 ⁶ hücre / ml konsantrasyonda akım sitometri tampon hücreleri askıya.
   2. Ekleme flüoresan 1 bir konsantrasyonda anti-fare CD 19 antikoru etiketlenmiş: 100 ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. bir kez yıkayın, santrifüj ve akış sitometri tamponu (400 uL) fo yeniden askıyaakış sitometri ile r analizi.

5. T-hücresi aktivasyonu ve GFP ifade indüksiyon

1. / Oyuk 2.5 x 10 ⁵ hücre konsantrasyonunda yuvarlak dipli 96 oyuklu bir plakaya, süspansiyon içinde, T hücrelerinin tohumu.
2. 2 ng / ml ve CD3 / CD28 manyetik boncuk (25 uL / 10 ⁶ hücre) rekombinant interlökin (IL) -7 ekleyin. aktif olmayan T hücrelerinin temsil sonraki ölçümler için bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere boncuklar ile muamele edilmemiş T hücrelerinin bir kısmı tutun.
3. Oniki saat sonra, yavaşça her hücre süspansiyonu pipetle de yukarı ve aşağı bir kordon hücresi kompleks / agrega kırmak için 96 oyuklu plaka T hücreleri hasat edilir. 5 ml polistiren tüp içine tüm kuyulardan süspansiyon toplayın.
4. T ve B hücrelerinin saflaştırılması için daha önce kullanılan aynı hücre izolasyon mıknatıs içindeki süspansiyonu içeren Tüp, ve 5 dakika boyunca dinlenmeye bırakın.
5. T hücre süspansiyonu int aktarınmıknatıs tutan ve tek bir hareketle çözüm dökerek oa yeni polistiren tüp.
6. 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri Santrifüj. Yeniden askıya 2 x 10 ⁶ hücre / mL'lik bir konsantrasyonu elde etmek için, taze splenosit ortam içinde hücreler.
7. olmayan aktive edilmiş T hücreleri ile karşılaştırıldığında 12 ile 24 saat sonra uyarımları (kalite kontrolü için opsiyonel) akış sitometrisi ile GFP yoğunluğunu değerlendirmek. ¹²
   NOT: GFP floresan Nur77 ^GFP T hücrelerine içsel ve TCR başarılı etkinleştirilmesi üzerine kendini gösteriyor. ¹²
8. mikroskopi ile canlılığı ve aktivasyonu (isteğe bağlı) değerlendirilmesi için, 0.2 ng / ml 'lik bir konsantrasyonda, 30 dakika Hoechst analizden önce aktive hücreleri leke. bir kapak sürgüsü veya bir düz-tabanlı siyah yüzlü 384 oyuklu plaka iyi hücre süspansiyonu yeterli hacim ekleyin ve canlı hücreleri değerlendirmek için floresan mikroskobu altında incelenmişlerdir. Ölü hücreler nükleer tutmazboyama. ¹⁴

6. B hücresi aktivasyonu ve GFP ifade indüksiyon

1. Bir T-25 kültür şişelerinde kullanılarak, 1 x 10 ⁶ hücre / mL B hücre proliferasyonu yeniden askıya.
2. 200 ng / ml bir konsantrasyonda 10 ul / ml anti-fare IgG / IgM (H + L) ve yeniden birleştirici CD40L ekleyin. (Aktif olmayan B hücreleri temsil eden), daha sonra ölçümler için bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere muamele edilmemiş B hücrelerinin bir kısmını muhafaza edin.
3. aktif olmayan B hücreleri ile karşılaştırıldığında, 12 veya 24 saat sonra stimülasyon akış-sitometrisi ile GFP yoğunluğunu değerlendirmek.
   NOT: GFP floresan Nur77 ^GFP B hücrelerine içsel ve BCR başarılı etkinleştirilmesi üzerine kendini gösteriyor. ¹²
4. mikroskopi ile canlılığı ve aktivasyonu (isteğe bağlı) değerlendirilmesi için, 0.2 mg / ml bir konsantrasyonda Hoechst 30 dakika, analizden önce aktive hücreleri leke. hücre süspansiyonu yeterli hacmi ekleyinflöresanlı bir mikroskop altında bir kapak sürgü veya düz tabanlı siyah yüzlü 384 oyuklu plaka iyi ve incelemek canlı hücreleri değerlendirmek. Ölü hücreler nükleer boyanma tutmaz. ¹⁴

Küçük moleküllerin 7. yüksek veri akışı tarama

1. 2 x 10 ⁶ hücre / aktive edilmiş T ve B hücrelerinin ml (manyetik boncuk veya antikorlar / CD40L) ya da aktif olmayan gruplar bir hücre süspansiyonu hazırlanır.
2. Levha 75,000 hücre / kuyu bir 384-oyuklu plaka (40 uL hacmi). Düz dipli siyah-taraflı 384-plaka veya Hoechst leke kullanarak floresan mikroskobu (önceki HTS isteğe bağlı kalite kontrol adımı) tarafından canlılığı ve aktivasyon değerlendirmesi için bir mikroskop kapak slayt kullanın (adım 5.8 ve detaylar için 6.4 bakınız). ¹⁴
3. Elle ya da otomatik bir sistem kullanarak, her oyuğa (% 0.5 DMSO içinde çözülmüş) tercih edilen ilaçlar ekleyin.
4. (Aktif) pozitif ve negatif (dışı Acti araç (DMSO) ilaveçıkartılmış) kontrol kuyuları. % 0.5'lik bir maksimum DMSO konsantrasyonu ayarlayın.
5. 24 saat (ya da kuluçka tercih saat) 37 ° C 'de ve% 5 _CO2 için inkübe edin.
6. (. 1: 3,333; örneğin, 50 uL bir toplam hacmi üretmek için 384-delikli plakalardaki hücreler 10 mcL) tarama gününde, Hoechst 33342 boyası seyreltilir. 0.2 ug / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için Hoechst çözeltisinin eklenmesiyle GFP analizden önce 30 dakika leke.
7. Yavaşça iyi her bir homojen dağılımını elde etmek için yukarı ve aşağı hücreleri pipetle.
   Not: Bu adım, hücrelerin ters akış yönüne iyi bir tarafında birikme eğilimi gibi bir otomatik sistem kullanılarak ilaçlar (aşama 7.3) tevzi durumunda önemlidir.
8. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 45 xg'de plakaları dönerler.
9. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca geri kalanına plakaları bırakın.
10. Otomatik konfokal içeriği yüksek scre kullanarak, plaka (lar) okuma-çıkışları gerçekleştirinakşamlar (HCS) sistemi. ¹⁵ makineye plaka yükleyin. 40X veya daha yüksek büyütmede hedef olarak belirlemiştir. Hoechst (UV lamba) ve GFP için kamera # 1 (lazer 488) için kamera 4. kullanın. kuyu başına 6-10 alanları okumak için makineyi ayarlamak. 488 nm (GFP okumak için) ve UV ışık (Hoechst okumak için) sahada başına iki ardışık okuma yapmak için makineyi ayarlayın. 40X veya daha yüksek büyütmede hedef olarak belirlemiştir.
    NOT: Sistem herhangi bir ayarlama gerektirmez bilgisayarlı mikroskop olduğunu. odak mesafesi, gelen ışığın yoğunluğu ve maruziyet süresi makine tarafından otomatik olarak tüm kurulum bulunmaktadır.

Sonuçlar

HTS analizi tasarımı

Burada floresan tahlil tasarlarken iki önemli faktör dikkate alınmıştır. İlk olarak, T veya B hücre aktivasyonu bir hastalık (örneğin graft-versus-host hastalığı) temsil eder fizyolojik bir durumun çoğaltmak için gereken. İkinci olarak, hücre aktivasyonunun değerlendirilmesi duyarlı ve nicel bir yöntem kullanılarak yapılmalıdır. bu ihtiyaçlara karşılık olarak floresan ...

Tartışmalar

Çeşitli okuma-out yöntemleri hassas ve güvenilir HTS testlerin geliştirilmesi için istismar edilmiştir. Bu kolorimetrik, Işıklı veya floresan yöntemleri içerir. Kolorimetrik yöntemler kurulumu kolay olmakla birlikte, bu müdahale ya da hücre, test edilen bölebilir kimyasal birden eklenen gerektirir. Farmakolojik etkisi, belirli bir uç değerlendirilir olarak ²³ ek olarak, biyolojik bir yanıt dinamik değerlendirilmesine imkan yoktur. otomatik HTS kullanılırsa Ayrıca, bu yönte...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nur77GFP mice	The Jackson Laboratory	Mouse strain No. 016617	An in house colony was established at our animal facility
96 wells-U culture plates, sterile	VWR International	10062-902	T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterile	Corning Inc.	352350	Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile	Corning Inc.	352058	Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile	VWR International	89039-656	Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile	Becton, Dickinson and Company	305482	To mash the spleen
T-25 culture flask	Greiner Bio-One	690 175	To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile	Greiner Bio-One	627 160	To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)	WISENT Inc.	450-200-EL	Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine	WISENT Inc.	350-002-CL	Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids	WISENT Inc.	321-010-EL	Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)	WISENT Inc.	080-910	Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023	Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kit	Stemcell Technologies	19851	To isolate T cells
B-Cells isolation kit	Stemcell Technologies	19854	To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads	Thermo Fisher Scientific	11452D	To activate T cells
Cell isolation magnet	Stemcell Technologies	18000	To isolate T cells and remove the magnetic beads
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.	115-006-068	To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17	To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L	R&D Systems	8230-CL/CF	To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody	BD Pharmingen	561799	To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody	BD Pharmingen	553786	To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXp	PerkinElmer Inc.	A31842	To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening System	PerkinElmer Inc.	HH14000000	To analyze GFP/Hoechst signal