Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Özet

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Özet

Kıkırdak mühendislik, doğal dokusuna benzer bir in vitro fonksiyonel implant oluşturmada zorluklar nedeniyle bir sorun olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda otolog değiştirmeler geliştirilmesi için araştırdı bir yaklaşım kondrositlere kök hücrelerin farklılaşmasını içerir. Bu kondorjenez gereklidir kök hücre sıkıştırılması derecesi başlatmak için; Bu yüzden, hücre çekicilerin olarak minyatür bir manyetik alan kaynakları kullanılarak, kalın yapı iskeleleri ve iskele içermeyen içinde hem de manyetik olarak yoğunlaştırma hücrelerin uygulanabileceğini göstermiştir. Bu durum, manyetik yaklaşım, aynı zamanda, toplam füzyon kılavuz ve skafold içermeyen, organize oluşturmak için kullanılan, üç boyutlu (3D) boyut olarak birkaç milimetre dokular. gelişmiş bir boyuta sahip ek olarak, manyetik tahrikli füzyonuyla oluşturulan doku kolajen II ekspresyonunda önemli bir artış mevcuttur, ve benzer bir gelişme agrekan ifadesi için gözlemlendi. doğal kıkırdak kuvvetleri t tabi tutuldu olarakşapka onun 3D yapısını etkilemiş, dinamik olgunlaşma da yapıldı. mekanik uyaran sağlayan bir biyo-reaktör, 21 günlük bir süre boyunca kültüre manyetik ekildi iskeleleri kullanılmıştır. Biyoreaktör olgunlaşma ölçüde cellularized iskele içine kondrojenezi geliştirilmiş; Bu koşullar altında elde edilen hücre dışı matris, kolajen II ve agrekan zengin oldu. Bu çalışma, geliştirilmiş kondrojenik farklılaşması, her iki iskele içermeyen ve polisakarid iskeleleri için bir biyo-reaktör içinde etiketlenmiş kök hücrelerin manyetik yoğunlaştırılması ve dinamik olgunlaşma yenilikçi potansiyel özetlenmektedir.

Giriş

Manyetik nanopartiküller zaten manyetik rezonans görüntüleme (MRI) için kontrast ajanları olarak klinikte kullanılmaktadır ve bunların tedavi edici uygulamalar genişleyen tutun. Örneğin, son zamanlarda etiketli hücreler ^{implantasyonu, 1, 2, 3} ve belirlenen bir alanda bir dış manyetik alan kullanılarak in vivo olarak manipüle edilebilir ve yönlendirilebilir ve / veya muhafaza gösterilmiştir. Rejeneratif tıpta, vasküler dokuda ^{5, 6, 7,} kemik ⁸ ve kıkırdak ⁹ içeren in vitro ⁴ organize dokular, mühendislikten geçirilmesi için de kullanılabilir.

Eklem kıkırdağı zarar meydana geldiğinde çok sınırlı bir hücre dışı matris bileşenlerinin tamiratlar, avasküler bir ortamda batırılır. Bu nedenle, Araştırma, Forh anda anzasının bulunduğu yere implante edilebilir hyalin kıkırdak değiştirmeleri mühendisliği odaklanmıştır. Diğer kondrosit ^{12, 13} içine ayırt etmek mezenkimal kök hücreler (MSC) kapasitesini vurgulamak sırasında bir otolog değiştirme üretmek için, bir araştırma grupları, bir hücre kaynağı ^{10, 11} otolog kondrositlerin kullanılmasını araştırmaktadır. Onların kemik iliği örneklemesi oldukça basittir ve bunların fenotipi ¹⁴ kaybetme riski sağlıklı kondrosit kurbanını gerektirmez burada değinmeyecek önceki çalışmalarda, biz, MSC seçildi.

Kök hücrelerin kondrojenik farklılaşma başlatılması için gerekli erken adım onların yoğunlaşma olduğunu. Hücre kümeleri genellikle santrifüj veya mikrokütle kültürü ¹⁵ kullanılarak oluşturulur; Bununla birlikte, bu yoğunlaştırma yöntemleri neither kalın iskeleler de agrega füzyon kontrol etmek için potansiyeli olan, hücre kümeleri oluşturmak için potansiyel göstermektedir. Bu makalede, MSC manyetik etiketleme ve manyetik cazibe kullanarak kök hücrelerin yoğuşmalı için yenilikçi bir yaklaşım açıklar. Bu teknik, bir milimetre çaplı kıkırdak doku ⁹ elde etmek üzere bir diğeri ile agrega füzyon yoluyla iskele-3D yapıları oluşturmak üzere kanıtlanmıştır. kalın ve büyük yapı iskeleleri manyetik tohumlama da işlenmiş doku boyutunu artırmak implantasyon için daha kolay bir şekilde faydalı olan bir şekil tasarımı ve kıkırdak tamir klinik uygulamalar için potansiyel çeşitlendirilmesi olasılığını sağlamıştır. Burada, doğal polisakaritler, pullulan ve dekstran oluşan gözenekli yapı iskeleleri içine MSC manyetik tohumlama için ayrıntılarıyla protokolü, iskeleler, daha önce kök hücreleri ^{16, 17} sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Kondrojenik farklılaşma finall olduy hücrelerin yüksek yoğunluğa sahip tohumlanmış iskelesinin matris çekirdek içine sürekli besin ve gaz yayılmasını sağlamak için bir biyo-reaktörde gerçekleştirilmiştir. hücrelere besin, kondrojenik büyüme faktörleri ve gaz sağlamanın yanı sıra, biyoreaktör mekanik stimülasyonu sundu. Genel olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma ile birlikte kök hücreleri sınırlandırmak için kullanılan manyetik teknolojisi, belirgin kondrojenik farklılaşma artırabilir.

Protokol

Manyetik Cihazların 1. İnşaat

Not: Hücre ekimi için kullanılan cihazlar, uygulamaya bağlı olarak değişir (Şekil 1). Manyetik uçları (çapı 750 mm), çok ince olmalıdır, böylece agrega oluşturmak için, hücrelerin sayısı, 2.5 x 10 ⁵ / agrega ile sınırlıdır. 1.8 cm ^2/7 mm kalınlığında iskeleleri tohum için, mıknatısların daha büyük (Çapı 3 mm) olması gerekir ve skafold gözeneklerinin içinden hücre göçünü sağlayacaktır.

1. Agregat oluşumu için mikro-mıknatıs olan bir cihaz yapımı (Şekil 1A)
   1. alüminyum plakalar içinden bir 0.8 mm matkap ile mikro-delikleri (3 cm çapında ve 6 mm kalınlığında) konur.
   2. plakanın her deliğe, bir manyetik uç (çapı 750 mm) yerleştirin.
   3. doygunluk manyetizasyonu sağlayan kalıcı bir neodim mıknatıs, üzerinde bu disketi yerleştirin.
2. iskele tohumlama için bir cihazın İnşaat ( Şekil 1 B)
   1. 2.4 ^cm2 kareler halinde sert polistiren kesin.
   2. 1.6 ^cm2 'lik bir yüzey alanı üzerinde eşit mesafede 9, küçük mıknatıslar (çap 3 mm uzunluğunda ve 6 mm) _takın.
   3. Kalıcı neodim mıknatıs üzerinde bu cihazı yerleştirin.

2. Kök Hücre Etiketleme

NOT: 30 dakika (5 ± 0.4 pg demir / hücre) tohum için 0.2 mM manyetik nano partiküller ile etiketlenmiştir Kök hücreleri, 30 dakika boyunca (2.6 ± 0.2 pg demir / hücre) agregatlar oluşturması için 0.1 mM manyetik nano partiküller ile etiketlenmiştir iskeleleri. Bu nanoparçacık konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri, daha önce kullanılmış, MSC ve diğer hücreler ^{18, 19} için yayınlanan ve nanopartiküller ne hücre canlılığı veya MSC farklılaşma kapasitesi etkilenmiş olduğu tespit edilmiştir edilmiştir. kök hücre ile bu buluşa katılan demir kütlesi tek ce ile ölçüldüII magnetophoresis ^{19, 20.}

1. Civarındaki kadar 37 ° C'de ve% 5 _CO2 seviyesinde tam mezenkimal kök hücre büyüme ortamı (MSCGM) Kültür mezenkimal kök hücreler (MSC) (~% 90) birbirine kaynaşma seviyesine kadar.
2. Glutaminsiz Roswell Park Memorial Institute (Kan numuneleri) modifiye edilmiş serumsuz McCoy'un 5A ortamında ve 5 ihtiva eden: 0.1 ya da 0.2 mM maghemit sitrat-kaplı demir oksit (8 nm çapında ana γFe ₂ O ₃₎ karıştırılması ile, manyetik işaretleme çözeltisi hazırlayın mM sodyum sitrat.
3. , Orta atın glutamin içermeyen serumsuz RPMI ortamı ile hücrelerin durulama ve 150 ^cm2'lik kültür şişesi, tüm hücreleri karşılamak için gerekli olan minimum hacim başına demir oksit nanopartiküllerinin çözeltisi 10 ml.
4. 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 _CO2 inkübe edin ve daha sonra nanoparçacık solüsyonu atın. nan içselleştirme glutamin içermeyen serumsuz RPMI ortamı 5 dakika boyunca durulamaoparticles hala plazma membranına bağlı.
5. RPMI ortamı atılır ve kap başına tam MSCGM ortamı 25 ml. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir ve% 5 _CO2.

3. Manyetik Hücre Ekme

1. Taze 50 uM L-askorbik asit 2-fosfat, 0.1 uM deksametazon, 1 mM sodyum piruvat, 0.35 mM L-prolin,% 1 evrensel kültürü eklenerek Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), L-glutamin ile, yüksek glukoz kullanılarak kondrojenik ortamı hazırlamak insülin, insan transferrin ve selenik asit (ITS-karışımlar) ve 10 ng / ml, transforme edici büyüme faktörü-beta 3 (TGF-β3) içeren ek.
2. 5 dakika boyunca 260 x g'de% 0.05 150 ^cm2'lik kültür şişesi başına tripsin-EDTA ve santrifüj ayrışmış hücreleri 8 mL kullanılarak manyetik hücre ayırın. orta aspire ve yeniden süspansiyon haline hücreleri sayın.
3. Her iki manyetik cihazların üstünde bir cam tabanlı hücre kültürü Petri kabı (35 mm) yerleştirin.
4. magnetically agrega başı (yatırılabilir 16 agrega kadar) 2.5 x 10 ⁵ etiketli hücreler ihtiva eden mümkün olan en küçük bir hacmi (en fazla 8 uL) yatırma yavaşça Petri kabı kondrojenik orta 3 mL ekleyin ve agregatlar oluştururlar. Bu sferoidler oluşmasına izin vererek, taşımadan 20-30 dakika süreyle Petri kabı bırakın ve daha sonra 37 ° C'de ve% 5 _CO2 inkübatörü içinde, 16 agrega içeren Petri kabı da dahil olmak üzere, komple bir cihaz yerleştirin.
5. Form kontrolü agrega aynı protokolü takip ve TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamla tam orta yerine.
   1. 3D toplam yapı üretmek 8 çiftleri oluştururlar ve füzyon başlatmak için günde 8 temas eden 2 agrega yerleştirin. Gün 11, 4 dördüz oluşturmak üzere 2 çift durumlar birleştirme. Son olarak, nihai bir yapı elde etmek günde 15 4 dördüz kaynaştırmak.
   2. Aynı zamanda, x 10 ⁵ 2.5 santrifüjleme ile bir araya toplanırlar 260 ° kök hücreleri etiketli15; ya da TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamın 1.5 mL, 15 ml tüpler içinde 5 dakika boyunca gr (numune ve kontrol için, sırasıyla).
6. Tohum iskeleleri manyetik olarak için, bir Petri kutusu içine her kurutuldu iskele yerleştirin. Pullulan / dekstran ²¹ yapılmış polisakarit gözenekli iskeleleri kullanın. Her bir yapı iskelesi için, TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamın 350 uL 2 x 10 ⁶ etiketli kök hücreleri sulandırmak ve dikkatli bir şekilde bir yapı iskeleti içine hücreleri pipetle.
   1. iskele içinde tam hücre penetrasyonu imkan vermek için 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra yavaşça veya Petri kabı (sırasıyla numune ya da kontrol için,), TGF-p3 olmadan kondrojenik orta 3 ml.
   2. Iskele gözenekler ve sınırlandırılması yolu ile hücre göçü için izin vermek üzere _{2 ila} 4 gün boyunca CO, 37 ° C'de, manyetik cihazda cellularized iskele inkübe ve% 5.
7. Aynı zamanda, özellıklerı tohum 2 x 10 ⁶ Yukarı etiketli kök hücreler aynı yöntemi izleyerek ve pozitif kontroller olarak eşit seri başı iskeleleri elde etmek mıknatıs olmadan inkübe edin.

Kondrositlere 4. Farklılaşma

NOT: 4 günlük kuluçkadan sonra, mıknatıslar kaldırıp kondrojenik olgunlaşmasını ya bir Petri kabı (statik koşullar) veya bir biyoreaktör (dinamik koşullar) içinde devam ediyor. Negatif kontrol numuneleri TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamla statik koşullarda olgunlaştırılır.

1. Statik koşullarda, aynı Petri kabındaki cellularized iskele veya agrega tutun. 21 gün boyunca haftada iki kez kondrojenik orta değiştirin.
2. Dinamik koşullarda, biyoreaktör hazırlayın.
   1. üreticinin protokolüne uygun olarak uygun uzunlukta silikon tüp kesin.
   2. 500 ml'lik kültür odası, boru, 2-yollu rotatorlar ve kafesler: tüm malzemeleri otoklava.
   3. steril microbio içine biyoreaktör parçaları yerleştirinMantıksal güvenlik istasyonu. Üreticinin talimatlarını takip 2 yönlü rotatörlerde ve kültür odasına boru bağlayın.
   4. Dikkatle steril bir spatula kullanılarak sterilize kafeslerin içine cellularized iskele aktarın. kafes başına 2 iskeleleri yerleştirin. kafesleri hazır olduğunda, daha fazla rotasyon sırasında hareket onları tutmak için kapağın iğne içine yerleştirin. kondrojenik ortam ile kültür odası doldurun ve kafesleri içeren kapak ile kapatın.
3. kondrojenik ortamla boru doldurmak için ve hava kabarcıklarını yok etmek için peristaltik pompa açın.
4. Yerleştirin ve biyoreaktör motora doldurulur odasını güvenceye ve kolun ve odanın her iki rotasyonları kontrol eden bilgisayar, açın.
5. kol ve bölme her iki dakika başına 5 dönüş (rpm) bir dönme hızı uygulanır. cellularized iskelelerinin sürekli beslenmesi için 10 rpm'de bir akış hızında peristaltik pompa ayarlayın.

5. RNA Ekstraksiyonu ve gen ekspresyonu analizi

Not: RNA ekstraksiyonu önce, bir enzimatik solüsyon ile iskeleleri sindirimi.

1. pululanaz, 100 uL (40 U / mL) ve serum içermeyen DMEM ortamı 850 mL dekstranaz 50 uL (60 mg / ml) eklenerek enzimatik solüsyon 1 mL hazırlayın.
2. Serum içermeyen DMEM ortamı ile iki kez iskeleleri durulayın orta atmak ve iskele başına enzimatik çözeltisinin 800 uL ekleyin. , hafifçe çalkalanarak 37 ° C'de 15-30 dakika süreyle inkübe edilir.
3. iskele tamamen çözülür, dikkatli bir şekilde orta aspire, 10 dakika boyunca 300 x g 'de bir 1,5-ml tüp hücreleri ihtiva eden çözelti, santrifüj transferi x 1 steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS), santrifüj ile iki kez durulama 300 x g'de 10 dakika ve RNA izolasyon çözeltisi içinde hücreler yeniden askıya.
4. , Agrega RNA çıkarmak RNA izolasyonu çözeltisi içinde sferoidler yerleştirmek için veTamamen RNA ekstraksiyonu yapılmadan önce bir homojenleştirici kullanarak ezmek.
5. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, toplam RNA ekstraksiyonu için bir kit kullanılarak RNA izole edilir.
6. DNTP karışımı 1 uL (10 mM), 40 U / ml RNaz inhibitör rastgele primerler 250 ng kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkriptaz kullanılarak toplam RNA 400 ng tamamlayıcı DNA sentez; reaksiyonun nihai hacmi, 20 uL'dir. Reaksiyonun sonunda, 100 uL nihai hacim elde etmek üzere damıtılmış su 80 uL ekleyin.
7. kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için, 10 x seyreltildi cDNA ile, örneğin agrekan (AGC) ve kolajen II'ye (Col II) ilgi konusu genlerin, göreceli ifade miktarını belirlemek için bir floresan madde içeren bir PCR karışımı kullanılır. referans gen ribozomal protein, büyük, P0 (RPLP0) ile gen ekspresyonunun seviyelerini normalize. ^AACT formülü ^- 2 ile hesaplamalar gerçekleştirin, AACT = ACt farklı durumun burada - Kontrol koşulu ACt anlamına gelir ve her bir ACt ilgi konusu genin, CT temsil eder - referans gen (RPLP0) arasında CT.
8. ortalama değerler ortalama (SEM) ± standart hata olarak istatistiksel ölçümleri belirler. n ≥ 2 bağımsız deneylerle analizi gerçekleştirin. santrifüj edilmiş peletler ve manyetik füzyonları (* p <0.05) arasında istatistiki farklılıklarını analiz etmek için, Student t-testi kullanın. Kontrol skafold farklı yapı iskeleleri arasında istatistiksel farklılıkları (* p <0.05) analiz etmek için bir Kruskal-Wallis testi (tek yönlü ANOVA parametrik olmayan) ile önem belirler.

6. Histolojik Analiz

1. Steril 1 x PBS ile cellularized iskeleleri veya agregaların durulayın, oda sıcaklığında 1 saat için% 10 formalin çözeltisi içinde çözmek ve 1 x PBS ile yıkayın.
2. , PBS çıkarın optimum kesmeye örnekleri gömmekg sıcaklık bileşiği (OCT), ve sıvı azot içine daldırılmış bir izopentan küveti içinde dondurulur. -20 ° C'de örnek saklayın. agregatlar veya cellularized İskele 12 um 8 mikron cryosections elde etmek için bir kriyostat ile örnekleri kesilir.
3. tolüen kullanılarak açıklık,% 100 etanol ile dehidre musluk suyu ile durulayın, 2 dakika süre ile% 0.5 toluidin mavisi çözeltisi ile cryosections Leke ve ışık mikroskopi için bir montaj ortamı ile montaj slaydları.

Sonuçlar

İlk olarak, gruplar ayrı ayrı 2.5 x 10 ⁵ etiketli kök hücreleri (Şekil 2A) biriktirilmesiyle mikro mıknatıslar kullanılarak oluşturulabilir. Bu tek agregalar (girişlerinin boyu yaklaşık olarak 0.8 mm), daha sonra ardışık manyetik indüklenen füzyon daha büyük yapılar sayesinde içine birleştirilebilir. Örneğin, kondrojenik olgunlaşma 8. günde, agrega çiftleri oluşturmak üzere çiftler halinde temas halinde yerleştirilmiştir; quadr...

Tartışmalar

Burada sunulan teknikler manyetik nanopartiküllerin içselleştirilmesi güvenmek çünkü hücrelerin içinde lokalize bir kez Birincisi, bir önemli konu nanopartiküllerin sonucudur. Demir nanopartikullerin potansiyel toksisite veya maruz kalma ^{19, 22} boyutları, kaplama ve zamana bağlı olarak bozulmuş farklılaşma kapasitesi tetikleyebilir doğrudur. Kapsüllenmiş demir nanopartiküllerin magnetoferritin şeklinde, biyolojik manyetik nano parçacık

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'