Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

Özet

Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.

Özet

Hücre türüne özgü belirteçlerin keşfedilmesi, hücresel fonksiyon ve hücresel heterojenliğin kökeni hakkında bilgi sağlayabilir. Nöronal çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için yeni bir itki ile, ifadeleri hücrelerin çeşitli alt popülasyonlarını tanımlayan genleri tanımlamak önemlidir. Retina merkezi sinir sistemi çeşitliliğinin çalışılması için mükemmel bir model olarak hizmet eder, çünkü çok sayıda ana hücre tipinden oluşur. Her büyük hücre sınıfının çalışması, bu popülasyonların tanımlanmasını kolaylaştıran genetik belirteçler verdi. Bununla birlikte, bu önemli retinal hücre sınıflarının her birinde çok sayıda alt hücre tipi mevcuttur ve pek çoğu morfoloji veya fonksiyonla karakterize olmasına rağmen, bu alt tiplerin az bilinen genetik belirteçleri vardır. Bireysel retinal alt tipler için bir genetik belirteç bilgisi, belirli görsel fonksiyonlarla ilgili beyin hedeflerinin çalışılması ve haritalandırılması için izin verir ve ayrıcaHücresel çeşitliliği muhafaza edin. Alt tiplerin genetik belirteçlerini belirlemek için kullanılan cari yollar, sıralamayı takiben hücre tiplerinin sınıflandırılması gibi dezavantajlara sahiptir. Bu, veri analizi için bir zorluk oluşturuyor ve kümelerin aynı işleve sahip hücreler içerdiğinden emin olmak için titiz doğrulama yöntemleri gerektiriyor. İzolasyon ve sıralama öncesinde bir hücrenin morfolojisini ve işlevselliğini tanımlamak için bir tekniği öneriyoruz, bu da alt tipe özgü belirteçlerin daha kolay tanımlanmasını sağlayacaktır. Bu teknik, nöronal olmayan hücre tiplerine ve küçük varyasyonlar gösteren nadir hücre popülasyonlarına kadar uzatılabilir. Çoğu kütüphane, tek hücreler için 20 milyondan fazla okuma derinlikleri sağladığından, bu protokol mükemmel kalitede veri üretir. Bu metodoloji, Tek hücreli RNA-Seq tarafından sunulan engellerin çoğunun üstesinden gelir ve hücre tiplerini basit ve etkili bir şekilde profillemeyi amaçlayan araştırmacılar için uygun olabilir.

Giriş

Nöronal çeşitlilik merkezi sinir sistemi boyunca, özellikle retinal progenitör hücreler ^{1 , 2 , 3'ün} bir popülasyonundan ortaya çıkan, 1 glial ve 6 nöronal hücre tipinden oluşan, son derece uzmanlaşmış bir doku olan omurgalı retinada gözlemlenir. Birçok alt hücre tipi işlevsel, morfolojik ve genetik olarak sınıflandırılabilir. Bu protokolün amacı hücre tiplerinin genetik değişkenliğini tanımlanabilir işlevsel ve / veya morfolojik özelliklerine bağlamaktır. Hücrelerin sınıflandırılması için bir dizi gen tanımlanmıştır, ancak genel popülasyonun küçük bir bölümünü oluşturduğu için birçok alt tip karakterize edilmeye devam etmektedir. Bu spesifik alt tiplerdeki genlerin tanımlanması, retinadaki nöronal çeşitliliğin daha iyi anlaşılmasına ve başka yerlerde sinir hücrelerinin çeşitlenmesine ışık tutabilir. FuAyrıca, tek hücreli çalışmalar, genel nüfus ^{4 , 5 , 6 , 7} arasında gösterilememeleri nedeniyle gözden kaçmış olabilecek yeni hücre tiplerinin ortaya çıkmasına izin verir.

Tek hücre transkriptomisinin faydalarından biri, belirli bir hücresel alt türü tanımlayan eşsiz belirteçlerin veya işaretçilerin kombinasyonlarının keşfedilmesidir. Bunlar daha sonra farklı manipülasyonlar için o hücre türüne genetik erişim elde etmek için kullanılabilir. Örneğin, bu protokol, fotopigment melanopsini ifade eden bir retina ganglion hücresi alt grubunun hücre tipine özgü genleri karakterize etmek için kullanıyoruz. Melanopsin ifade retinal gangliyon hücrelerinde bir flüoresan markör kullanımı, bu hücrelerin bilinen bir genin ekspresyonu nedeniyle birlikte kümelenmiş olarak çalışmasını sağlar. İlginçtir ki, bu hücre popülünün bilinen beş alt türü vardırFare retinasındaki lation ⁸ . Böylece, RNA'yı her türün hücrelerinden izole etmek için, hücre izolasyonundan önce her alt türün tanımlanması için transjenik model içinde yerleşik morfolojik sınıflamaları kullandık. Bu teknik, hücrelerin içinde stres tepkisine neden olabilecek doku ayrışması ve parçalanmış dendritler nedeniyle kontaminasyona neden olmadan, hücrelerin tanımlanmasına ve retinadan doğrudan izole edilmesine imkan verir ⁹ .

RNA-Seq yöntemi geliştikçe, son birkaç yılda birçok yeni teknik ortaya çıkmıştır. Bu araçlar eldeki soruna yaklaşırken ^{4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13} nolu numaralı hücrelerin toplanmasını ve daha fazla maliyet etkinliği sağlar. Ancak, süreBu teknikler mükemmel basamak taşı olmuştur, hala bu protokolün adresleyebileceği birçok engeli vardır. Birincisi, mevcut prosedürlerin birçoğu hücreleri ayrışmış dokudan ayırır ve hücre sınıflandırmasını belirlemek için post-hoc ya ana bileşen analizi ya da hiyerarşik kümeleme kullanmaya çalışır. Alt tipleri sınıflamak için bu araçlara güvenmek, güvenilir sonuçlar vermeyebilir ve bir genetik işaretin fonksiyonel bir hücre türüne korelasyonu için bu verileri doğrulamanın yeni yollarını bulmaya zorlayabilir. Diğer protokollerde ayrılma gereksinimi bazen doku hasarına neden olabilir ve nöronal proseslerin kopmasına neden olarak mRNA'nın potansiyel bir kaybına neden olabilir. Dahası, ayrışmış hücre preparatlarında stres tepkileri, bu hücrelerin transkriptomlarını etkilemeye başlayabilir ¹⁴ . Bu protokol, izolasyondan önce işlevsel hücre türünü belirleyerek bu zorlukların üstesinden gelir veRetinal dokuyu bozulmadan tutarak hücrelerin sağlıklı kalmasını sağlar.

Bir teknik 2014 yılında tanıtıldı ve canlı hücrelerin transkriptomunun in vivo analizinden oluşuyordu ¹⁵ . Bu teknik dokuya asgari mekanik bozulma ile transkriptomun incelenmesine izin verirken, çok özel bir muhabir fare kullanmadan transkriptomlarını incelemeden önce dokudaki spesifik hücre tiplerini sınıflandırma yeteneğinden yoksundur. İzolasyonundan önce hücreleri karakterize etmek için hücre doldurma ve elektrofizyolojiyi kullandığımız için, protokolümüzde belirli bir muhabir kullanılmasına gerek yoktur. Bu önceki protokolün diğer bir kısıtlaması, fotoaktivite edilebilir elementi uyarmak için spesifik bir dalga boyu gerektirmesidir; oysa protokolümüz, kolayca bulunabilen veya her laboratuvar tarafından ayrı ayrı seçilebilen bir flüoresan muhabirinin ve floresan boyanın kullanımına izin vermektedir. Yine de, diğer laboratuvarlar iki elektrık yöntemini evlendilerOfiyoloji ve transkriptomikler gibi konularda bilgi verir. Bir hücrenin izolasyondan önce fonksiyonunu karakterize etmek için yama-klemp kayıtlarının kullanılması, ayrışmış nöronlar ¹⁶ üzerinde gerçekleştirildi ve bazı vakalarda, bu çalışmalar için mikro-dizi analizi ^17'den önce geldi. Bu yaklaşımlarla aynı komplikasyonlara rastlanır çünkü bunlar, doku ayrışması veya numunelerin kullanılabilir problara hibridize edilmesine dayanan mikroarray teknolojisinin kullanılması gerektirir. En yeni gelişmelerden biri, tam beyin dilimlerinden gelen hücreleri anlamak için patch-clamp kayıtlarının ve RNA-Seq teknolojisinin kullanımını birleştiren bir teknik olan Patch-Seq'in geliştirilmesidir18. Bu teknik burada sunulan protokole benzemekle birlikte, yaklaşımımızın dokuların hücrelerin sağlığı için bozulmadan kalmasını sağladığına dikkat etmek önemlidir. Burada optimizat için bir protokol sunmaktayız.Yüksek okuma derinliği ve haritalama kapsamı elde etmek için RNA-Seq kullanımı için yüksek kalitede, tek hücreli kütüphaneler üreten bu ittifakın iyonu.

Protokol

Bütün prosedürler, Northwestern Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. Elektrofizyoloji için Çözümlerin Hazırlanması (4 saat)

1. 999 mL ters ozmoz-saflaştırılmış H2O'ya 1 mL dietil pirokarbonat (DEPC) ilavesiyle% 0.1 DEPC ile işlenmiş H2O yapın. Karıştırın iyice karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin. Daha sonra DEPC-karışık H20'nı sıvı bir çevrimde 15 dakika süreyle otoklavlayın. DEPC ile işlenmiş H2O'nun oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
2. Bir şişe Ames 'orta ve 1,9 g (23 mM) sodyum bikarbonat 1 L H ₂ O içine karıştırılarak hücre dışı çözelti hazırlayın. Ekstraselüler çözeltiyi
   % 95 O2 /% 5 CO2 ve pH'ı 7.3-7.4 arasında tutun.
3. 125 mM K-glukonat, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES ve% 0.1 DEPC ile işlenmiş H'yi birleştirerek hücre içi çözeltiyi üretin₂ O. -20 ° C'de 1 mL alikuotlar halinde saklayın. Her deneyin başlangıcına 10 uM floresan izleyici ekleyin.
4. 4.15 mL hücre dışı çözeltiye 10.000 kollajenaz ve 83 mg hiyalüronidaz ekleyerek enzim çözeltisi yapın. Enzim çözeltisi -20 ° C'de 50 ul'lik bölümler halinde depolanmalıdır.

2. Retinal Doku Hazırlama (2 saat)

NOT: Bu bölümdeki tüm işlemler koyu kırmızı aydınlatma altında yapılmalıdır

1. Diseksiyontan önce hayvanlara en az 1 saat karanlık uyum sağlayın. Tüm işlemleri loş renkli aydınlatma altında yapın.
2. Hayvanları CO ₂ boğulma ile euthanize edin ve gözbebeklerini daha önce oksijenlenmiş hücre dışı solüsyonu olan bir Petri kabına alın.
3. Korneayı bir iğne ile poke edin ve korneanın ve skleranın 19 sınırındaki oftalmik makasla keserek kesin.
4. Kullanarak objektifi çıkarın# 5 forseps. Forseplerle sklera hafifçe gözyaşı dökün ve retinanın ve skleranın buluştuğu optik siniri koparın. Sklerayı retinadaki özenle bitirin.
5. # 5 forseps kullanarak transparan vitrini çıkarın; Bir kere çıkarıldıktan sonra, vitreus forseps'e yapışmış jelatinimsi bir madde gibi görünüyor. Retinayı yarı yarıya kesin (böylece 4 parça / hayvan bulunur) ve kullanıma kadar oda sıcaklığında oksijenli ekstraselüler solüsyonda saklayın.
6. Dokuyu kayıt odasına monte etmeye hazır olduğunuzda, 500 μL oksijenli hücre dışı çözeltide seyreltilmiş enzim çözeltisi içerisinde inkübe etmek için bir parça retina yerleştirin. Bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir Petri kabında 2 dakika inkübe edin.
   1. Oksijenlenmiş hücre dışı solüsyondaki retina parçasını yıkayın ve dokuyu cam altı bir kayıt odasına yerleştirin; Dokuya zarar vermeden retinanın aktarılmasına izin vermek için uç kesilmiş bir plastik transfer pipeti kullanın.
7. İçin kullanmakFotoreseptör tabakası aşağı bakacak şekilde dokuyu düzgün bir şekilde düzleştirmek için akar. Aşırı sıvıyı bir pipet kullanarak alın. Naylon örgülü bir platin halka kullanarak dokuyu bağlayın.
   NOT: Bu yöntem, etiketli amacrine ve bipolar hücrelerden RNA izolasyonu için doku hazırlamak için de kullanılabilir.
8. Odaya oksijenli hücre dışı solüsyon doldurun ve bir mikroskop sahnesine monte edin. 2-4 mL / dakika oksijenli hücre dışı solüsyon ile perfüz dokusu.

3. GFP + Retinal Ganglion Hücrelerinin Görselleştirilmesi ve Hedeflenmesi (10 dakika)

NOT: Bu bölümdeki tüm işlemler koyu kırmızı aydınlatma altında yapılmalıdır

1. Başlamadan önce, bir mikropipet çekici kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar için cam mikropipetleri (OD: 1.2 mm, ID: 0.69 mm) çekin. Elektrotlar için aşağıdaki protokolü kullanın (lütfen istenen direnci elde etmek için parametrelerin buna göre ayarlanması gerektiğini unutmayın veMakaralar arasında ve farklı cam ile değişir): Isı: Rampa +10; Çekin: 0; Vel: 23; Gecikme: 1; Basınç: 500; Program döngüsü: 5 kez. Büyük hücreleri hedeflemek için 2-4 MΩ'luk dirençlerle ve daha küçük hücreleri hedeflemek için 5-7 MΩ'luk dirençlerle iplerin ~ 1 mikron çapında olduğundan emin olun.
2. Kızılötesi Diferansiyel Parazit Kontrastı (IR-DIC) optik kullanarak gangliyon hücresi tabakasına dikkat edin ( Şekil 1A ). Epifloresans (~ 480 nm) kullanarak GFP + Retinal Ganglion Hücrelerini (RGC'leri) tanımlayın ( Şekil 1B ).
3. DIC'de hücre içi çözelti dolu pipet yerini bulun. Amplifikatör üzerinde hafif pozitif basınç uygulayın ve herhangi bir voltaj ofsetini sıfırlayın.
4. Cam mikropıpetini bir GFP + hücresine karşı bastırın ve pipet ile hücre zarı arasında bir GΩ mühür oluşturmak için negatif basınç uygulayın. Conta direncini izlemek için test voltajı komut adımlarını uygulayın ( örn. 5 mV). Dengeli bir sızdırmazlık oluşturduktan sonra kısa zarf nTüm hücreli erişim elde etmek için egalici baskı.
5. Floresan izleyici ile doldurmak için hücrenin dendritleri için 1-2 dakika bekleyin.
   NOT: Hücre, epifloresanstaki morfolojiyi inceleyerek morfolojik olarak yazılabilir ( Şekil 1C ). Melanopsin ifade eden RGC'lerde, iç pleksiform katmandaki dendritik tabakalaşma, epifloresan aydınlatma altında flüoresan izleyici ile dolu dendritleri inceleyerek ve gangliyonun yakınında OFF sublaminasında (M1 ipRGCs) soma uzaklaşıp katmanlaşıp çakışmadığını belirleyerek görselleştirilir (M2 ve M4 ipRGC'ler) veya her ikisinde (M3 ipRGC'ler) hücre tabakası. Bu gözlem, soma boyutu (M4'lerin diğer tüm ipRGC alt tiplerine kıyasla belirgin şekilde büyük hacimlere sahip olduğu) ile kombine edildiğinde, hücre tipi ^{20 , 21 , 22'nin} tanımlanmasına izin verir. Bu nedenle, bu teknik, RNA iso öncesi in vitro hücre türünün tanımlanmasına olanak tanırmiştir. Bu yöntem, dendritik morfoloji veya hücresel fizyolojiyi içeren diğer hücre tipi tanımlama protokolleri için modifiye edilebilir.

4. Hücre İzolasyonu (2 dak.)

1. Başlamadan önce masaüstü mikro santrifüj 2.000 x g'ye ayarlayın. 1 cc'lik bir şırınga ile boruyu (OD: 3/32 in, ID: 1/32 inç) bağlayarak bir numune çıkarma aparatı hazırlayın.
2. Buz üzerinde 10 μL liziz tamponu ve% 1 β-merkaptoetanol içeren 0.2 mL PCR tüpleri yerleştirin. Pipet uçlarını durulamak için DEPC ile işlenmiş H ₂ O içeren 1 cc'lik bir şırınga hazırlayın. Numune toplandıktan sonra liziz tamponunu dondurmak için bir kuru buz kovası hazırlayın.
3. 10 mL şırınga kullanarak negatif basınç uygulayarak hücre pipetinin sitoplazmik içeriğini özenle özütleyin; Mümkünse organelleri de içeren tüm sitoplazmik içerikler çıkarılmalıdır.
   1. Boyutu azalırken hücre gövdesini görselleştirerek DIC'deki çıkarmayı izleyin. Çıkardıktan sonra Sitoplazmik içerik, pipet dikkatle doku kaldırın ve hızlı bir şekilde çözüm pipet kaldırın.
4. Pipeti kafa satıcısı tutucusundan çabucak çıkarın ve 1 mL'lik bir şırınga kullanarak DEPC ile işlenmiş H ₂ O ile pipet ucu hafifçe durulayın. Numuneyi dışarı atmak için pipeti sıkı oturan borular vasıtasıyla 1 mL şırıngaya bağlayın.
5. Hücreleri hemen 0.2 mL PCR tüplerinde% 1 β-merkaptoetanol içeren liziz tamponu 10 uL'ye boşaltın.
   NOT: Hücrelerle olan tüm aspirat kabarcıkları sokmamak için yavaşça dışarı atılmalıdır.
   1. Tüpü bir masaüstü mini santrifüjde 2,000 xg'de 10 saniye boyunca kısaca santrifüjleyin. Kuru buz üzerinde numuneleri derhal 5 dakika boyunca hızlıca dondurun. Donduktan sonra, en iyi sonucu alabilmek için iki haftaya kadar -80 ° C'de saklayın; Örnekler daha uzun sürebilir, ancak mümkün olduğunca çabuk işlenmeleri önerilir.

E "> 5. RNA Saflaştırması (30 dakika)

1. Başlamadan önce, ters çevrilmiş bir P20 veya P200 uç tutucusunun üst kısmını 96 oyuklu manyetik standa ²³ bantlayarak bir manyetik ayırıcı aygıtı ayarlayın.
2. Taze% 70 etanol (EtOH) hazırlayın - numune başına yaklaşık 1 mL yeterlidir. RNA manyetik boncukları 4 ° C'lik bir depodan çıkarın ve oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca çözündürün.
   NOT: Bu protokoldaki birçok adım verimlilik ve hızlı bir şekilde işleme dayalı olduğundan, en fazla 8 numune fazla işlenmemelidir.
3. Manyetik boncuklar oda sıcaklığında olduğunda, çözeltinin iyi karıştırıldığından emin olmak için 30 saniye vorteks uygulayın.
   NOT: Boncuklar, RNA'yı seçici olarak bağlamak için RNA'ya özgü bir tampon kullanır ve manyetik bir levha ile kullanıldığında diğer hücresel atıkların giderilmesine izin verirler.
4. RT'de 1 dakika süreyle hücreleri çözünür ve sonra her numuneye 5 uL RNaz içermeyen H20 eklenir; Pipetle aşağı yukarı. Her tüpe ve pipett'e 22 uL RNA boncuk ekleyinE karıştırarak iyice. RNA'nın etkileşime girmesine ve manyetik boncuklarla bağlanmasına izin vermek için numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
5. Tüpleri bir manyetik ayırıcı cihaza yerleştirin ve 8 dakika bekletin; Devam etmeden önce süpernatanın berrak olduğundan emin olun. Boncukları bir peletten izleyin ve pipetleme sırasında ayırmayacağınızdan emin olun.
6. Süpernatantı numunelerden çıkarın ve 150 μL% 70 EtOH ekleyin. EtOH çıkarın ve yıkama iki kez daha tekrarlayın.
7. Numunelerin 6 dakika hava kurumasına izin verin. Tüpün alt kısmında daha fazla EtOH toplanmış olup olmadığını görmek için aralıklarla kontrol edin. Buna göre kaldırın.
8. Numuneler kuruyorken, 19 μL liziz tamponu 2 ve 1 uL RNaz İnhibitörü (40 U / μL) birleştirerek 10X reaksiyon tamponu hazırlayın. Kısaca aşağı indirin ve buz üzerinde tutun.
9. Numuneler kuruduktan ve boncuk tanecikleri artık parlak görünmüyorsa, tüpleri manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 9.5 uL RNaz içermeyen H20'yu ilave edinÖrnekleri yeniden su haline getirmek için. Örnekleri buz üzerine yerleştirin ve her bir numuneye 1 uL 10x reaksiyon tamponu ilave edin.

6. Ters Transkripsiyon (10 dakika)

NOT: Başlamadan önce, buz üzerinde ters transkripsiyon için gereken reaktifleri (enzim haricinde RT) çözündürün. Bunlar arasında primer II, tampon 1, oligonükleotid ve RNaz inhibitörü bulunur.

1. Her bir tüp için, N _- 1'in A, C veya G olabileceği ve N'nin A, C, G veya T olabilir; 12 uM olması için 2 mcL primer II (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT ₍₃₀₎ N _- 1N ₎ ekleyin. Tüpleri 72 ° C'de 3 dakika önceden ısıtılmış bir termostatöre yerleştirin.
2. İnkübasyon sırasında, RT ana karışımını hazırlayın. Her bir reaksiyon için 4 uL tampon 1 (250 mM Tris-HC1, pH 8.3, 375 mM KCI ve 30 mM MgCl2), 1 μL oligonükleotid (48 uM) ve 0.5 uL RNaz inhibitörü (40 U / uL).
3. Kuluçkadan hemen sonra tüpleriBuz için 2 dakika.
4. Ana karışıma ters transkriptaz (100 U / μL) reaksiyon başına 2 μL ekleyin ve pipetle iyice pipetleyin. Her bir tüpe 7.5 uL ana karışım ilave edin ve hafifçe pipetleyerek karıştırın. İçerikleri alttan toplamak için tüpleri kısaca döndürün ve aşağıdaki programla ön ısıtmalı bir termal dolaştırıcıya yerleştirin: 42 ° C'de 90 dakika, 70 ° C'de 10 dakika ve 4 ° C'de tutma.
5. Tüpleri devam etmeden önce -20 ° C / N'de saklayın, ancak örneklerin uzun süre depolanmadan önce amplifikasyon adımında taşınması önerilir; Diğer kaynaklar, bu basamakta 4 ° C'de O / N depolamanın da kabul edilebilir olacağını önermektedir.

7. cDNA Amplifikasyonu (2.5 saat)

NOT: Başlamadan önce, buz üzerinde PCR tamponu ve PCR primeri çözülür ve PCR master karışımını yapmadan önce tüpleri bir masaüstü mini santrifüjde döndürün.

1. Her reaksiyon için p25 mcL PCR tamponu, 1 μL PCR primeri (12 μM), 1 μL DNA polimeraz ve 3 μL nükleaz içermeyen H ₂ O içeren bir PCR ana karışımını yeniden dengeleyin. İlave edilmeden hemen önce DNA polimeraz ilave edin Ana karışımın örneklere karışması.
2. Tüplerin altındaki içeriği toplamak için her tüpe 30 uL ana karışım ilave edin ve 10 saniye boyunca 2.000 xg'de döndürün.
3. Tüpleri, aşağıdaki program ile önceden ısıtılmış bir termostatöre yerleştirin: 95 ° C'de 1 dakika; 10 saniye için 98 ° C, 30 saniye için 65 ° C ve 3 dakika boyunca 68 ° C'lik 34 döngü; 72 ° C'de 10 dakika; Ve 4 ° C'de tutun.
   NOT: Önerilen üreticinin talimatlarına göre, bu PCR için döngü sayısı 34'e yükseltilmiştir. Yinelenen testten sonra bu döngü sayısının tutarlı bir şekilde güvenilir sonuçlar elde ettiği bulunmuştur.
4. Devam etmeden önce tüpleri bir yıla kadar -20 ° C'de saklayın.

8. Amplified cDN'nin saflaştırılmasıA (30 dakika)

1. Saflaştırmaya başlamadan önce, DNA boncuklarını ve elüsyon tamponunu RT'ye en az 30 dakika boyunca getirin. Taze% 80 EtOH hazırlayın; Numune başına 1 mL yeterlidir. Her bir numuneye 1 uL 10X lizis tamponu ilave edin.
2. DNA boncuklarını 30 saniye vorteksleyin ve her numuneye 50 uL DNA boncuk ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve sonra 10 saniye süreyle 2.000 x g'de kısaca bastırın. Tüpleri oda sıcaklığında 8 dakika inkübe edin.
3. Boruları manyetik ayırma cihazına 5 dakika boyunca yerleştirin. Yavaşça supernatantı iki kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve numunelerin 2 dakika boyunca oturmasına izin verin. Numuneler manyetik cihaz üzerindeyken, süpernatanı çıkarın ve atın.
4. Her bir numuneye 150 μL taze hazırlanmış% 80 EtOH ilave edin ve oda sıcaklığında 30 saniye bekletin. EtOH çıkarın ve bir kez EtOH yıkama tekrarlayın.
5. Numuneleri kısaca döndürün ve onları 1 dakika boyunca manyetik ayırıcıya geri koyun. Kalan EtOH'ları çıkarın ve numunelerin 5 dakika boyunca hava ile kurutulmasına izin verin.
6. EtOH toplanıp gelmediğini görmek için aralıklı olarak numuneleri kontrol edin ve pipetle çıkarın.
7. Boncuk topağı artık parlak görünmüyorsa ancak çatlaklar görünmeye başlamadan önce tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 17 uL elüsyon tamponu ekleyin. Boncukları tamamen yeniden süspansiyon haline getirmek için hafifçe pipetle aşağı yukarı.
8. Yeniden süspanse edilen numuneleri oda sıcaklığında 2 dk inkübe edin.
9. Alttaki tüm sıvıları toplamak için numuneleri kısaca döndürün ve 2 dakika süreyle manyetik ayırıcıya yerleştirin. 15 mL'lik temiz suyunu 1.5 mL'lik RNaz içermeyen bir tüp içine aktarın ve -20 ° C'de saklayın.
10. CDNA kütüphanesinin kalite ve boyutunu, 1 μL cDNA kullanarak yüksek hassasiyetli bir biyolojik analizci çipi ile inceleyin. Bir cDNA kütüphanesinin ideal boyutu 0.3-2 Kb, en az 10 ng / μL'lik bir konsantrasyonda bulunur ( Şekil 2 ).
    NOT: Örnek PR'ye geçmeden önce bilinen işaretlerin ekspresyonunu sağlamak için PCR'leri örneklemenin bir yolu olarak kullanmayı seçebilirsinizAyırma.

9. Konsantrasyonları Belirleme ve Etiketleme cDNA (20 dakika)

1. Başlamadan önce, deney reaktifi, seyreltme tamponu ve standartları RT'ye 30 dakika kadar getirin. Reaksiyon başına 1 μL tahlil reaktifi ve 199 uL seyreltme tamponu içeren bir ana karışım hazırlayın. Bu karışımın 199 uL'si 500 uL test tüplerine bölün. 1 μL numune ekleyin ve iyice karıştırın.
2. Tüp 1 ve 2'ye 190 μL master karıştırın. Tüp 1'e 10 μL standart 1, tüp 2'ye standart 2'den 10 μL ekleyin. 5 sn için tüm numune tüpleri ve standart tüpleri vorteksleyin; Oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin.
3. Yüksek duyarlıklı florometre ile numunelerin konsantrasyonunu belirleyin. "Stok solüsyonunu hesapla" seçeneğini belirleyerek ve "1 μL" değerini vurgulayarak doğru numune miktarının girildiğinden emin olun. Her numuneyi, RNaz içermeyen H20 içerisinde 0.2 ng / μL'lik nihai konsantrasyona kadar ayrı bir 1.5 mL tüp içerisinde seyreltin.
   NOT:Üreticinin talimatlarına göre 1 ng / μL toplam DNA ile başlamalıyız, daha küçük bir başlangıç ​​miktarı kullandık ve protokolü de bu değişikliği hesaba katarak ayarladık.
4. Yeni 0,2 mL'lik PCR tüplerinde, 2.5 uL tampon pipetle doldurun. 250 pg toplam için uygun tüb içine 1.25 μL cDNA ekleyin. Son olarak, her tüpe 1.25 μL etiketleme karışımı ekleyin ve karıştırmak için iyice pipetleyin; Etiketleme karışımı içindeki transposaz DNA'yı kısa şeritlere parçalayacak ve adaptörleri daha sonra sıralayıcı enstrüman tarafından kullanılmak üzere her bir bükümün herhangi bir ucuna bağlayacaktır.
   NOT: Etiketleme ve dizin bağlantısı için kullanılan hacimler üreticinin talimatları tarafından önerilen miktarın bir kısmıdır. Bu sadece reaktiflerin korunmasına izin vermemekle kalmaz, aynı zamanda deneyimlerimiz doğrultusunda sürekli olarak etiketlenmiş örnekler üretmiştir.
5. Tüpleri bir tezgah üstü mikro santrifüjde 1 dakika boyunca santrifüjleyin.
6. Tüpleri yerleştirinÖnceden ısıtılmış bir termostatöre aşağıdaki programla uygulayın: 55 ° C'de 10 dakika ve tutma 10 ° C'de.
   NOT: Bu kuluçka süresinin uzunluğu, üreticinin talimatlarına göre önerilen 5 dakikanin aksine 10 dır.
7. Bu programın tamamlanmasından hemen sonra, tüpleri çıkarın ve her biri için 1.25 μL etiketleme nötralize edici tampon ekleyin. Karıştırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmek için iyi pipetleyin. Tampon enzimi nötralize edip reaksiyonu durdurana kadar transpoze aktif kaldığı için bu adımı derhal tamamlayın.

10. İndeks Eşleme ve Saflaştırma (1 saat)

NOT: Başlamadan önce, DNA boncuklarını ve resüsitme tamponunu RT'ye en az 30 dakika kadar getirin. Her bir numune için hangi indeksleri kullanacağınıza karar verin.

NOT: Bu dizinler dizilendikten sonra örneklerin tanımlanması için parçalanmış DNA'nın ilgili 5 've 3' uçlarına tutturulacaktır. HiçbirininBirlikte sıralanabilen numuneler için eşlemeler aynıdır. Örneğin, örnek 1, beyaz 1 ve turuncu 1 indekslerini kullanacaksa, örnek iki, beyaz 1 ve turuncu 2 veya beyaz 2 ve turuncu 2'yi kullanmalıdır, ancak asla aynı indeks kombinasyonunu kullanmamalıdır. Bu kit, 4 farklı beyaz ve 6 farklı turuncu renk indeksi içerir. Farklı olası kombinasyonların tamamı bir dizileme şeridinde toplanacak 24 numuneye kadar izin verir. Genellikle sadece bir şeritte 10 numuneyi toplarsak da, arzu edilirse, tek bir şerit diziliminde 96 numunenin havuzlanmasına izin verecek şekilde 24 indeks içeren kiti kullanabiliriz.

1. Her tüpe, o spesifik örnek için 1.25 μL sol endeks ve 1.25 μL sağ indeks ekleyin. 3.75 μL PCR master karışımı ekleyin ve karıştırmak için iyice pipetleyin.
2. 1 dakika süreyle bir tezgah üstü mikro santrifüjde santrifüjleyin.
3. Tüpleri, aşağıdaki programla önceden ısıtılmış bir termostatöre yerleştirin: 72 ° C'de 3 dakika; 95 ° C'de 30 saniye; 12 döngü 9576 ° C, 10 saniye boyunca C, 30 saniye boyunca 50 ° C ve 1 dakika boyunca 72 ° C; 72 ° C'de 5 dakika; Ve 4 ° C'de tutun.
   NOT: İlk 95 ° C kademe 98 ° C'den değiştirildi, bu üretici talimatları tarafından önerildi. Ayrıca, çevrim ayrıntıları, numunelerimizin optimum etiketi oluşturulması için izin verilen sıcaklık ve sürelerin ayarlanması için ayarlandı. Son 72 ° C inkübasyon protokolümüze de eklendi ve imalatçının talimatlarına dahil edilmedi.
4. İçeriği alt kısımda toplamak için tüpleri kısaca döndürün. DNA boncuklarını 30 saniye vorteksleyin ve sonra her bir tüpe 30 uL ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.
5. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
6. Numuneleri 2 dakika boyunca bir manyetik ayırıcı üzerine yerleştirin. Süpernatantı iki kez pipetleyin ve örnekleri 1 dakika inkübe edin.
7. Temiz yüzer malzemeyi çıkarın ve atın. Her bir numuneye 150 μL% 80 EtOH ilave edin ve çıkarın. EtOH yıkamasını bir kez tekrarlayın.
8. Izin verÖrnekleri havayla 10 dakika kurumaya bırakın. Tüplerin alt kısmında herhangi bir EtOH toplanmış olup olmadığını görmek için aralıklarla kontrol edin ve gerekirse çıkarın.
9. DNA boncuk peletinde bir çatlak oluşmaya başlayınca, numuneyi manyetik ayırıcıdan çıkarın ve pelatı yeniden su haline getirmek için 27.5 uL tekrar süspansiyon tamponu ilave edin. Pelletin tamamen yeniden süspansiyon haline getirildiğinden emin olun ve RT'de 2 dakika inkübe edin.
   NOT: Yeniden süspansiyon tamponu için kullanılan hacim, protokolümüzdeki az miktarda başlangıç ​​maddesini hesaba katacak şekilde değiştirildi ve üreticinin talimatlarındaki önerilen hacimden farklılık göstermektedir.
10. Tüpleri manyetik ayırıcıya 2 dakika boyunca yerleştirin. RNaz içermeyen bir tüp içine 25 μL berrak üstte yüzen maddeyi aktarın ve -20 ° C'de saklayın.
    NOT: Kitaplık normalleştirme işlemini tamamlamak için üreticinin talimatlarına uymayın. Numuneler, bu adımı izleyerek başarıyla hazırlanır ve olduğu gibi sıraya hazırlanır.
11. T analizBir biyoanalizör çipi ve her bir numunenin 1 uL'si kullanılarak numunelerin agmentasyonu.
    NOT: Bulaşların analizi daha önce olduğu gibi yürütülecektir; Bununla birlikte, cDNA artık 0.2-1 Kb boyut aralığında tespit edilmelidir ( Şekil 3 ). Bu noktanın altındaki bulaşmalar muhtemelen örneklerin bozulmasını temsil eder, daha büyük bulaşmalar eksik etiketi önermektedir.

11. Numunelerin Havuzlanması (10 dakika)

1. Daha önce elde edilen yüksek duyarlılıklı florometre ile etiketleme örneklerinin konsantrasyonlarını elde edin ve nM'deki konsantrasyonu belirleyin.
   NOT: Bu hesaplama, bir internet dönüştürme aracı kullanılarak hesaplanabilir ve biyoanalizör izinden elde edilen ortalama parça uzunluğuna dayanır. Ortalama fragman uzunluğunu belirlemek için, her bir numunenin izini tek tek izleyin ve ortalama DNA parçasının boyutunu belirleyin. Bu aynı zamanda, bulaşmanın aralığını vurgulayarak ve biyolojik analizci izini incelerken hesaplanabilirProgram tarafından hesaplanan molarite.
2. Havuzları her numunenin aynı konsantrasyonunu içereceği şekilde numuneleri birleştirin. Numuneleri seyreltmeyin; Havuz, yalnızca en düşük konsantrasyonda olan numune kadar inceltmeli ve ideal olarak en az 15 nM toplam konsantrasyona sahip olmalıdır.
3. Birleştirilen örnekleri sıralamadan önce -20 ° C'de saklayın; Örneklemlerin havuzlamadan sonraki 1 hafta içinde sıralama yapıldığı önerilir. Bir HiSeq platformuyla çift uçlu, 100 bp sıralamayı gerçekleştirin.

Sonuçlar

Hücre türleri, boya enjeksiyonundan sonra kolayca sınıflandırılır

Şekil 1 , flüoresan izleyici dolumundan önceki ve sonraki bir GFP + RGC örneğini göstermektedir. Bu hücre, transjenik çizgide GFP ifadesine dayanarak tanımlandı ( Şekil 1A ). Bu hücrenin soma üzerine ince uçlu, çekilmiş bir cam elektrot ile sıkı bir conta oluşturuldu. Alt türün karakterize edilmesi için...

Tartışmalar

Protokolümüz, hızlı ve kolay bir kullanım kılavuzunda, numuneye az zarar veren, yüksek kaliteli sıralama için tanımlanmış morfolojik sınıfların tek hücrelerini hazırlamak için bir yöntem göstermektedir. Mevcut el yazmada, esas olarak duyarlı retina ganglion hücreleri morfolojik olarak karakterize edilir, izole edilir ve RNA-Seq için hazırlanır. Hücresel stresler retina kullanımı sırasında ortaya çıkabilir; Bu nedenle, en fazla 4 saat kullanımdan sonra her bir doku parçasını değiştir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420-10X1L
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S8875
K-gluconate	Spectrum Chemical	PO178
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758
Alexa Fluor 594 Hydrazide	Invitrogen	A10442
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Petri dish (35 mm diameter)	Thermo Fisher Scientific	153066
Ophthalmologic scissors	Fine Science Tools	15000-00
#5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Microplate Shaker	Fisher Scientific	13-687-708
Glass Micropipette	Sutter	BF120-69-10
Micropipette Puller	Sutter		P-1000 horizontal pipette puller
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-2F
Flexible tubing	Fisher Scientific	14-171
TCL lysis buffer	Qiagen	1031576	Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
RNase-free Water	Qiagen	129112
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	30124359
Ethyl Alcohol, Pure	Sigma Aldrich	E7023	Ethanol
Analog Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365	Vortex
Mini Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	05-090-100
Agencourt RNAClean XP Beads	Beckman Coulter	A63987	RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic Separator	Promega	V8351	Magnetic stand
1.5 mL MCT Graduated Tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit	Clontech	634888	Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10x Lysis Buffer			Lysis Buffer 2
5x Ultra Low First-strand Buffer			Buffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II A			Primer II
SMART-Seq v4 Oligonucleotide			Oligonucleotide
SMARTScribe Rverse Transcriptase			Reverse Transcriptase (RT)
2x SeqAmp PCR Buffer			PCR Buffer
PCR Primer II A			PCR Primer
SeqAmp DNA Polymerase			DNA Polymerase
Mastercycler pro S	Eppendorf	950030020	Thermocycler
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	DNA magnetic beads
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
HS Bioanalyzer Chips & Reagents	Agilent Technologies	5067-4626
Qubit HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD Buffer			Buffer 2
ATM			Tagmentation Mix
NT Buffer			Tagmentation Neutralizing Buffer
NPM			PCR Master Mix
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	Indices for Tagmentation
N501			White 1
N502			White 2
N701			Orange 1
N702			Orange 2
HiSeq 2500	Illumina	SY-401-2501	For completing sequencing of samples