RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Özet

Burada, intramoleküler ve molekül içi RNA-RNA etkileşimlerinin in vivo genom geneli haritalamasını mümkün kılan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin yöntemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. SPLASH maya, bakteri ve insanlar dahil olmak üzere organizmaların RNA etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.

Özet

RNA'ların kendileriyle ve diğerleriyle nasıl etkileşime girdiğini bilmek, hücredeki RNA esaslı gen düzenlenişini anlamanın anahtarıdır. MikroRNA-mRNA etkileşimleri gibi RNA-RNA etkileşimlerinin örneklerinin gen ekspresyonunu düzenlediği gösterilmiş olsa da, RNA etkileşimlerinin hücrede oluştuğu tam olarak bilinmemektedir. RNA etkileşimlerini incelemek için önceki yöntemler, öncelikle belirli bir protein veya RNA türü ile etkileşime giren RNA altkümelerine odaklanmıştır. Burada, RNA etkileşimlerini in vivo olarak tarafsız bir şekilde yakalamaya yarayan P soralen çapraz bağlanmış, L ve S seçilmiş H zincirlerine (SPLASH) denk gelen bir yöntem ayrıntılı. SPLASH, intramoleküler ve moleküller arası RNA baz eşleştirme partnerlerini küresel olarak tanımlamak için, in vivo çapraz bağlama, yakınlık ligasyonu ve yüksek verimli sıralama kullanmaktadır. SPLASH bakteri, maya ve insan hücreleri de dahil olmak üzere farklı organizmalara uygulanabilir.Farklı hücresel bağlamlarda RNA organizasyon dinamikleri anlayışını kolaylaştırmak için çeşitli hücresel koşullar. Tüm deneysel SPLASH protokolünün tamamlanması yaklaşık 5 gün sürer ve hesaplama iş akışının tamamlanması yaklaşık 7 gün sürer.

Giriş

Makromoleküllerin birbirleriyle nasıl katlandığını ve etkileşim kurduğunu incelemek, hücredeki gen düzenlenişini anlamak için anahtardır. DNA ve proteinlerin gen regülasyonuna nasıl katkıda bulunduğunu anlama konusunda son on yılda çok fazla çaba sarf edilmesine rağmen, gen ifadesinin transkripsiyon sonrası regülasyonu hakkında nispeten daha az şey bilinmektedir. RNA hem doğrusal sekansında hem de sekonder ve tersiyer yapıda bilgi taşır ¹ . Kendisi ve başkaları ile çiftleşebilme kabiliyeti , in vivo fonksiyonu için önemlidir. Yüksek verimli RNA ikincil yapı taramasındaki son gelişmeler, transkriptomda ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howe'deki çift ve tek sarmal bölgelerin yerlerine değerli bilgiler sağlamıştırEşleştirme etkileşimi ortakları hakkındaki ver bilgileri hala büyük ölçüde eksiktir. Hangi RNA sekansının transkriptomdaki başka bir RNA bölgesi ile etkileşime girdiğini belirlemek için küresel çaplı bilgiye ihtiyacımız var.

Çift-bazlı RNA etkileşimlerini küresel, tarafsız bir şekilde haritalamak geleneksel olarak büyük bir mücadele olmuştur. CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ ve RAP ¹¹ gibi daha önceki yaklaşımlar RNA etkileşimlerini büyük ölçekte tanımlamak için kullanılırken, bu teknikler tipik olarak belirli bir protein veya RNA türü ile etkileşime giren bir RNA alt kümesi için RNA baz eşleştirmesini eşleştirir. Küresel RNA etkileşimlerinin incelenmesindeki son gelişmeler, RNA etkileşimlerini in vivo olarak stabilize etmeyen ve dolayısıyla sadece in vivo etkileşimlerin bir alt kümesini yakalayabilen RPL ¹² yöntemini içerir. Bu zorlukların üstesinden gelmek için biz ve diğerleri genom çapında, tarafsız stratejiler geliştirdiler.P RNA , in vivo olarak, çapraz bağlayıcı psoralen ^{13 , 14 , 15'in} değiştirilmiş versiyonları kullanılarak etkileşir. Bu protokolde, baz eşleştirme RNA'larını in vivo çapraz bağlamak için biyotinlenmiş psooren kullanan P soralen çapraz bağlanmış, L ve s seçilmiş H zincirlerinin (SPLASH) eşitliğinin gerçekleştirilmesine ilişkin ayrıntıları, ardından proximity ligasyonu ve yüksek işleme sıralamasını RNA baz eşleştirme ortaklarını genom çapında tanımlayın ( Şekil 1 ) ¹⁵ .

Bu yazıda, kültürlü adherent hücreleri (bu durumda HeLa hücreleri) kullanarak SPLASH'ı gerçekleştirmek için gerekli adımları anlatacağız. Aynı protokol süspansiyon memeli hücrelerine ve maya ve bakteri hücrelerine kolaylıkla uyarlanabilir. Kısaca, HeLa hücreleri biotinile psoralen ile muamele edilir ve in vivo etkileşen RNA baz çiftlerini çapraz bağlamak için 365 nm'de ışınlanır. RNA'lar daha sonra hücrelerden çıkarılır, parçalanır ve streptavidin boncukları kullanılarak çapraz bağlanma bölgesi için zenginleştirilir. Etkileşen RNA parçaları daha sonra yakınlık ligasyonu kullanılarak bağlanır ve derin sekanslama için bir cDNA kütüphanesine dönüştürülür. Sıralamada, kimerik RNA'lar, birbirlerine eşleştirilen RNA etkileşimli bölgelerin tanımlanması için transkriptom / genom üzerine eşlenir. Yapısal organizasyon ve etkileşim kalıplarına göz atmak için snoRNA'lar, lncRNA'lar ve mRNA'lar gibi farklı RNA sınıflarında intramoleküler ve moleküller arası RNA baz eşleştirmesi de dahil olmak üzere , mayada ve farklı insan hücrelerinde in vivo olarak binlerce RNA etkileşimini tanımlamak için SPLASH'ı başarıyla kullandık. Hücredeki RNA'ların

Protokol

1. HeLa Hücrelerinin Biotinile Psoralen ve RNA Ekstraksiyonu ile Tedavisi

1. Kültür 10 cm'lik bir plakada% 10 sığır fetüsü serumu (FBS) ve% 1 penisilin streptomisin (PS) takviye edilmiş Dulbecco'nun değiştirilmiş Kartal besiyeri (DMEM) içindeki HeLa hücreleri.
2. HeLa hücrelerini, 5 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. Çanağı dikey olarak 1 dakika yerleştirerek fazla PBS'yi çanaktan tamamen boşaltın.
3. 200 uM biyotinlenmiş psoralen ve% 0.01 w / v digitonin içeren 1 mL PBS'yi hücrelere düzgün bir şekilde ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Biyotinile psoralen hücreye girebilirken, hücreler 5 dakika süreyle düşük miktarda digitonin (% 0.01) maruz kaldığında geçirgenliği çok daha yüksektir
4. İşlenmiş HeLa hücrelerini içeren 10 cm'lik plakanın kapağını çıkarın ve çanağı buz üzerinde düz şekilde yerleştirin. UV çapraz bağlayıcıyı kullanarak, UV ampullerden 3 cm uzakta, buz üzerinde 20 dakika 365 nm UV ile hücreleri içeren çanağı aydınlatın.
5. T izole etmekÜreticinin protokolüne göre guanidinyum tiosiyanat-fenol-kloroform ekstraksiyonu ile HeLa hücrelerinden gelen otal RNA. RNA'yı oda sıcaklığında 30 dakika süreyle çöktürmek için 1: 1 hacim izopropanol ilave edin.
   Duraklama Noktası: RNA izopropanolde süresiz olarak -20 ° C'de saklanabilir. Biyotinile psoralen'in hücrelere başarıyla girdiğini ve in vivo çapraz bağlanmış RNA'lara sahip olduğunu kontrol etmek için bu adımda bir nokta leke yapılabilir ( Şekil 2 ).
6. RNA'yı kurtarmak için çökelen RNA'yı 20,000 xg'de 30 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve RNA yıkamak için RNA pelletine 1 mL% 70 soğuk etanol ilave edin.
7. Örnekleri 20,000 xg'de 15 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve pelleti oda sıcaklığında 5 dakika havayla kurutun.
8. RNA peletine nükleaz ücretsiz su ekleyin ve UV spektrometresi kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.
   Duraklama Noktası: RNA, f sonra -80 ° C'de saklanabilirSıvı nitrojende dondurma sıvısı.

2. RNA Parçalanması

1. 1 dakika süreyle 95 ° C'de 0.2 mL PCR tüplerinde tek tek 15 uL 2 x RNA parçalanma tamponu ve 10 μL RNA örneği (1 μg / μL) önceden ısıtın. Isıtılan 2x RNA parçalanma tamponunun 10 mcL'sini, aşağı yukarı pipetleme yapılarak 10 μL RNA örneği ile karıştırın. Numuneyi 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Reaksiyonu buz üzerine derhal soğutarak reaksiyonu durdurun.
2. 2 parçalanma reaksiyonunu bir 1.5 mL'lik mikrofuge tüpüne aktarın ve havuzlayın. Parçalanma reaksiyonuna, reaksiyona 40 uL nükleaz serbest su, 10 mcL 3 M sodyum asetat, 1 mcL glikojen ve 300 mcL% 100 etanol ilave edin. RNA'yı çöktürmek için RNA'yı -20 ° C'de en az 1 saat inkübe edin.
3. Çökeltilmiş RNA'yı 20,000 xg'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 1 mL% 70 etanol kullanarak RNA'yı yıkayın.
4. RNA'yı 20,000 xg'de 15 dakika boyunca santrifüj edin, remSüpernatantı boşaltın ve RNA'yı 20 μL nükleaz içermeyen suda eritin.

RNA Boyutu Seçimi ve Çözümü

1. Mikrofuge tüpünde bulunan RNA'ya 20 μL'lik RNA yükleme boyası ekleyin. RNA'yı RNA yükleme boyası ile 95 ° C'de 3 dakika ısıtın ve buz üzerinde 2 dakika boyunca yerleştirin.
2. Mikrofuge tüpünde 0.25 μL 10 nt DNA merdivenine 3 μL RNA yükleme boyası ekleyin. Merdiveni 95 ° C'de 3 dakika ısıtın ve buz üzerinde 2 dakika boyunca yerleştirin.
3. Dengelenmiş merdiveni ve örnekleri 8.6 cm x 6.8 cm'lik% 6 TBE üre jeline yükleyin ve 180 V'de 40 dakika süreyle elektroforez ile boyut fraksiyonlamaya tabi tutun. Jel, 5 dakika için 1: 10,000 nükleik asit jel lekesi içeren 10 mL TBE tamponu içinde boyayın. Dakika karanlıkta.
4. Altta 24 G'lik bir iğne kullanarak temiz 0.6 mL'lik bir mikrofuge tüpünü delin ve 2 mL'lik bir mikrofuge tüpüne yerleştirin.
5. Transilluminatör kullanarak boyanmış jel üzerinde bantları görselleştirin ve 90-11'e karşılık gelen bir jel dilimini kesin0 nt. Jel dilimini 2 mL mikrofuge tüpündeki delinmiş 0.6 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Bu boyut seçimi, şimerik fragmanların transkriptoma eşlenebilmesi için asgari bir uzunluğa sahip olmasını ve aşağı akış boyut seçme basamaklarında uzlaşmamış ürünlerle olan yakın bağlantılı ürünlerin ayırt edilmesini sağlamak için gerçekleştirilir.
6. Jel dilim parçalamak ve 2 ml mikrofuge tüp toplamak için 2 dakika oda sıcaklığında 12,000 xg'de jel dilimlerini santrifüjleyin. Boş 0.6 mL mikrofuge tüpünü atın. Tampon içine örneklerin difüzyonuna izin vermek için, 2 mL'lik mikro huni tüpündeki parçalanmış jel dilimine 700 uL elüsyon tamponu ekleyin ve 4 ° C'de sabit rotasyonla gece boyunca inkübe edin.
7. Jel dilimlerini ve elüsyon tamponunu bir santrifüj tüpü filtresine aktarın ve 20.000 xg'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Jel dilimleri, filtrenin üst bölmesinde sıkışacaktır. Jel dilimleri ve üst bölmeyi atın.
8. 1 μL glikojen ekleyin ve 7Mikrofüj tüpü içindeki süzüntüye% 100 izopropanol'den 00 μL ve RNA'yı -20 ° C'de en az 1 saat veya gece boyunca çöktürün.
   Duraklama Noktası: RNA, izopropanol içinde süresiz olarak -20 ° C'de çökeltilebilir.
9. RNA'yı kurtarmak için çökelen RNA'yı 20,000 xg'de 30 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve RNA pelletini yıkamak için 1 mL% 70 soğuk etanol ilave edin. Yıkanan pelet 20,000 xg'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
10. Yıkama tamponunu çıkarın ve RNA'yı tekrar süspansiyon haline getirmek için 20 uL nükleaz serbest su ekleyin. Bir UV spektrometresi kullanarak RNA konsantrasyonunu tayin edin.
    Duraklama Noktası: RNA, sıvı azotta hızlı dondurmadan sonra -80 ° C'de saklanabilir.

4. RNA Çapraz Bağlama Bölgelerinin Zenginleştirilmesi

1. Tüp içinde boncukları homojen olarak tekrar süspanse etmek için şiddetli bir şekilde Vorteks streptavidin kaplı manyetik boncuklar yapın. Boncukların 100 mcL'sini 1.5 mL mikrofüj tüpüne aktarın ve bir mıknatısın üzerine yerleştirinBoncukların tüpün manyetik tarafına yapışmasına izin vermek için 1 dakika boyunca bekletin. Depolama tamponunu boncuklardan dikkatlice çıkarın ve boruyu mıknatıs standının dışına çıkarın.
2. Mikrofüj tüpündeki boncuklara 1 mL Lizis Tamponu ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyin. Boncuk içeren mikrofüjeyi, boncukları yıkama tamponundan ayırmak için 1 dakika süreyle manyetik tezgah üzerine yerleştirin. Bunu toplam 3 yıkama için tekrarlayın.
3. Mikrofudu içeren boncukları manyetik standa 1 dakika boyunca yerleştirerek yıkama tamponunu boncuklardan çıkarın. Lizis tamponuna RNaz inhibitörü (1: 200) ekleyin ve mikrofuge tüpündeki yıkanmış boncuklara 100 μL liziz tamponu ekleyin.
4. 15 mL konik bir santrifüj tüpüne 2 mL taze hazırlanmış Hibritleme Tamponu, 1 mL eklenmiş liziz tamponu, 1.5 μg boyutlu fraksiyona RNA ve 100 uL tekrar süspansiyon haline getirilmiş boncuk ekleyin. Tortuyu hafifçe vorteksleyin.
5. 15 mL konik santrifüj tüpünü, uçtan uca rotasyonla 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.Yıkama tamponunu 37 ° C'de önceden ısıtın.
6. Boncukları tampondan ayırmak için 15 mL'lik konik santrifüj tüplerini 15 mL tüpler için manyetik bir stand üzerine 2 dakika boyunca yerleştirin. Tamponu pipetten dikkatlice pipetleyin ve atın.
7. Boncuklara 1 mL önceden ısıtılmış yıkama tamponu ilave edin, pipetle aşağı yukarı indirin ve boncukları 1.5 mL mikrofüj tüpüne aktarın. Boncuklarda uçtan uca rotasyonla 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
8. Mikrofüj tüpünün içeriğini kısaca santrifüjleyin. Boncukları yıkama tamponundan ayırmak için 1.5 mL yıkanmış boncukları mikrofuge tüplerine 1 dakika boyunca 2 mL'lik tüpler için manyetik bir tezgah üzerine yerleştirin. Mikrofüj tüpünün tamponunu yavaşça pipetleyerek boncuklardan tamponu çıkarın.
9. Boncuklara 1 mL önceden ısıtılmış yıkama tamponu ekleyin ve yıkamayı tekrarlamak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Toplam 5 yıkama yapın. ^5. yıkamanın sonunda, yıkama tamponunu, boncuk içeren mikrofüeyi mıknatıs standının üzerine yerleştirerek çıkarın1 dakika.

5. Yakınlık Bağlama

1. Yıkanan boncuklara 1 mL soğuk T4 polinükleotid kinaz (PNK) tamponu ilave edin ve uçtan uca dönme ile birlikte boncukları 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Boncukları içeren mikrofüj tüpünü 1 dakika süreyle manyetik şerit üzerine yerleştirin ve T4 PNK tamponu hafifçe çıkarın. Bu adımı toplam 2 kez tekrarlayın ve son yıkamadan sonra T4 PNK tamponunu çıkarın.
2. Tablo 1'e göre boncuklara tampon ekleyin. RNA fragmanının 3 'uçlarının aşağıdaki 3' adaptörlere bağlanmasını sağlamak için, RNA sonundaki 3 'siklik fosfat grubunu dönüştürmek için, boncukları 37 ° C'de sabit çalkantı ile 4 saat boyunca tamponda inkübe edin 3 'OH.
3. Tablo 2'ye göre önceki reaksiyona tampon ekleyin. RNA fragmanlarının 5 'ucunun yetkili ligasyon olmasını sağlamak için, tepkime 37 ° C'de ATP'nin varlığında sabit çalkalamayla 1 saat inkübe edin, RNA üzerindeki 5 'OH'yi 5' fosfata dönüştürmek için.
4. Proximity ligasyon gerçekleştirmek için önceki reaksiyona tampon ekleyin, Tablo 3'e göre . Reaksiyonu 16 ° C'de 16 saat sürekli ajitasyonla inkübe edin,
5. Ligatlanmış RNA içeren mikrofüjeyi 1 dakika mıknatıslı bir standın üzerine yerleştirin. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve boncuklara 1 mL oda sıcaklığında yıkama tamponu ekleyin. Pipetleme yaparak yukarı ve aşağı tekrar askıya alınız.
6. Mikrofüj tüpünü mıknatıs standının üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın. Toplam 2 yıkama yapın ve ikinci yıkamanın sonunda yıkama tamponunu boncuklardan çıkarın.
7. Boncuklara 100 μL RNA PK Tamponu ekleyin ve aşağı yukarı pipet ile tekrar süspansiyon haline getirin. Numuneleri bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın.
8. Numuneyi 1 dakika boyunca buzda soğutun ve numuneye 500 uL guanidinyum tiosiyanat-fenol-kloroform ekleyin. 10 saniye şiddetle vorteks vererek karıştırın. Karıştırmayı inkübe edinOda sıcaklığında 10 dakika bekletilir.
   Duraklama Noktası: RNA, bir kaç ay boyunca -80 ° C'de guanidinyum tiosiyanat-fenol-kloroform içinde depolanabilir.
9. Guanidinyum tiosiyanat-fenol-kloroform ekstrakte edilen örneklere 100 μL kloroform ekleyin. 10 saniye şiddetle vorteks uygulayın. Örnekleri 20,000 xg'de 15 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin.
10. Yeni bir 1.5 mL'lik mikrofuge tübüne 400 μL sulu tabaka aktarın. 800 μL (2 hacim)% 100 etanol ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
11. RNA çözeltisini RNA temizleme kolonlarına aktarın ve üreticinin talimatlarını izleyerek RNA'yı kurtarın, böylece küçük RNA'ların bile tutulmasını sağlayın. RNA 100 uL nükleaz içermeyen suda çözünür.
    Duraklama Noktası: RNA, sıvı azotta hızlı dondurmadan sonra -80 ° C'de saklanabilir.

6. Biyotinlenmiş Psoralen'in Tersine Çapraz Bağlanması

1. Elüe edilen numunelerin 100 uL'sini bir 24 oyuklu kuyucuğayemek yedi. Kapağı çıkarın ve numuneyi buz üzerinde 5 dakika UV 254 nm altında ışınlayın.
2. Ters çapraz bağlanmış örneği temiz bir mikrofuge tüpüne aktarın. 10 μL sodyum asetat, 1 μL glikojen ve 300 μL% 100 etanol ekleyin ve RNA'yı -20 ° C'de en az 1 saat boyunca veya gece boyunca çöktürün.
   Duraklama Noktası: RNA, etanol içerisinde -20 ° C'de sonsuza kadar çökeltilebilir.
3. RNA'yı kurtarmak için çökelen RNA'yı 20,000 xg'de 30 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve RNA pelletini yıkamak için 1 mL% 70 soğuk etanol ilave edin.
4. Yıkanan pelet 20,000 xg'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Yıkama tamponunu çıkarın ve RNA'yı tekrar süspanse etmek için 4.25 μL nükleaz serbest su ekleyin. RNA'yı 0.2 mL PCR tüpüne aktarın.
   Duraklama Noktası: RNA, sıvı azotta hızlı dondurmadan sonra -80 ° C'de saklanabilir.

7. Ters Transkripsiyon ve cDNA Daireselleştirme

1. 0.75 μL ekleRNA bağlayıcı (0.5 μg / μL) PCR tüp içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş örnek ve 80 santigrat derece 90 s ısı. Numuneyi 2 dakika buz üstünde bırakın.
2. Tamponları, Tablo 4'e göre 3 'adaptör ligasyonu için denatüre edilmiş numuneye ekleyin. Reaksiyonu 25 ° C'de 2.5 saat inkübe edin.
3. Reaksiyonu 1.5 mL'lik bir mikrofuge tüpüne aktarın. Reaksiyona 90 uL nükleaz içermeyen su ekleyin, ardından 10 μL sodyum asetat, 1 μL glikojen ve 300 μL% 100 etanol uygulayın. RNA'yı -20 ° C'de en az 1 saat veya gece boyunca çöktürün.
   Duraklama Noktası: RNA, etanol içerisinde -20 ° C'de sonsuza kadar çökeltilebilir.
4. RNA'yı kurtarmak için çökelen RNA'yı 20,000 xg'de 30 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve RNA pelletini yıkamak için 1 mL% 70 soğuk etanol ilave edin.
5. Yıkanan pelleti 20,000 g'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Yıkama tamponunu çıkartın, 5 uL nükleaz serbest bırakmak üzere pelet tekrar süspanse edin.onra.
6. Mikrofuge tüpünde bulunan RNA'ya 5 μL RNA yükleme boyası ekleyin. RNA'yı RNA yükleme boyası ile 95 ° C'de 3 dakika ısıtın ve buz üzerinde 2 dakika boyunca yerleştirin.
7. Mikrofuge tüpünde 0.25 μL 10 nt DNA merdivenine 3 μL RNA yükleme boyası ekleyin. Merdiveni 95 ° C'de 3 dakika ısıtın ve buz üzerinde 2 dakika boyunca yerleştirin.
8. Adım 3.3 ve 3.4'te olduğu gibi 8.6 cm x 6.8 cm% 6 TBE üre jel kullanarak boyut fraksiyonlamasını yapın.
9. Transilluminatör kullanarak nükleik asit lekesi ile boyanan jelin görüntüsünü alın ve merdivende 110-140 nt'luk bir jel dilimini kesin. Jel dilimini 2 mL mikrofüj tüpündeki delinmiş 0.6 ml mikrofüj tüpüne aktarın ve adım 3.6'dan 3.9'a kadar olan protokolü takip edin.
10. RNA peletini tekrar süspansiyon haline getirmek için 5 μL nükleaz serbest su ekleyin. RNA'yı 0.2 mL PCR tüpüne aktarın.
    Duraklama Noktası: RNA, sıvı azotta hızlı dondurmadan sonra -80 ° C'de saklanabilir.
11. 1,25 μl RT primerini ekleyin81; M PCR tüpünde RNA'ya sokulur ve 80 ° C'de 2 dakika ısıtılır. Numuneyi 2 dakika buz üstünde bırakın.
12. Tablo 5'e göre ters transkripsiyon için tamponları ekleyin. Reaksiyonu 50 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
13. Reaksiyona 1.1 uL 1 N NaOH ilave edin ve 20 dakika boyunca 98 ° C'de ısıtın. Reaksiyonu buz üzerine yerleştirin.
14. Reaksiyonu 1.5 mL'lik bir mikrofuge tüpüne aktarın. Reaksiyona 90 uL nükleaz içermeyen su ekleyin, ardından 10 μL sodyum asetat, 1 μL glikojen ve 300 μL% 100 etanol uygulayın. DNA'yı -20 ° C'de en az 1 saat veya gece boyunca çöktürün.
    Duraklama Noktası: DNA, etanol içerisinde -20 ° C'de sonsuza kadar çökeltilebilir.
15. Çökeltilmiş DNA'yı 20,000 g'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyerek DNA'yı kurtarın. Süpernatantı çıkarın ve DNA pelletini yıkamak için 1 mL% 70 soğuk etanol ekleyin. Yıkanan pelet 20,000 xg'de 15 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Yıkama tamponunu çıkartıp peleti tekrar süspanse edin5 μL nükleaz serbest su bırakın.
16. Adım 3.3 ve 3.4'te olduğu gibi 8.6 cm x 6.8 cm% 6 TBE üre jel kullanarak boyut fraksiyonlamasını yapın.
17. Transilluminatör kullanarak boyalı jelin görselleştirilmesi ve merdivende 200-240 nt'luk bir jel diliminin kesilmesi. Tersine transkripsiyona uğratılmış cDNA, şimdi 96 baz RT primerinin eklenmesinden dolayı RNA fragmanından 96 baz daha uzundur. Jel dilimini 2 mL mikrofuge tüpündeki delinmiş 0.6 mL mikrofüj tüpüne aktarın.
18. Jel dilim parçalamak ve 2 ml mikrofuge tüp toplamak için 2 dakika oda sıcaklığında 12,000 xg'de jel dilimlerini santrifüjleyin. Boş 0.6 mL mikrofuge tüpünü atın.
19. 2 mL microfuge tüp içinde rendelenmiş jel dilimine 700 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 37 ° C'de inkübe ederek sabit rotasyon ile 2 saat boyunca inkübe edin. 3.7- 3.8. Adımlarda açıklandığı gibi protokolü uygulayın.
20. DNA peletini tekrar süspansiyon haline getirmek için 6 uL nükleaz serbest su ekleyin. DNA'yı 0.2 mL PCR tüpüne aktarın.
    Duraklama Noktası: DNA, sıvı azotta hızlı dondurmadan sonra -80 ° C'de saklanabilir.
21. Tablo 6'ya göre tamponları cDNA dairesizleştirme tepkimesine ekleyin. Reaksiyonu 60 ° C'de 1 saat inkübe edin ve reaksiyonu inaktive etmek için 80 ° C'de 10 dakika ısıtın.
22. Reaksiyonu 1.5 mL'lik bir mikrofuge tüpüne aktarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA temizleme sütunu kullanarak dairesel hale getirilmiş cDNA'yı saflaştırın. Saflaştırılmış cDNA'yı çıkarmak için kolona 20 μL nükleaz serbest su ekleyin.
    Duraklama Noktası: DNA birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.

8. PCR Amplifikasyonu (Küçük Ölçekli PCR)

1. Kütüphane büyütme için gereken minimum döngü sayısını test etmek için PCR amplifikasyonu için Tablo 7'ye göre tamponları tepkimeye ekleyin.
2. Tablo 8'e göre PCR döngüsü koşullarını ayarlayın. Reaksiyonu durdurun ve 5 μLPCR reaksiyonu, 10, 15 ve 20 devirlerde, ayrı 1.5 mL mikrofuge tüplerine.
3. Farklı devirlerde 5 μL PCR reaksiyonunun her birine 1 μL 6x DNA jel yükleme boya ekleyin. PCR ürünlerini görselleştirmek için 1 saat boyunca 120 V'de% 3 agaroz jel üzerinde jel elektroforezi uygulayın.
   1. 250 baz civarında yükseltmeyi gösteren en düşük PCR döngü sayısını (Y) kullanın ( Şekil 3'te , 15 döngü amplifikasyon devresinde güçlü bir bant ve 10 döngüde hafif bir bant vardır. Büyük döngüsel PCR amplifikasyonunun 12 döngüsü olasıdır Kullanılan cDNA miktarı küçük ölçekli PCR amplifikasyonunun 10 katı olduğu için derin sekanslama için yeterli materyal üretir).

9. PCR Amplifikasyonu (Büyük Ölçekli PCR) ve Saflaştırma

1. Büyük ölçekli PCR için PCR amplifikasyonu için tamponları Tablo 9'a göre tepkimeye ekleyin.
2. PCR döngüsü koşullarını aşağıdakilere göre ayarlayın:Tablo 10 .
3. 5 μL 6x DNA jelini, PCR reaksiyonunun 25 μL'sine yükleyen boya ekleyin ve bir% 3 agaroz jel kuyusuna yerleştirin. 1 kb artı DNA merdivenini ayrı bir kuyuya yerleştirin. Jel elektroforezi 100 V'de, 1.5 saat boyunca uygulayın.
4. Tamamlanmış jel UV Transilluminator kullanarak görselleştirin.
5. Boyutu 200 - 300 bazlar arasında PCR ürünleri içeren bir jel dilim ayıklamak ve temiz 2 ml mikrofuge tüp jel aktarmak.
6. Jel dilimine bir DNA jel ekstraksiyon kitinden 1 mL jel çözünürlük tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin veya jel eriyene kadar sabit çalkalamaya devam edin.
7. Çözünmüş jel 200 mcL izopropanol ekleyin ve pipetleme ile iyi karıştırın. Örnekten 700 μL DNA jel ekstraksiyon temizleme sütununa aktarın ve 30 saniye süreyle 13.000 xg'de santrifüjleyin. Çözünmüş numuneyi tüm numune sütuna yüklenene kadar sütuna aktarmaya devam edin.
8. 500 uL jel çözünürlük tamponu ilave edin,Ardından üreticinin protokolüne göre kolona 700 uL kolon yıkama tamponu uygulandı. DNA'yı uzaklaştırmak için kolona ortasına 12 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. Duraklama Noktası: DNA, -20 ° C'de saklanabilir.
9. Florometrik kantifikasyon kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün. Sıralamada birden çok kütüphane yapılandırılıp bir araya getirilirse, yüksek verimli sıralama için havuza her numuneyi eşit miktarda ekleyin.

Sonuçlar

Şekil 1 SPLASH iş akışının şemasını göstermektedir. % 0.01'lik digitonin varlığında biotinile psoralen ilavesi üzerine ve UV çapraz bağlama, toplam RNA hücrelerden çıkarılır ve RNA'ya biotinlenmiş çapraz bağlanmanın etkin bir şekilde gerçekleştiğinden emin olmak için bir nokta blot yapılır ( Şekil 2 ). Hücrelere eklenecek biyotinile psoralen miktarını titre etmek için pozitif kontroll...

Tartışmalar

Burada, çift-bilge RNA etkileşimlerini genom çapında tanımlamamızı sağlayan bir yöntem olan SPLASH için deneysel ve hesaplamalı iş akışını detaylı olarak açıklıyoruz. Bakteri, maya ve insan kültürlerinde SPLASH'ı başarıyla kullandık ve stratejinin farklı hücresel koşullar altında çeşitli organizmalara yaygın olarak uygulanabileceğini öngörüyoruz. Protokoldeki kritik adımlardan biri, aşağı akış süreçleri için yeterli materyali elde etmek için en az 20 μg çapraz bağlan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20% SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG