JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bir transgenik fare, T hücresi reseptörüne bağlanan bir 64Cu-modifiye edilmiş monoklonal antikorun hazırlanmasını takiben, T hücreleri, canlılık, fonksiyonellik, etiketleme stabilitesi ve apoptoz için analiz, in vivo olarak radyoaktif işaretli olan ve adoptif bir nefes yolu gecikmeli tipte aşırı duyarlılık ile farelere aktarıldı pozitron emisyon tomografisi / bilgisayarlı tomografi (PET / BT) ile invazif olmayan görüntüleme için reaksiyon.

Özet

Bu protokol, 64Cu üretimini ve kemirgen lenfosit hücre kültürü ve hücre hedefleme 64Cu-reseptörün ardından bir monoklonal antikor (mAb) şelatlayıcı çekimi / Radyo-etiketlenmesi göstermektedir. PET / CT ile bir hava yolu gecikmiş tip aşın duyarlılık reaksiyonunda (DTHR) bir hayvan modelinde radyo-etiket, ve in vivo hücre takibi yayılmayan açıklanmaktadır in vitro değerlendirilmesi.

Ayrıntılı olarak, şelatlayıcı 1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetik asit (DOTA) bir mAb konjugasyon gösterilmiştir. Radyoaktif 64 Cu, DOTA-konjuge mAb'nin radyoaktif üretimini sonra tarif edilmektedir. Daha sonra, tavuk ovalbumin (cova) e özgü CD4 + interferon genişlemesi (IFN) -γ-üreten T yardımcı hücreleri (cova-TH1) ve cova-TH1 hücrelerinin daha sonra, radyo-etiketleme olarak gösterilmiştir. Çeşitli in vitro teknikler ef değerlendirmek için sunulmuşturtripan mavi dışlama hücre canlılığının belirlenmesi, akış sitometrisi için Annexin V ile apoptosis için boyama ve IFN-γ enzime bağlı immünosorban tahliliyle özelliklerin değerlendirilmesi gibi hücreler üzerinde 64Cu-radyo sınıflandırılmasıyla tama yaptığı, (ELISA) . Bundan başka, hücre içine radyoaktivite alımının ve markalama kararlılığının belirlenmesi detaylı olarak tarif edilmektedir. Bu protokol daha nedenle, BALB / c farelerinde cova kaynaklı akut solunum yolu DHTR indüksiyonu dahil, bir hava yolu DTHR için bir hayvan modeli olarak, hücre izleme çalışmaları yapmak ve açıklamaktadır. Son olarak, görüntü elde etme, yeniden yapılanma, ve analizi dahil sağlam PET / BT iş akışı sunulmuştur.

Daha sonra alıcı içselleştirme 64 Cu-antikor reseptörü hedefleyen bir yaklaşım, hücre etiketlenmesi için ortak PET izleyiciler kıyasla yüksek spesifite ve stabilite, düşük hücre toksisitesi ve düşük akış oranlarını sağlar, örneğin, 64Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Son olarak, yaklaşım, 48 saat için optimum sinyal-zemin oranı PET / CT ile in vivo hücre takibi yayılmayan sağlar. Bu deneysel yaklaşım içselleştirilir membrana bağlı reseptör ile hayvan modelleri ve hücre tipleri farklı transfer edilebilir.

Giriş

Invazif olmayan hücre takibi, in vivo olarak, hücre fonksiyonu, göç ve homing izlemek için çok yönlü bir araçtır. Son hücre takibi çalışmaları rejeneratif tıpta, kanser, 3, 4 karşı adoptif hücre tedavileri enflamasyonun veya T lenfositleri otolog periferik beyaz kan hücreleri bağlamında mesenkimal 1, 2 ya da kemik iliği kökenli kök hücreleri 3 üzerine odaklanmıştır. eylem siteleri ve hücre tabanlı tedaviler yatan biyolojik ilkelerin aydınlatılması muazzam öneme sahiptir. CD8 + sitotoksik T lenfositleri, genetik olarak yaygın altın standart olarak kabul edilmiştir kimerik antijen reseptörü (CAR), T hücreleri ya da tümör infiltre edici lenfositler (TILler) tasarlanmıştır. Bununla birlikte, tümör bağlantılı antijen-spesifik Th1 hücrelerinin bir tedavi seçeneği 4, olduğu kanıtlanmıştır/ sup> 5, 6, 7.

Anahtar iltihaplanmada oyuncuların organa özgü otoimmün bir hastalık (örneğin, romatoid artrit veya bronşiyal astım) ve kanser immünoterapisi yüksek ilgi hücreleri gibi, TH1 hücre zamansal dağılımı ve yerleşme kalıpları karakterize etmek için önemlidir. PET ile invaziv olmayan in vivo görüntüleme in vivo hominginde, hücre göçü modellerini incelemek için bir nicel, çok hassas bir yöntem 8. sunulur, ve iltihap, alerji, enfeksiyon ya da tümör rejeksiyon 9, 10, 11 sırasında T hücresi eylem ve tepkilerinin siteleri.

Klinik olarak, In-oksin 111 2-deoksi-2- (18 ise, iltihap ve enfeksiyon 12 ayrımı için lökosit sintigrafisi için kullanılırF)-floro-D-glükoz (18F-FDG) genellikle PET 3, 13 ile hücre izleme çalışmaları için kullanılır. Bu PET tracer önemli bir dezavantajı, ancak, 109.7 dk'da radyonüklid 18F ve daha sonraki zaman noktalarında görüntüleme adoptif hücre transferi sonrası engelleyen düşük hücre içi stabilite kısa yarılanma ömrü. Hücrelerde kararsız olmasına rağmen, 64Cu-PTSM sık sık kullanılan PET ile in vivo hücre takibi çalışmalarında uzun vadede için, spesifik olmayan bir hücre 14, T hücre canlılığı üzerindeki minimize zararlı etkiler ile 15 etiket ve 16 işlev görmektedir.

Bu protokol, ayrıca bir T hücre reseptörü (TCR) e özgü radyo-etiketli mAb kullanılarak hücre canlılığı ve işlevi üzerinde dezavantajlı etkileri azaltmak için bir yöntemi tarif etmektedir. İlk olarak, radyoizotop 64 Cu, inci ile mAb KJ1-26 konjüge üretimiE şelatör DOTA, ve daha sonra 64 Cu, radyo-etiketleme gösterilmiştir. İkinci bir aşamada, izolasyon ve DO11.10 donör farelerin cova-TH1 hücrelerinin genişlemesi ve 64Cu yüklü DOTA-konjuge mAb KJ1-26 (64Cu-DOTA-KJ1-26) ile radyo işaretli ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Uptake'leri ve bir doz kalibratörle radyoaktivite efflux sırasıyla y-sayımı ile değerlendirme, hem de IFN-y ELISA ile sunulmuştur tripan mavi dışlama ve işlevselliği ile hücre canlılığı üzerindeki 64Cu-radyoaktif etkilerinin değerlendirilmesi . In vivo hücre takibi yayılmayan için adoptif hücre transferi sonrası PET / CT tarafından cova kaynaklı akut solunum yolu DTHR ve görüntü elde olan bir fare modeli ortaya çıkarma açıklanmaktadır.

Ayrıca, bu markalama yaklaşım, farklı hastalık modellerinde farklı TCRler veya membrana bağlı reseptörlere veya ekspresyon mar ile ilgili genel hücreleri ile fare T hücreleri aktarılabilirkers sürekli zar 17 mekik yatan.

Protokol

Güvenlik önlemleri: radyoaktivite kullanırken, 2-inç kalınlığında kurşun tuğla arkasında 64 Cu depolamak ve aktivitesini taşıyan gemiler için ilgili ekranlama kullanın. dolaylı dolaysız el temasını önlemek ve radyoaktif madde maruziyeti en aza indirmek için korumasız kaynaklar işlemek için uygun araçları kullanın. Her zaman radyasyon dozimetre izleme rozetleri ve kişisel koruma ekipmanları giymek ve kendini kontrol ve kirlenme için çalışma alanı hemen ele almak. önce radyoaktif madde kullanılır bölgeyi terk etmek potansiyel olarak kirlenmiş kişisel koruma ekipmanı atın. Radyoaktif 64Cu yeterli bertaraf edilmeden önce (yaklaşık 10 yarı-ömürleri, = 127 h) çürümüş kadar kurşun koruyucu örtünün arkasına tüm radyoaktif atık saklayın.

1. 64 Cu Üretim

Not: 64Cu 64 Ni (p, n) 64Cu nükleer reaksiyon, bir PETT kullanılarak üretilmiş olan radyoizotopMcCarthy ve arkadaşlarının modifiye edilmiş bir protokole göre yarış siklotron. 18.

  1. 64Cu üretimi için, 12.4 MeV bir proton demeti ile 6 saat boyunca 30 uA olan bir platin / iridyum plakasına (90/10) üzerine elektroliz 64 Ni, ışınlanması.
  2. Özel bir polietereterketon (PEEK) bölmesi içinde 100 ° C'ye kadar, platin / iridyum hedef ısıtın ve 64 Cu / 64 Ni çözünmesi için 20 dakika boyunca konsantre HCI 2 mL inkübe edin.
  3. konsantre HCI başka 1 mL ekleyin ve 10 dakika kuluçkada bırakın.
  4. bir argon akışı kullanılarak HCI buharlaştırın ve oda sıcaklığına bölmeyi soğutmak.
  5. % 4, 0.2 M HCI ve% 96 metanol (hac / hac), 3 mL odasını yıkayın ve olduğu bir iyon değişim sütununa bu çözüm transferi en az 15 dakika boyunca metanol içinde% 4, 0.2 M HCI ile ön işleme tabi. Akış 64 Ni geri dönüşüm için kullanılabilir.
  6. 64Cu% 4, 0.2 M HCI i ile kolon içinde alıkonur yıkayınn, metanol.
  7. Bir toplama şişe içine% 70 ile 64 CU 1.3 M HCI /% 30 izopropanol (h / h) Zehir, bir argon akımında solüsyonu buharlaştırarak ve oda sıcaklığına soğutun şişe sağlar.
  8. 0.1 M HCI 140-210 uL 64 Cu çözülür.

DOTA 2. Antikor çekimi ve sonraki 64 Cu-radyo işaretli

Not: şelatlayıcı DOTA, N-hidroksisüksinimid (NHS) ester kimyası ile mAb fonksiyonel amino grupları ile bağlantılı olacak ve konjügat daha sonra 64 Cu 19 ile radyoaktif olarak işaretlendi olacaktır.

  1. (8 mg / ml olacak şekilde KJ1-26-mAb konsantrasyonu ayarlamak ve diafiltrate 1 ml mAb 1.2 g, molekül ağırlığı ile bir kenetleme iyon değiştirme reçinesi / L ile muamele 0.1 M Na 2 HPO 4, pH 7.5'e karşı çözelti kesilmiş MWCO 30 kDa) santrifüj filtre ünitesi. tampon 14 mL 3 müteakip yıkama adımları uygulanır. Son yıkama aşamasından sonra,1 mL tekrar çözelti konsantre edilir. OD 280nm ölçümleri ile antikor konsantrasyonunu ölçmek.
  2. 10 mg / ml hemen önce kullanım konsantrasyonunda ultra saf ya da PCR dereceli su içerisinde DOTA-NHS çözeltisi hazırlayın. Şişe su yoğuşmayı önlemek için açıklığın önce oda sıcaklığına ayarlayın ve dikkatli bir şekilde plastik bir spatula kullanılarak, DOTA-NHS kaldırmak olsun. , Diya-filtreden KJ1-26 mAb çözeltisi 8 mg bu DOTA-NHS çözeltisi 216 uL ekleyin iyice karıştırın ve bir döner karıştırıcı üzerinde 4 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edilir.
  3. kesmeyle bir moleküler ağırlığa (MWCO 30 kDa), santrifüj filtre birimi kullanılarak, bir kenetleme iyon değiştirme reçinesi, 1.2 g / L ile muamele 0.25 M amonyum asetat, pH 7.0, karşısında DOTA-KJ1-26-mAb Diafiltrate. 7 yıkama adımları uygulanır. 1 ml'lik bir son hacme kadar mAb konsantre edilir ve tekrar OD 280nm ölçümleri ile protein konsantrasyonu ölçülür.
  4. Radyoaktif önce, boyut exc ile PBS'ye DOTA-KJ1-26-mAb tampon alışverişijel filtrasyonu sütunu kullanılarak lusion kromatografisi. Bu, aynı zamanda, potansiyel küçük moleküllü yabancı maddeleri temizler.
  5. 10 mM HCl 100 MBq 64 CuCl2 çözelti hazırlanır ve 10x PBS ile pH'ı 6-7'ye ayarlamak. DOTA-KJ1-26-mAb 200 mikrogram ekleyin. 37 ° C'de 60 dakika süreyle inkübe edilir.
  6. Kalite kontrolü için, mobil faz olarak 0.1 M sodyum sitrat (pH 5) ile ince tabaka kromatografisi gerçekleştirmek ve otoradyografi ile analiz edin. En azından aktivitesinde% 90 antikora bağlı olması ve bu nedenle başlangıç ​​noktada tespit edilebilir. Bağlanmamış aktivitesi çözücü ön sitrat bazlı mobil faz ve çizgiler ile kenetlenmiştir. Bir Referans için, 64 CuCI 2'nin kullanılması tavsiye edilir.

3. tavuk ovalbumin-spesifik Th1 (cova-TH1) Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Not: TH1 hücrelerinin kültür, 17 daha önce yayınlanmış çalışmalar 16'ya göre tarif edilmektedir.

  1. Dalakları ve DO11.10 farelerden periton lenf düğümleri (LN) izole edilir.
    1. federal düzenlemelere göre fare Kurban. % 70 etanol ile hayvan dezenfekte ve dalak ve LN çıkarılması için yapışkan bantla sabitleştirmek. Bir medyan kesi yapın ve yanal her siteye çekerek periton cilt ayırmak.
    2. servikal, eksensel, brakial ve inguinal LN bulun. künt forseps ile çıkarın ve% 1 fetal buzağı serumu (FCS) / PBS tamponu içine yerleştirin.
    3. periton açın ve dalak bulun. Pankreas bağ dokusu dalak ayrılır ve% 1 FCS / PBS tamponu içinde yerleştirin. Daha fazla rehberlik için, referanslar 20,21 bakın.
  2. 50 mL'lik bir 40 um'lik bir filtreden kıyma dalak ve lenf nodları bir şırınga pistonu kullanarak vida başlıklı bir tüp. 10 mL% 1 FCS / PBS-tamponu ile durulayın.
  3. 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve supernatant çıkarın. Subsequently'ait, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca amonyum-klorür-potasyum (ACK) liziz tamponu (donör hayvan başına 1.5 mL) ilave edilerek eritrositlerin liziz gerçekleştirin. (Donör hayvan başına) 8.5 mL% 1 FCS / PBS-tamponu ilave edin.
  4. 5 dakika boyunca 400 x g'de hücreler santrifüj ve supernatant çıkarın. 5 dakika boyunca 400 x g'de, 10 mL% 1 FCS / PBS-tamponu içinde santrifüj hücreleri yıkanır ve supernatant çıkarın.
  5. Manyetik hücre ayrılması için,% 1 FCS / PBS-tamponu içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve CD4 + mikroboncuklar ekleyin. Tampon hacmi ve kullanımı CD4 + mikro boncuklar miktarı için üreticinin talimatlarına bakın.
  6. 4 ° C'de 20 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra,% 1 FCS / ekleme, 50 mL kadar PBS-tampon, 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri ve supernatant çıkarın.
  7. Ticari manyetik ayırma kolonları ve üreticinin protokolüne uygun olarak bir ilgili mıknatıs standı kullanılarak CD4 + T hücresi izolasyon devam edin. Bir yardımcı elüe CD4 + T hücreleri ayarlama% 10 ısıyla inaktive edilmiş FCS% 2.5 Penisilin / Streptomisin,% 1 HEPES tamponu,% 1 MEM amino asitler,% 1 sodyum piruvat ve% 0.2 2-mersaptoetanol ve mağaza ile Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı içinde ncentration 10 6 hücre / mL bunları 4 ° C'de ilave edildi.
  8. antijen sunan hücreler (APCler) hazırlamak için 50 mL vida kapaklı bir tüp içerisinde kolon akıntısı toplayın. 5 dakika boyunca 400 x g'de kolon akıntısı santrifüj ve supernatant çıkarın.
  9. , 10 ug / ml anti-CD8 (klon: 5367,2) ve 10 ug / mL fare anti-sıçan mAb (MAR18.5) ve 1.5 ml tavşan tamamlayıcı: 10 ug / ml anti-CD4 (klon GK1.5) ekleyin. 37 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe edilir.
  10. 5 dakika boyunca 400 x g'de hücreleri Santrifüj süpernatantı kaldırmak ve 3 mL orta ekleyin. toplam 30 Gy ile γ-ışını ya da x-ışını kaynağı ile APC'leri ışın tedavisi. Daha sonra, 5 x 10 6 hücre / mL konsantrasyonda APC'leri ayarlayın.
  11. 96 çukurlu bir pla 100 uL, CD4 + T hücreleri ve APC '100 mcLte birlikte 10 ug / mL cOVA 323-339-peptid, 10 ug / mL anti-IL-4-mAb, 0.3 uM CPG1668-oligonükleotitler ve 5 U / ml IL-2 ile.
  12. 50 U / ml IL-2 her iki günde bir ekleyin. Sonra 3 - 4 gün, 24 oyuklu plakalara 96 ​​oyuklu plakalar hücreleri aktarın. 24 oyuklu bir plaka üzerinde, bir oyuk 96 oyuklu plaka 3-5 kuyu birleştirin. 1: 1 oranında 100 U / ml IL-2 içeren ortam ekleyin.
  13. 2-3 gün daha sonra 175 cm2 hücre kültürü şişeleri (kap başına 1 x 48-yuvalı plaka) 48 gözlü levhadan hücreleri transferi. 1: 1 oranında ortam ile doldurun. 50 U / ml IL-2 her iki günde bir ekleyin.
  14. hücre yoğunluğuna göre hücreler bölme ve 50 U / ml IL-2, her iki gün ekleyin. Bu şekilde, kültür başka bir 10 gün süreyle hücreleri.

4. cova-TH1 hücre radyo-etiketlenmesi,

Not: 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb hücre içi radyoaktif etiketleme sağlamak için kültürlenmiş cova-, TH1 hücreleri ile uygulanacaktır.

  1. Cova-TH1 ce içinll radyoaktif işaretleme, bir doz kalibratörü ile ölü hacim olmayan bir şırınga içinde radyo etiketli 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb 37 MBq çizin. 37 MBq / ml solüsyon almak için 1 ml tuzlu su ekleyin.
  2. 2 x 10 6 hücre / mL ortam içinde cova-TH1 hücreleri süspansiyon halinde tutulur ve bir 48-kuyulu bir levhadaki her kuyuya, hücre süspansiyonu, 0.5 ml.
  3. Yeni hazırlanmış 37 MBq 20 mcL / ml 64 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, Cu-DOTA-KJ1-26 mAb çözeltisi. Etiketleme için nihai oran 520 uL'lik bir hacim içinde 10 6 hücre başına 0.7 MBq olup. 30 dakika boyunca CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 7.5.
  4. İnkübasyondan sonra, dikkatli bir şekilde her bir hücrelerin tekrar süspansiyon ve 50 mL'lik 48 gözlü levhadan hücre süspansiyonu transfer vida başlıklı bir tüp. hücre kaybını en aza indirmek için, önceden ısıtılmış ortam maddesi ile iyice her yıkayın.
  5. 5 dakika boyunca 400 x g'de cova-TH1 hücre süspansiyonu santrifüj supernatant atmak ve ml PBS önceden ısıtılmış 10 hücreleri tekrar süspansiyon. bir a kaldırmaHücre sayımı için hücre süspansiyonu liquot. Yıkama adımı tekrar edin.
  6. Tripan mavisi ile, uygun bir seyreltme viyabl cova-TH1 hücreleri sayın.
  7. 5 x 10 7 hücreleri hücre konsantrasyonunu ayarlamak / ml 200 uL PBS içerisinde 10 7 hücre intraperitonal (ip) olarak enjeksiyon için.
  8. Tekrar, örneğin etkinlik miktarda, 1.4 MBq veya 10 6 hücre başına 2.1 MBq artan cova-TH1 hücreleri radyolabel 4.3-4.5 adımları tekrarlayın.
    1. 10 6 hücre başına 1.4 MBq ile hücreler radyolabel, 10 6 hücre başına 2.1 MBq ile radyo-etiketleme için 37 MBq / ml 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb çözeltisi ve 60 uL 40 uL kullanımı. 0.7 MBq, 1.4 MBq ve 2.1 64Cu-PTSM MBq ile adımları 4.3-4.7 gerçekleştirmek ancak karşılaştırma araştırmaların 17 için 3 saat için etiketleme süresi artar.
    2. faaliyetin en iyi miktarını belirlemek için adım 5'e geçin.

Cova-, Th1 hücreleri üzerinde radyo-etiket Etkisinin Değerlendirilmesi İn Vitro 5.

NOT: Th1 hücreleri üzerinde radyo-etkilerini karakterize canlılığı tripan mavisi eksklüzyon tahlili ile gerçekleştirilir, apoptoz 16, 17 uyarılması için işlevsellik değerlendirme ve PE-Annexin V boyaması için ELISA IFN-y. hücre içi alımı ve radyoaktivite dışa akımı tayini aynı zamanda, aşağıda tarif edilmektedir. Karşılaştırma olarak, 64Cu-PTSM etiketli cova-TH1 hücreleri de kullanılabilir.

  1. Tripan mavi dışlama canlılığı üzerindeki etki
    1. 2 x 10 6 hücre / mL 'lik bir konsantrasyona, sırasıyla 0.7 MBq / 10 6 hücre, 1.4 MBq / 10 6 hücre ve 2.1 MBq / 10 6 hücre ile radyo-etiketli en az 18 x 10 6 cova-TH1 hücreleri ayarlamak ve 5.1 adımları. her faaliyet dozu 2-5.1.7. olmayan radioacti kullanınKJ1-26-mAb denetimleri gibi Cova-TH1 hücreleri ve etiketsiz Cova-TH1 hücreleri etiketli ettik.
    2. 24 kuyucuklu bir plakanın 9 kuyu içine hücre çözeltisinin pipetleyin 1 ml.
    3. Ayrı 15 ml kap tüpleri, ilk radyoaktif 3 saat sonra vida 3'e 3 kuyu içeriğini toplamak.
    4. Hücre kaybı en aza indirmek ve ilgili 15 mL ortam ilave adım 5.1.3 başlığın tüpleri vida önceden ısıtılmış ortam ile artık boş kuyu durulayın.
    5. 5 dakika boyunca 400 x g'de 15 ml tüpler santrifüj ve önceden ısıtılmış bir ortamda 1 mL çıkan hücre pelletini.
    6. Her bir 15 ml tüp için ayrı ayrı tripan mavisi içinde uygulanabilir ve ölü hücreleri sayın ve yaşayabilir hücrelerin yüzdesi hesaplanır.
    7. Tekrar 5.1.3-5.1.6 24 ve 48 saat sonra 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb radyo işaretleme adımları tekrarlayın.
  2. Işlevselliği üzerindeki etkisi, IFN-y ELISA ile tespit
    NOT: IFN-γ productio 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radyoetiketin etkisini değerlendirmek içinn, işlevselliği bir işaretleyici olarak, ticari bir tedarikçiden bir IFN-γ ELISA'yı gerçekleştirmek ve daha fazla ayrıntı için 17 referans bakın.
    1. 96 oyuklu bir plaka, 3 saat sonra 64 0.7 MBq, 1.4 MBq veya 2.1 MBq ile cova-TH1 hücrelerinin Cu-DOTA-KJ1-26 radyo işaretleme, ortamın 100 uL 10 5 canlı hücreleri dağıtılır. Kontroller olarak etiketsiz, radyoaktif olmayan KJ1-26-mAb etiketli veya 64 Cu-PTSM etiketli Cova-TH1 hücreleri kullanın.
    2. / Ml 5 U / ml IL-2 ve 5x10 5 APCler 100 cova peptit, 10 ug 100 uL ortam içinde 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücrelerinde IFN-γ üretimini teşvik 37 ° C'de 24 saat boyunca, orta ve% 7.5 CO2 uL. Daha fazla kontrol cova peptit ilavesi olmadan diğer koşullar olabilir.
    3. Üreticinin talimatlarına göre ELISA ile süpernatant analiz edin.
    4. Adımı tekrarlayın 5.2.2. 5.2.3 için. etiketleme işleminden sonra, 24 ve 48 saat ısıtıldı.
  3. Akış sitometrisi için PE-Annexin V boyanması yolu ile tayin apoptosis
    NOT: hücre membranında fosfatidil serin maruz için Annexin V ile boyamadan önce, imalatçının talimatlarına uygun olarak, 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb radyo-apoptoz indüksiyonunu değerlendirmek akış sitometrisi için ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanımı ve hücre örnekleri hazırlamak için .
    1. 3, 24 ve 48 saat sonra 64 cova-TH1 hücrelerinin Cu-DOTA-KJ1-26 mAb, radyo-etiketleme, en az 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücreleri ile leke üç kopya halinde de ve üretici talimatlarına göre Annexin V seti bir saat içinde analiz eder. Kontrolleri gibi radyoaktif KJ1-26-mAb etiketli, 64 Cu-PTSM etiketli ve etiketsiz Cova-TH1 hücreleri kullanın. Daha fazla detay için 17 başvuru bakınız.
  4. Alım ve dışa akım
    NOT: 64 Cu-DOTA- alımıhücrelere KJ1-26-mAb dozu kalibratördeki ölçülür ve radyoaktivite akış bir γ-sayma deneyi 0, 5, 24 ölçülür ve radyoaktif 48 saat sonra.
    1. 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücrelerinin, ilgili yüzer tabakanın ve yıkama basamağı için on γ-sayım tüpler her hazırlayın.
    2. 6 64 Transferi 10 direkt olarak, radyo-etiketleme sonra on γ-sayım tüplerin her birine orta 1 mL cova-TH1 hücreleri Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli. Zaman noktalarında 5, 24 ve radyoaktif 48 saat sonra her biri için, 37 ° C'da bir kuluçka makinesi içinde, 24 gözlü hücre kültür levhaları üzerinde ortam içinde en az 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücreleri tutmak ° C ve% 7.5 CO2.
    3. 5 dakika boyunca 400 x g'de γ-sayım tüpleri santrifüj ve on yeni γ-sayma tüplerine süpernatant aktarın.
    4. 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb An bağlanmamış bölümünü çıkarmak için 1 ml ortamda bir kez hücre yıkayınon yeni γ-sayma tüplerine supernatant toplamak d.
    5. cova-, TH1 hücreleri ile 1 ml yeni ortamı ilave edin ve bir doz kalibratördeki ilk çekme değerinin belirlenmesi. Borular, aynı zamanda CO2, 37 ° C'de bir inkübatör içinde depolanır ve% 7.5 olabilir.
    6. Tekrar üretici protokolüne göre bir γ-sayacında tüpleri 5, 24 ve 48 saat sonra 5.4.5 ve ölçmek için 5.4.2 adımları tekrarlayın. radyoaktif bozunma ve kantitatif analiz için düzeltmek için, radyoaktivite, belirli bir dozdaki bir standart kullanır.

6. Akut Solunum Yolu DTHR OVA-kaynaklı

Not: Göç dinamikleri ve inflamasyon bölgesine adoptif transfer edilir ve radyo-etiketli cova-TH1 hücrelerinin hedef arama desenler görünür hale getirildi ve cova ile indüklenmiş solunum yolları-DTHR 16, 17 için bir hayvan modeli olarak hesaplanacaktır.

  1. 8 haftalık BALB / c fareleri enjekte 150 uL al oluşan bir karışım ile ipuminum jeli / 50 uL cova-çözeltisi (50 uL PBS içinde 10 ug) fareleri immünize etmek üzere.
  2. İki hafta immünizasyondan sonra, ip enjeksiyonu ile 100 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin ile anestezi fareler. sırtlarında deney fareler yerleştirin ve yavaş yavaş hayvanların burun deliklerine 50 uL PBS içinde çözülmüş 100 ug cova pipetleyin. hayvanlar damla çözüm damla teneffüs edecektir.
  3. 24 saat sonra tekrarlayın. Güçlü hava yolu DTHR indüksiyonların için, 48 saat sonra yeniden tekrarlayın.
  4. transfer cova-TH1 hücrelerinin spesifik taşıma analiz etmek için, kontrol olarak hindi veya sülün-OVA ile hava yolu DTHR indükler. Bu nedenle, tekrar, ilgili OVA-protein kullanılarak 6.1-6.3 adımları tekrarlayın.

PET / BT kullanarak Canlı Üzerinde Görüntüleme 7.

Not: cova-DTHR 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücrelerinin in vivo görüntülemede hastalıklı fareleri ve kontrol litermatlarının belirli homing ve mil gösteriyorcova-TH1 hücrelerinin Entegrasyonu'dur dinamiği. Bu nedenle, statik PET görüntüleri ve anatomik BT sırasıyla 3, 24 ve 48 saat sonra adoptif hücre transferi tarar.

  1. Doğrudan radyoaktif sonra, 200 uL, 10 7 hücre ip enjeksiyonu için, 5 x 10 7 hücre / mL'ye 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücreleri ayarlayın.
  2. 1 ml şırınga ve bir tane 30-gauge iğne kullanılarak, 64Cu-DOTA-KJ1-26 mAb etiketli cova-TH1 hücre süspansiyonu, 200 uL çekmek ve hücreler, 4 ila cova-DTHR-hastalıklı hayvanların içine ip enjekte ve 5. meme. toplam radyoaktivite enjekte miktarını belirlemek için, önce ve enjeksiyondan sonra bir doz kalibratördeki şırınga ölçer.
  3. sıcaklık kontrollü bir anestezi kutusunda:% 100 oksijen% 1.5 izofluran ile, fareler, önce arzu edilen madde alımı zamana 10 dakika anestezisi (0.7 L / dakika akış hızı).
  4. Bu arada, birlikte kaydedilmesini kolaylaştırmak içingörüntü analizi sırasında PET ve BT görüntüleri, fare yatağın altında 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb çözelti veya serbest 64 CuCl2 çözeltisi ihtiva eden bir cam kılcal düzeltin.
    1. Bu nedenle, 0.37 MBq / mL'lik bir çözelti hazırlamak ve bu çözeltiye, 10 uL hacimde cam kılcal doldurun. hücre kökenli radyoaktivite sinyalleri doğal olarak zayıf olduğu için, belirteçler farelerde hücre kökenli sinyallere müdahale olmadığından emin olmak için yüksek aktivite miktarda kullanmayın.
  5. Cerrahi tolerans ulaştıktan sonra, arka bacak pedalı geri çekme refleksi kaybı ile gösterildiği gibi, anesteziyi muhafaza etmek üzere, uygun bir boru sistemi ile donatılmış bir PET ve BT uyumlu küçük hayvan yatağa fare aktarın.
  6. Pamuklu çubuk ve cerrahi bant kullanarak küçük hayvan yatağı üzerinde fareyi hareketsiz. gözlerin kurumasını önlemek için göz merhemi sürün.
  7. PET tarayıcı fare yatak aktarın bir Focu ile görüş alanını ortalamakakciğer ile ilgili ve 350-650 keV bir enerji penceresi ile 20 dk statik PET tarama kazanır.
  8. CT tarayıcıya fare yatak aktarın. İzci görünümü sayesinde, akciğerler üzerinde görüş alanını ortalamak. bir fuar 350 ms'lik zaman ve faktör 4 kümeleştirme ile "aşaması ve filiz" modunda 360 ° dönüşü sırasında 360 parçalan üzerinden düzlemsel bir CT görüntüsünün elde edin.

8. Resim Analizi

  1. 75 um piksel boyutu ile 3 boyutlu bir görüntü halinde istatistiksel yinelemeli sıralı alt kümesi beklenti en (OSEM) 2D algoritmasını ve BT taramaları uygulanarak PET listesi modu verileri yeniden yapılandırma.
  2. Uygun bir görüntü analiz yazılımı görüntü birlikte kaydedilmesi (örneğin Inveon Araştırma İşyeri veya PMOD) için, otomatik birlikte kayıt aracını kullanın. Bu başarısız olursa, aksiyel, koronal ve sagittal görünümde mekansal yeniden PET ve BT görüntüleri birlikte kaydetmek için yol gösterici olarak fare yatağın altında cam kılcal kullanın.
  3. PET görüntüleri düzeltinradyoaktif bozunma kanun ve 12.7 h radyonüklid 64 Cu yarı süresi kullanılarak radyoaktif bozunma için. görüntü normalleştirme için, bir referans olarak bir resim (A) tercih ve ilgili görüntü analiz yazılımı görüntü ekranı yoğunluğunu ayarlayın.
    1. ((Enjekte edilen aktivite (X) / enjekte aktivitesi: diğer görüntüler sadece referans görüntü (A) için belirlenen değerler, enjekte faaliyeti (A) ve enjekte edilen aktiviteyi (X), aşağıdaki denklem kullanılarak, diğer görüntü normalize kullanılması A)) x yoğunluk değerlerinin (A).
  4. pulmoner ve perithymic LN normalleştirilmiş PET sinyali faiz (VOI) 3D hacimleri çizin.
  5. Cm3 (% ID / cm3), aşağıdaki denklem kullanılarak yüzde oranı enjekte edilen doz belirleme: (farede VOI / toplam aktiviteye bir etkinlik anlamına), referanslar 23 22, bkz görüntü analizi ile ilgili daha fazla yönlendirme için x 100..

Sonuçlar

Şekil 1, 64, Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ve in vitro ve bu protokol kaplı vivo çalışmalarda deney tasarımı ile cova-TH1 hücrelerinin etiketlenmesi özetlemektedir.

figure-results-320
Şekil 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb Etiketleme Proses ve Deney Tasarımı. 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ile radyoaktif eti...

Tartışmalar

Bu protokol, stabil bir şekilde PET in vivo izlenmesi için hücreler radyolabel güvenilir ve kolay bir yöntem sunulur. 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ve homing ile de radyo-etiketlenebilir, cova-TH1 hücreleri, izole edilmiş ve donör farelerden in vitro olarak genişletilebilir, bu yöntem olabilir kullanan bir Cova sunum siteleri gibi pulmoner ve perithymic LN için takip edilmiştir akut solunum yolu DTHR cova kaynaklı.

çelatör mAb modifikasyonu hızlı ve verim...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar deneyleri ve veri analizi sırasında destek için Dr. Julia Mannheim Walter Ehrlichmann Ramona Stumm, Funda Cay Daniel Bukala, Maren Harant yanı sıra Natalie Altmeyer teşekkür ederim. Bu çalışma Werner Siemens-Vakfı, SFB685 aracılığıyla DFG (proje B6) ve fal (2309-0-0) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0031864Cu production
Methanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.0600764Cu production
Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Germany1.010464Cu production
Pt/Ir (90/10) plateÖgussaCustom made64Cu production
PEEK chamberWKLCustom made64Cu production
64NiChemotrade64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plateMacherey-Nagel80502164Cu production
Ion exchange columnBioRadAG1-X864Cu production
Solid state target system for PETtraceWKLcostum made64Cu production
64Cu work-up moduleWKLcostum made64Cu production
Dose calibratorCapintecCRC-25R
PETtrace cyclotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocyclicsB-280DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26)Isolated from hybridoma cell cultureDOTA-conjugation
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-conjugation
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unitMerck MilliporeUFC910008DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure waterCarl RothHN68.3DOTA-conjugation
Ammonium acetateSigma-Aldrich32301DOTA-conjugation
PBSUniversity TuebingenDOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 columnBio-Rad Laboratories7326221DOTA-conjugation
Sodium citrateSigma-Aldrich71497DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager Perkin-ElmerL2250116DOTA-conjugation
DMEMMerck Millipore102568ingredient for T cell medium 
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bingredient for T cell medium 
Sodium pyruvateMerck MilliporeL0473ingredient for T cell medium 
MEM-amino acidsMerck MilliporeK0293ingredient for T cell medium 
HEPES Merck MilliporeL 1613ingredient for T cell medium 
 Penicillin/StreptomycinMerck MilliporeA2212ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148ingredient for T cell medium 
DO11.10 micein-house breedingTH1 cell culture
DPBSGibco14190144TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm Corning352340TH1 cell culture
ACK Lysing BufferLonza10-548ETH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotech130-097-145TH1 cell culture
QuadroMACS separatorMiltenyi Biotech130-090-976TH1 cell culture
LS columnMiltenyi Biotech130-042-401TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
Rabbit complement MAtebu-BioCL3221TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11)Isolated from hybridoma cell cultureTH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide EMC-micro-collectionsCustom orderTH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotidesEurofins MWG OperonCustom orderTH1 cell culture
IL-2Novartis65483-116-07TH1 cell culture
96-well platesGreiner 655180TH1 cell culture
24-well platesGreiner 662160TH1 cell culture
cell culture flaskGreiner 660175TH1 cell culture
48-well platesGreiner 677 180cell labeling
Gammacell 1000Best Theratronicsvia inquiry 
Gulmay RT225Gulmayvia inquiry 
Trypan blueMerck MilliporeL6323in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISABD Biosciences558258in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit BD Biosciences559763in vitro evaluation
Tube 5 mLSarstedt55.476in vitro evaluation
Round-bottom tubes BD Biosciences352008in vitro evaluation
Wizard γ-counterPerkin-Elmer2480-0010in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro evaluation
MicroscopeLeicavia inquiry in vitro evaluation
BD LSRII BD Biosciencesvia inquiry in vitroevaluation
BALB/c miceCharles River028in vivo cell trafficking
Aluminum gelServa Electrophoresis12261.01in vivo cell trafficking
XylazineBayer HealthCareOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
KetamineRatiopharmOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
IsofluraneCP-PharmaOrdered via University hospitalin vivo cell trafficking
30 G needleBD Biosciences304000in vivo cell trafficking
SyringeBD Biosciences11612491in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µLVWR612-2439
Inveon PET scannerSiemens Healthineersno longer availablein vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scannerSiemens Healthineersno longer availablein vivo cell trafficking
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineersimage analysis, alternative software: Pmod

Referanslar

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, ., J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. . PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. . Health Physics and Radiological Health. , (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 122K k hayvan g r nt lemeh cre etiketlemenon invazif In vivo H cre takibiPET BT TH1 T h crelerihava yolu gecikmi tip hipersensitivite reaksiyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır