Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Özet

Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.

Özet

Şartlı yeniden programlanması hücreleri (CRC), birincil hücre kültürü ve hasta türevi hücre hatlarının geniş bir "canlı biyobankalar" geliştirilmesi yeteneğine için kalıcı bir yöntem sağlar. Epitel hücrelerinin pek çok türleri için, farklı üç boyutlu (3D) bir kültür yaklaşımları, geliştirilmiş bir farklılaşmış hallerinin destekleyen tarif edilmiştir. CRC de izole edildiği doku olarak soy kararlılığını muhafaza ederken, normal, iki boyutlu (2D) kültür koşulları altında yetiştirildiğinde kaynaklı doku ile ilişkili farklılaşma markörünü ifade etmiş başarısız olur. prostat kanseri araştırması için, hasta türevi CRC uygulama geliştirmek için, 3D kültür formatı, normal ve tümör türetilmiş prostat epitelial hücreleri hem de hızlı bir şekilde (2 gün toplam) lümen hücre farklılaşması sağlayan tanımlanmıştır. Burada, bir filtre elemanı tabanlı formatı, normal ve habis prostat CRC hem kültür ve farklılaşması için tarif edilmiştir. bir deimmünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama hücre toplama ve işleme için gerekli prosedürlerin kuyruklu açıklaması verilmektedir. Topluca ilköğretim CRC hatları ile kombine tarif 3D kültür biçimi, biospecimen tabanlı prostat araştırma için verim model sistemi belirginleştirebilirsiniz önemli bir orta sağlar.

Giriş

bireylere kişiselleştirilmiş kimlik ve kanser tedavilerinin kullanımı kanser araştırmalarında bir birincil hedefi vardır. Son zamanlarda, yeni yaklaşımlar potansiyel olarak her iki belirleme ve kişiye özel tedavilerin test yolları sağlayan primer hücre kültürlerinde kurulmasında daha kolay izin geliştirilmiştir. Örneğin, R-spondin bazlı prostat organoid yaklaşım ¹ bir ticari hücre dışı matris içinde normal ve metastatik prostat kanseri hücrelerinin üç boyutlu (3D) kültür (ör Matrigel) için Hücrelerin Şartlı yeniden programlanması (CRC) yöntemi ise Georgetown ^{2 geliştirilen, 3} daha fazla standart 2D kültür koşulları kullanır. Spesifik olarak, Rho kinaz inhibitörü (Y-27632) ve ışınlanmış J2 fare fibroblast besleyici hücreler kombinasyonu keratinosit CRC ² belirsiz kültür yol açar. CRC metodolojiSon derece sağlam, birincil hücre hatları başarıyla kuruldu ve prostat ve diğer birçok normal ve malign epitelyal dokuların ³ süresiz muhafaza ile. Önemlisi, bizim CRC teknolojisi önceki ilaç tedavileri bir dizi başarısız olan bir hastada tekrarlayan solunum papillomatozis için etyolojik temeli hızla tanımlanması için izin verdi. Buna ek olarak, normal ve tümör kaynaklı Literatürde KRK kullanılarak bir FDA başarılı kimlik ilk doku biyopsisi iki hafta içinde yapıldı, vorinostat ilaç onaylanmıştır. Hastalar, hastalıkları ⁴ başarılı bir şekilde tedavi ile sonuçlanan vorinostat yerleştirildi.

Normal prostat bezi luminal, bazal ve nadir nöroendokrin hücrelerden ⁵ oluşmaktadır. Luminal hücrelerin bezinin kolon epitel tabakasının oluşturulması ve androjen reseptörü (AR), hem de bu sitokeratin 8 ve 18 ve ön ve diğer lümen belirteçlerdevlet-spesifik antijen (PSA) ^6. Tersine, bazal hücre lümen tabakasının altında lokalize ve sitokeratinin 5 ve p63, ama AR ⁵ düşük seviyelerde ifade edilir. Biz ^{7, 8, 9} ve diğerleri ¹⁰ başarılı bir şekilde klinik öncesi mekanik ilaç duyarlılığı araştırmalarda prostat Literatürde KRK kullandık. Standart 2D doku kültürü koşullarında yetiştirilen Ancak, bu hücrelerin tam ¹⁰ sinyalizasyon AR kavrayana başarısız. bağışıklık yetersizliği olan farelerde böbrek kapsülü altına En önemlisi, CRC permisif ortamına yerleştirildiklerinde prostat CRC kendi soy kararlılığını muhafaza belirten normal prostat glandüler mimarinin ve fonksiyonu geri kazanılmaz. Burada açıklanan Filtre elemanı dayalı hücre kültür sisteminin gelişimi hızlı (2 hafta) kanıtlandığı b prostat CRC in vitro farklılaşmasını sağlarY, artan Ar ve Ar, hedef genlerin ekspresyonu da azaldıkça p63 seviyeleri.

Kullanılan filtre ekler memeli hücrelerinin kültürlenmesini destekleyebilir polikarbonat zarları (gözenek boyutu, 0.4 mikron) ihtiva ederler. Sistem, geliştirilmiş olarak normal ve habis prostat CRC, 6 oyuklu kültür tabaklarında ve filtre insertlerin kullanımını sağlar. J2 hücreleri ¹¹ ile belirlenen hücre kültür ortamı, üst bölme alt bölmesi ve prostat ayırt ortam yerleştirilir. teknikler, burada kişiselleştirilmiş tıp hedefleriyle uyumlu bir 2 hafta süre içinde prostat lümen hücre farklılaşmasını destekleyen tarif. Kültürlerin kapsamlı, moleküler genetik ve hücresel profil izin metodolojiler geliştirilmesi de zorunluluk oldu. Filtre yüzeyinden salınan hücrelerden DNA, RNA ve protein izole edilmesine yönelik yaklaşımlar geliştirilmiş ve doğru tekrar numune işleme için aerodinamik edilmiştir. FinaLly, metodoloji H & E, immünohistokimyasal ve immunofluorescent boyama, gömme etkinleştirmek için filtreyi kaldırma kesit için ve gerekli, tam bir şekilde anlatılmıştır.

Protokol

3D Hücre 1. Kuruluş Kültür takın Sistemi

1. Aşağı 6 kuyu plaka (Şekil 1A) bir ters yönde (yukarı filtre tarafı) 2 polikarbonat hücre kültürü ekler yerleştirin.
2. parçanın alt tarafına su içinde% 0.1 jelatin, ince bir tabaka halinde yayılır ve sterilliği korumak için, biyolojik bir güvenlik kabini (10-20 dakika) kurutun.
3. Adımı tekrar 1.2 insert% 0.1 jelatin 3 uygulama toplam iki kere daha.
   NOT: Jelatin kaplama odacıkları arasındaki sınır difüzyon yardımcı olacaktır.
4. kültür şişesi yıkamak için 5 ml PBS ekleyin standart kültür koşullarında birincil Literatürde KRK toplamak için.
   1. 37 ° C'de 5 dakika süreyle% 0.25 tripsin-EDTA (T-75 T-25 ve 2 mL için 1 mL) kullanılarak hücreler tripsinize. Yavaşça hücreleri yerinden çıkarılmasına yardımcı olmak için balonun yan dokunun. Sonra tripsin reaksiyonu durdurmak ve tam DMEM 5 ml ekleyerek hücreleri toplamak için devam edin.
   2. Toplamak 15 ml bir tüp içinde hücreleri. 4 ° C ve 188 x g'de tüpü santrifüjünde ve otomatik bir hücre sayacı ya hemasitometre kullanarak sayın.
   3. Medya (CM) klimalı 250 uL 600.000 Literatürde KRK yeniden askıya ve düzgün odaklı (filtre tarafı aşağı) kültür insert (Şekil 1B) ekleyin. Bu iç hazne olarak adlandırılır.
      Not: CM ışınlanmış J2 hücreleri şartlandırılmış F ortamı ve daha önce ^{7, 8, 9, 11} tarif edilen şekilde 10 um Y-27632 içerir.
5. 6 plaka dış haznesine CM 2 mL uygulayın ve (en azından 18 saat için) gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
6. Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasının CM kaldırmak ve yavaş yavaş tam kadar 1 ml pipet ile iç odaya farklılaşma medya (DM) ekleyin. Hücre tabakası rahatsız için dikkatli olun.

3D Kültürlerin le "> 2. Bakım

1. Her gün kültürleri kontrol edin. Şekil 2'de gösterildiği gibi, sağlıklı hücreler görünür.
2. Dış odasında CM her gün ya da hücrelerin metabolizması bağlı olarak her geçen gün değiştirin.
3. (Sarı), iç bölme değişiklikleri renk medya, dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç filtre odasının medya kaldırdığınızda.
4. Bir aspirasyon ucu ile dış 6 kuyu plaka odasında medya aspire.
5. 1 ml pipet kullanarak, yavaşça tam kadar iç odaya taze DM uygulayın. kazımak veya başka hücre tabakası çıkarmak için dikkatli olun.
6. Taze CM 2 mL dış odasının ortamı değiştirin.
7. 2 hafta kültürleri korumak ve daha sonra istenen bimolecular izolasyonu için işleme devam edin.
   NOT: 6 plaka her satır, altı ekler (Şekil 1B) toplam, DN için yeterli hücre elde etmek için deney başına işleme tabi tutulmalıdırAnaliz için bir RNA ya da protein.
8. dış odanın aspire ortam ve 2 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile durulayın.
9. Dikkatlice 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından ortamı çıkarın ve 500 uL PBS ekleyin. kazıma veya başka membran üzerinde hücrelerin rahatsız etmemek.
10. Aspire dış odasından PBS ve dikkatli bir 1 ml veya 200 uL pipet ile iç odasından PBS kaldırmak. PBS çıkarıldı sonra, aşağıda ayrıntılı olarak uygun bir uygulama direkt olarak devam edin. Membran kurumasına izin vermeyin. Uygulama başlamaya hazır olana kadar kültür PBS kısaca tutulabilir.

3. Pelet Bankacılık için filtreler İşleme

1. her bir iç bölmeye 100 uL% 0.25 tripsin-EDTA ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
2. aşağı yukarı pipetleme ve süre Kısaca ve özenle / ajitasyon 200 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın (Punc önlemek) Membran açmadan. 37 ° C'de 1 dakika süreyle inkübe edilir.
3. Filtreyi durulama yavaşça ilk iç odaya CM 250 uL ekleyin ve yukarı pipet ve.
4. Transferi Aynı medya koşullarını içerir ve aşağı yukarı pipetleme tekrarlayın ve komşu filtre odasına hücreleri yeniden süspanse.
5. Tek bir durumun ekler her biri için bu işlemi tekrarlayın. Toplamak ve 1.5 ml santrifüj tüpüne hücreleri transferi.
6. kalan hücreleri toplamak için CM ek 100-200 uL her bir iç bölmeyi durulayın. Aşama 3.5, 1.5 ml santrifüj tüpüne ekleyin.
7. 5 dakika boyunca 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde 423 xg'de hücreleri dönerler.
8. Süpernatantı aspire ve 1000 uL PBS ile bir kez hücre pelet yıkayın.
9. 5 dakika boyunca 4 ° C'de bir mikrosantrifüj içinde 423 x g hızında tekrar Spin.
10. PBS aspire ve daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C'de dondurularak.

4. RNA veya DNA İzolasyon için filtreler İşleme

1. İç bölmeye guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform veya benzer ekstraksiyon reaktifi, 200 uL ilave edilmekte ve kısaca bir şekilde pipetli yukan aşağı çekilerek membran yüzeyinde hücreleri çalkalayın.
2. Dış oda kuru ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ekstre edici reaktif olarak inkübe edin.
   1. filtre elemanından ayırmak gibi, yukarı ve aşağı çekme çözüm pipetleme kopuk filtre membran yıkayın. 6 plaka devirme ve herhangi bir kalıntı sıvıyı aspire mümkün olduğunca çıkarma reaktif kadar toplayın.
3. saflaştırılması ve DNA, RNA ya da protein geri kazanımı için imalatçının protokolü takip edin.

5. Protein İzolasyonu için filtreler İşleme

1. Buz üzerinde 6 plaka filtre koyunuz. İç bölmeye, 10 ul 1 mM sodyum florit (NAF), 1 mM sodyum vanadat (NAV), 100 mM dithiothre ile takviye edilmiş bir protein liziz tamponu ilaveinositol (DTT) ve anti-proteaz kokteyli 100 uL.
2. / Çalkalamak yukarı ve aşağı pipetleme ise 20 uL pipet ile membran yüzeyinde hücreleri kazıyın. lizis tamponunda kabarcıkları üreten kaçının.
3. 10 dakika boyunca buz üzerinde filtre eklenmiş 6 yuvalı plaka inkübe edin.
4. kazıma Tekrar sonra lizis tamponu ile membran yüzeyin durulanması.
5. 6 uçlar arasında lisatlan toplayın ve buz üzerinde 1.5 ml santrifüj tüpüne aktarılır.
6. Bir sonraki filtreye liziz tamponu ve transfer ek olarak 10 uL ilk membran durulayın.
7. Tüm ekler için yineleyin 5.6, herhangi bir kalıntı lizis tampon çözeltisi toplama ve 1.5 mL tüp (adım 5.5) ekleyin.
8. ilave bir 5 dakika boyunca buz üzerinde örnek inkübe edin.
9. 4 ° C'de 15 dakika maksimum hızda (bir masa üstü santrifüjü içinde 16.873 xg) dönerler.
10. Taze 1.5 ml tüp içine Pipet lizat süpernatant.
11. protein konsantrasyonu ya da taştan analizine devam edin-80 ° C'de lizatları Re.

H & E ve Immuno-boyama 6. İşleme

1. İç ve dış bölmeye 500 uL% 10 1 ml NBF (nötr tamponlu formalin) ilave edin ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
2. Dış odasından NBF aspire ve 1 mL hidroksietil agaroz (HEA), 1.5 mL santrifüj işleme jeli ilave edin. Yavaş yavaş düşük güç kullanan bir mikrodalga agaroz eritebilir ve erimiş agaroz kadar 10-20 s darbeleri tekrarladı.
3. Kullanıma hazır olana kadar katılaşmasını önlemek için, 37 ° C sıcak bir banyoda HEA tutun.
4. iç odanın NBF çıkarın ve iç bölme erimiş HEA 25 uL uygulanır ve agaroz 2-5 dakika boyunca katılaşmaya sağlar.
5. % 10 NBF Islak 2 köpük histoloji yastıkları ve (Şekil 3D bakınız) gömme kaset bir ped yerleştirin.
6. parçanın alt tarafında filtreyi skor (çok keskin, ince uçlu bir bıçak olan) bir 11. bıçak neşter kullanabilirsinizodası kısmen plastik uç haznesinden bırakmadan.
7. Bir Petri kabındaki NBF küçük bir miktar (100-200 ul) yerleştirin ve NBF (Şekil 3A) kısmen yerinden filtreyi batırmayın.
8. Bir # 10 bıçak neşter ile hafifçe tam uç haznenin (Şekil 3B) filtre çıkarmak için, uç bölmenin içinden, filtre ortasında karşı baskı. hala hazne takılı filtrenin bir kısmı olması durumunda, neşter ile sever.
9. 10. bıçak neşter (Şekil 3C) ile ikiye HEA kaplı filtre kesin.
10. Aşama 6.4 (Şekil 3D) 'de hazırlanan histolojik kaset köpük ped üzerine, filtrenin her yarım yerleştirin.
11. Filtreyi sandviç, kaset ikinci% 10 NBF batırılmış sünger ekleyin.
12. Yapış NBF kaseti, yer mühür ve gece inkübe edin.
13. kesit ve boyama olarak parafin bloklar halinde süreç filtreleriDaha önce ¹² tarif.

Sonuçlar

Hücre kültürü uç tabanlı sistem lümen hücre farklılaşmasını destekleyen prostat CRC 3D kültürleri üretmek için göreceli olarak basit ve hızlı bir yöntemdir. Sistemin şematik bir filtre elemanının alt yüzeyine jelatin kaplama uygulamasını öne (Şekil 1A) gösterilmektedir. dolgular yalnızca jelatin uygulanması için devrilmiştir. Şekil 1B filtreler kültürlenmesi için uygun doğrultuda bulunmaktadır. Şeffaf bir hücre ek...

Tartışmalar

Primer hücre hatları kanser araştırmaları için önemli ve hızla gelişen bir platform vardır. kültür insert tabanlı 3D kültür sistemi bir iki haftalık süre içinde birincil prostat CRClerin farklılaşmasını desteklemektedir. CRC filtre yöntemi prostat araştırma için yeni bir orta hacimli yöntemi temsil eder. Mevcut fare PDX modelleri zaman alıcı ve son derece pahalıdır ve PDX örneklerin birçok araştırmacı tarafından başlatılan deney ve kullanımını sınırlayan, kültür içinde yeti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
Gelatin 0.1% in water	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
Sterile Standard Scalpel 11 Blade	Integra Miltex	4411
RIPA Lysis and Extraction Buffer	Thermofisher Scientific	89900
Sodium Fluoride	Fishcer Scientific	S299-100
Sodium Vanadate	Fishcer Scientific	13721-39-6
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3483123
Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Thermofisher Scientific	25200-056
DMEM	Thermofisher Scientific	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Glutamine	Thermofisher Scientific	25030081
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140-122
F-12 Nutrient Mix Media	Thermofisher Scientific	11765054
Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor	Enzo	ALX-270-333-M025
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
EGF	Thermofisher Scientific	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
Non-Adherent Dressing	Telfa	KDL2132Z
Cell Culture Dish	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes	Crystalgen	CG-M492