Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için

Özet

3 boyutlu yetiştirilen Caco-2 hücreleri bir in vitro hücre kültürü modeli ve fare bağırsak bir ex vivo modeli kullanılarak bağırsak serotonin taşıyıcısı (SERT) fonksiyonu ve ifadesinin düzenlenmesi çalışma basit bir yöntem tarif eder. Bu yöntemler, diğer epitelyal taşıyıcılar çalışma için de geçerlidir.

Özet

bağırsak epiteli yabancı parçacıklara bir bariyer sağlarken vücudun normal fizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynayan önemli ulaşım ve bariyer fonksiyonları vardır. Bozulmuş epitel taşımacılığı (iyon, besin veya ilaç) birçok hastalıkla ilişkili bulunmuştur ve epitel bütünlüğünü ve bağırsak mikrobiyomları etkileyerek gibi taşıyıcılar, normal fizyolojik fonksiyonları ötesine sonuçlar doğurabilir. fonksiyonu ve transport proteinleri düzenlenmesini anlamak geliştirilmiş terapötik girişimlerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. epitel taşıma çalışmada büyük zorluk yerli bağırsak epitel hücrelerinin önemli özelliklerini özetlediği uygun bir model sistemi geliştiriyor. Bu Caco-2, T-84 ve HT-29-Cl.19A hücreleri gibi çeşitli in vitro hücre kültürü modelleri, tipik olarak epitel taşıma araştırmalarında kullanılmıştır. Bu hücre hatları e modelleme için bir indirgemeci yaklaşımı temsilpithelium ve epitel-mikrobiyal etkileşimleri bunların incelenmesi de dahil olmak üzere pek çok mekanik çalışmalar, kullanılmıştır. Ancak, hücre mono tabakaları doğru hücre-hücre etkileşimleri hem de in vivo mikro-yansıtmamaktadır. 3D yetiştirilen hücreler, ilaç geçirgenliği çalışmaları için modeller umut verici olduğu gösterilmiştir. Bu 3D Caco-2 hücreleri, epitel taşıyıcıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Caco-2 hücrelerinde yapılan çalışmalar, hücre spesifik etkileri ekarte etmek ve dikkate yerli bağırsağın karmaşıklığı almak için diğer modelleri ile tamamlanmaktadır olması da önemlidir. Çeşitli yöntemler, daha önce bu izole epitel hücrelerinde veya izole edilmiş plazma zar veziküllerinde dışa eğik kesesi ve emme olarak taşıyıcılar, işlevselliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. modellerine saygı ve taşıma fonksiyonu ölçümü ile dikkate alan zorlukları alırsak, biz burada 3D Caco-2 hücreleri büyümek ve bir gibi bir Ussing odasının kullanımını tanımlamak için bir protokol göstermektediretkin bir yaklaşım gibi sağlam polarize bağırsak epitel olarak serotonin naklini ölçmek için.

Giriş

bağırsak epitel lümeninde sıvı salgılanması ve iyonların çeşitli taşıyıcı proteinler (kanalları, ATPazların, ko-nakliyeciler ve değiştiriciler) besin, elektrolit emilimi kadar sayısız fonksiyonları yerine, ve uyuşturucu ile donatılmıştır. Transport proteinleri vektörel bir şekilde iyonlar veya moleküller hareketine olanak elektrokimyasal eğimler oluşturur. Bu polarize epitel hücrelerinin en üst ve taban zarlarında taşıma sistemleri asimetrik dağılımları ile elde edilir. Buna ek olarak, bitişik epitel hücreleri urgan sıkı bağlantıları, en üst ve taban membran alanları arasında bileşenlerin zar içi difüzyon karşı bir engel olarak hizmet eden bu süreçte önemli bir rol oynar. Yerli bağırsak bu karakteristik özelliklerini taklit uygun model sistemler (örneğin polarizasyon, farklılaşma ve sıkı kavşak bütünlüğü) functio çalışma için kritikepitel taşıma sistemlerinin tesi.

modelleri ile ilgili olarak, intestinal epitel taşıma araştırmalarında anda kullanılan tipik hücre çizgileri, Caco-2, tam olarak farklılaşmış bir modeli olan küçük bağırsak epitel hücreleri absorbe; ve T84 hücreleri veya HT-29 alt klonlar, kript kaynaklı kalın bağırsak epitel hücreleri ¹ modeller. Geleneksel olarak, bu hücre hatları plastik yüzeyler içinde mono-tabaka olarak veya kaplanmış Transwell yetiştirilir. Bir dereceye kadar trans-iyi hücre kültür ekleri polarize hücreleri basolaterally beslemeye izin vererek in vivo ortamda benzer. Bununla birlikte, geleneksel 2B kültür sistemlerinde bir sınırlama hücreleri, suni düz ve katı bir yüzeye uyum sağlamak zorunda olmasıdır. Böylece, yerli epitel fizyolojik karmaşıklığı doğru bir 2D sisteminde yansıtılmaz. Bu sınırlama, bu jelatinimsi proteini MIXTUR'a gibi belirli bir mikro-3D hücrelerin büyümesini yöntemler ile aşılmıştırE, hücre dışı matris ^{bileşenleri, 2, 3,} çeşitli ihtiva etmektedir. Bununla birlikte, in vitro kültürleri birden hücre tiplerini ve bağırsakta bölgeye özgü bir mimariye sahiptir bağırsak epiteli, karmaşıklığı taklit edemez. Bu nedenle, hücre kültürü modelleri kullanılarak çalışmalar, ana bağırsakta daha fazla değeri gerektirir. In vitro 3D hücre kültürü ve fare bağırsak mukozasını kullanarak, bağırsak serotonin transporter (SLC6A4, SERT) düzenlenmesi incelemek için buraya basit yöntemler açıklanmaktadır.

Bağımlı işlemi ^- SERT taşıyıcı hızla Na ⁺ / Cl üzerinden taşındığında, önemli bir hormon ve nörotransmitter, 5-hidroksitriptamin (5-HT) hücre dışı durumu düzenler. SERT, anti-depresanlar, bilinen bir hedef ve en son, ishal ve bağırsak iltihabı gibi GI bozukluklarının, yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmıştır.Yöntem bağırsak epitelial hücrelerinde 5-HT alım daha önce tarif edilmiştir araştırmak. Örneğin, plastik destek ya da geçirgen eklerde yetiştirilen Caco-2 hücreleri, üst ve taban üzerindeki etki ⁴ hem de fluoksetin duyarlı ^3H-5-HT geri alımını sergiledikleri gösterilmiştir. Insan organ donörü ince bağırsaklarda hazırlanan izole fırça kenar zar vezikülleri (BBMVs) SERT fonksiyonunun ölçülmesi de bizim ⁵ tarafından tarif edilmiştir. İnsan BBVMs ³ H-5-HT alım fluoksetin duyarlı Na ⁺ / Cl olduğu gösterilmiştir ^- bağımlı ve 300 K _m nM ⁵ doygunluk kinetiği göstermiştir. Benzer yöntemler kullanarak, aynı zamanda, daha önce, fare bağırsak BBMVs ^{6, 3H-5-HT} alımı, SERT fonksiyonu ölçülen. Bununla birlikte, temiz plazma zar veziküllerinin hazırlanması doku mukozanın gerektirir. Bu radiog gibi diğer yöntemler,^3H-5-HT alım siteleri sonuçlarda be- lirgin görselleştirme da gine domuzu ve sıçan ince bağırsak ⁷ daha önce gösterilmiştir.

Ussing odası çeşitli epitel doku iyonların, besin ve ilaç taşıma ölçmek için daha fizyolojik bir sistem sağlar. Ussing odası tekniğin önemli avantajı, sağlam, polarize bağırsak epiteli elektriksel ve nakil parametrelerinin hassas ölçüm mümkün kılmasıdır. Dahası, içsel nöromüsküler sistemin etkisini en aza indirmek için, bağırsak mukozasının seromusküler sıyırma epiteli ⁸ taşıyıcılar düzenlenmesini araştırmak için yapılabilir.

Bu jelatinimsi protein üzerinde 3D yetiştirilen Caco-2 hücreleri, farklı üst ve taban üzerindeki işaretleri ifade eden bir içi boş lümen olduğu belirlenmiştir. Bu hücreler, 2D Caco-2 hücreleri daha SERT yüksek ifadesini gösterir. Yöntemler 3D hücreleri büyümek ve perform immün veya RNA ve protein çıkarma açıklanmıştır. Buna ek olarak, bir Ussing odası tekniği kullanılarak ince bağırsak mukozasında, TGF-ß1 bir pleiotropik sitokin tarafından SERT fonksiyonu ve düzenleme çalışma yöntemleri tarif eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

jelatinli protein karışımı ile ilgili artan 3D Caco-2 hücre kültürü: Caco-2 3D kültür sisteminde bağırsak taşıyıcılar 1. Çalışma

1. Çözülme büyüme faktörü 8 saat boyunca buz üzerinde, jelatinimsi bir protein karışımı düşük (ya da O / N), 4 ° C'de ilave edildi. Bir kez 1 mL veya daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de kullanıma veya deposu için 500 uL alikot yapmak çözülmüş.
2. kültür gününde, buz üzerinde kültürü (RNA ve protein ekstraksiyonu için) plakaları ya da (immün) odacıklı slaytlar ön soğutma. Sekiz oyuklu bölmeli-cam slayt (ya da 6-plaka oyuk başına 120 uL) her bir oyuğuna, jelatinimsi protein karışımı 30 ul ekleyin ve yayılır. sürecinde hava kabarcığı oluşturmak için özen gösterin.
3. 15, 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içinde kayar ve / tabak koyun - 30 dakika ve jelatinli protein karışımı, katılaşmaya sağlar.
4. jelatinimsi bir protein karışımı, katılaşan iken, Caco-2 hücrelerinin konfluent balon trypsinize.
5. sayısını sayınve hücrelerin 5 dakika boyunca masa üstü santrifüjde 500 xg'de bunları dönerler. gerektiği gibi 3D Caco-2 Orta hücre pelet yeniden askıya.
6. (Plakalar için kuyu başına 20.000) kuyu başına 4,000 hücre cam haznesi slaytlar Tohum. Hücreler 37 ° C'de% 5 _CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde büyümeye olanak sağlar. 4 d - orta her 3 değiştirin.

3D Caco-2 hücrelerinde Epitel Taşıyıcılar 2. İmmünofloresan Boyama: 1. Gün

1. orta aspire ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (NaOH ile 8.5'a ayarlanmıştır pH PBS)% 2 paraformaldehit 400 uL (PFA) ile hücrelerin tespit.
   Not: PFA Çözelti 4 ° C 'de en fazla 1 hafta saklanmamalıdır ve taze çözelti kullanılabilir. DİKKAT: PFA son derece zehirlidir ve potansiyel kanserojendir. Her zaman kimyasal kaput dikkatli ve kişisel koruyucu ekipman kullanarak başa.
2. (1 x PBS ile iki kez kuyu durulayın ve PBS içinde 4 ° C'de slaytlar depolamak 400 uL /iyi). Bir kez, sabit bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.
3. RT'ye odası slaytlar (bu jelatinimsi protein karışımı yatak sertleşmesine ve yıkama adımları sırasında aspirasyon için kolay hale getirecek) ısıtın.
4. Artık daha 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton ile hücrelerin geçirgenliği.
5. PBS-glisin tamponu (130 mM NaCl, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3.5 mM NaH ₂ PO _4, 100 mM glisin) hazırlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 1 x PBS-glisin ile 3 kez yıkayın.
6. Immünofloresan tamponu (IF) hazırlanması: 130 mM NaCI, 7 mM Na ₂ HPO _4, 3.5 mM NaH ₂ PO _4, 100 mM glisin, 7.7 mM _NaN3,% 0.1 BSA,% 0.2 Triton X-100 ve% 0.05 Tween-20 .
7. IF yıkayın 3x oda sıcaklığında 10 dakika her biri için tampon. % 5 blok IF tamponu Normal Keçi Serum (NGS). IF +% 1 keçi serumu içinde seyreltilmiş birincil antikor, 200 uL inkübe / oyuk, 1 - oda sıcaklığında 2 saat. 10 dakika her biri için IF tampon 3x ile yıkayın.
8. İkincil anti-ile inkübegövde (1: 200), oda sıcaklığında 1 saat, eğer +% 1 NGS, 200 uL / ​​oyuk içinde seyreltilmiş.
9. 10 dakika her biri için bir IF tamponu ile üç kez yıkanır. Bu aşamada karanlıkta slaytlar tutun. onun kenar temas kuyuların kenarına kadar tutucu sayesinde beyaz bir kaldırıcı bir siyah tutucu bölme slayt yerleştirerek ve sürgülü cam slaytlar plastik odaları kaldırın. Yavaşça odaları (tutucu ve kaldırıcı kültür slaytlar ile gelmelidir) yukarı çekin.
10. Yavaş, anti-solma ortamı ile monte ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kurumaya bırakılır.
11. Tamamen kurumuş sonra, oje ve konfokal mikroskobu ile görüntü onlara olan slaytlar mühür. iki hafta ya da daha fazla ay -20 ° C 'de 4 ° C' de slaytlar saklayın.

3D Caco-2 hücreleri, 3. RNA ve protein çıkarımı

1. TGF-p ß1 bir test maddesi ile 14 D (10 ng / ml, 1 H), - 12 jelatinimsi protein karışımı ile kültürlenen hücrelerin tedavi edin.
2. Tedaviden sonra, 1 hücreleri yıkayınX PBS ile yıkandı. 30 dakika jelatinli protein karışımı sıvılaştırılması için buz üzerinde hücreleri tutun.
3. soğutulmuş PBS ile kuyu yıkayın ve bireysel santrifüj tüplerine hücreleri toplamak. 500 xg ile 10 dakika boyunca 4 ° C 'de düşük hızda santrifüjleme kullanılarak hücreler toplanır. Standart prosedürler kullanılarak RNA ekstrakte ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanımı.
4. Protein ekstre için, 1 x proteaz kokteyli inhibitörü ile desteklenmiş 1 x hücre parçalama tamponu kullanılarak hücrelerin lize. pelet hücre parçalama tamponu ilave edildikten sonra, sonikasyon ile hücreler lize edildi ve 7,500 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile hücre debrisini uzaklaştırmak.

Bir Ussing Odası kullanılması Fare ileumda 5-HT Alımına 4. Ölçümü: Bağırsak Hazırlık seromusküler Sıyırma

1. Ötenazi ardından, fareler incelemek ve (mide sonra çekum öncesi) küçük bağırsak kaldırın. üç bölüme ince bağırsak bölün. Orta üçüncü atın proksimal üçte kullanmakjejunum olarak ve ileum olarak uzak üçte kullanın. epiteline zarar görmesini önlemek için kendi mezenterik eki bağırsak çekerek kaçının. buz gibi soğuk Krebs-Ringer bikarbonat (KBR) tampon ile kaplayıp doku bölümü soğuk tutmak.
2. uzunlamasına makas kullanılarak bağırsak açın. KBR seromüsküler sıyırma önce 10 dakika boyunca 1 uM indometasin ihtiva eden gazla, buz gibi soğuk taze kesilmiş bağırsak bölümlerinde inkübe edin.
3. % 7 agaroz veya tedavi silikon elastomer (0.5 cm kalınlığında) içeren bir plaka aşağı bağırsak bölümü (uzunluğu ~ 1 cm) mukozal tarafı sabitleyin.
4. alt aydınlatma ile bir diseksiyon stereomikroskop altında seromusküler katmanları soyun. Bir tüy neşter bıçak kullanarak seromusküler katman kesti. bağırsak uzunlamasına ekseni boyunca tabakanın kenar elde etmek için ince forseps kullanın.
   NOT: sıyırma işlemi sırasında, stereomicroscope alt aydınlatma Peyer yama ile alanları belirlemek ve önlemek için yardımcı olures.
5. seromüsküler sıyırma tamamlanmasından sonra, Ussing yarı bölmenin pimlerin üzerine dikkatli bir şekilde mukozayı monte edin. Tüm süreç boyunca, yırtılmasını önlemek için kenarlarından elimden mukozal doku tutmaya özen gösterin.

5. Dengeleme ve Doku Tedavisi

1. Krebs çözeltisi hazırlayın: 115 mM NaCI, 25 mM NaHCO _3, 2,4 mM K ₂ HPO _4, 1.2 mM _CaCl2, 1.2 mM _MgCl2, ve% 95 O _2/5 ile% gazlı pH 7.4'te 0.4 mM KH ₂ PO _4, 37 ° C'de _CO2. ozmotik dengesini korumak için mukozal banyosuna bir enerji substrat ve 10 mM mannitol olarak hizmet serozal banyosuna 10 mM glukoz ekleyin.
   Not: Krebs solüsyonu, hücre içi, 5-HT bozulmasını önlemek için, L-askorbik asit (100 uM) ve pargilin (100 uM, monoamin oksidaz inhibitörü) ile takviye edilmektedir.
2. apikal (lümen) si, hem maruz odasına kaydırıcıyı yerleştirinde ve Krebs solüsyonu doku bazolateral (serozal) yan.
3. 10 dakikalık bir dengeleme döneminden sonra, J _ms (mukozal-To-serozal akışı) apikal tarafında, 30 dakika için fluoksetin (10 uM) ile ön işleme tabi ileal doku.
4. Bazolateral tarafında, 1 saat boyunca, TGF-ß1 (10 ng / ml) ile doku tedavi ve apikal taraftan 30 dakika boyunca ³ [H] -5-HT (20 nM) ile inkübe edin.

Serozal Flux (J _ms) ve ³ [H] Doku -5-HT Birikim mukozal 6. sayısallaştırılması

1. Bir sıvı sintilasyon sayacında radyoaktivite ölçmek ve mukozal-to-serozal (J _MS) akış oranı hesaplamak için (toplam 5 mL) serozal haznesinden 0.75 mL alikotları toplamak; Fluoksetin duyarlı akı ³ [H] -5-HT alımını SERT aracılı temsil eder.
2. serozal tarafında ve yeniden numune almak, bir akı dönemde mukoza boyunca hidrostatik basınç farklılıkları önlemek içinBanyo ortamının eşit hacimleri ile koyun.
   NOT: akı hesaplama ucu numune (4.25 ml / 5 ml = 0.85) seyreltilmesi için düzeltir.
3. ³ [H] doku biriken -5-HT ölçümü için, sürgü mukoza çıkarmak buz soğukluğunda KRB tamponu ile bir kez yıkanır, camdan yapılmış bir kültür tüpleri içine yerleştirin.
4. gece boyunca 37 ° C'de% 10 KOH 0.5 mL mukoza inkübe edin. bir sıvı ışıma sayacı kullanılarak (üçlü olarak) lizatlarının 150 uL alikotları radyoaktivite ölçülür.
5. Bradford metodu kullanılarak protein konsantrasyonunu ölçmek için lizatlarının - (5 uL 3) alikotları kullanın.
   Not: Radyoaktif serotonin içeren kuluçka ortamı 10 ml, bir standart olarak kullanılır. 5-HT pmol / mg protein / dakika olarak ifade edilir doku içinde muhafaza.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

3B, Caco-2 kisti immün, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Phalloidin aktin ile boyandı 3D kist iyi sınırlı lümen gösteren bir XY düzleminde bir temsilcisi görüntü Şekil 1A gösterilmiştir. lümen bakan tarafı apikal tarafı gösterir. Sağlam epitel fenotip bir 3D ortamda sonucunda kültüre epitel hücreleri. Aktin ve SERT eş lekeli gün 12, Farklı Caco-2 kistleri, Şekil 1B'de gösterilmiştir. Bir XY düzlemine

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bağırsak taşıma ^{10, 11, 12, 13, 14, 15} okumak için epitel mono tabakaları polarize tam olarak farklılaşmış Caco-2 hücre mono tabakaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bağırsak epitel hücrelerinin fizyolojik organizasyonunu taklit etmek için, 3D bir Caco-2 kültürün gelişmesinde önemli bir ilgi ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	ATCC	ATCC® HTB­37™	Cells
10x PBS	Carl Zeiss		Microsope for confocal Imaging
3[H]-5-HT	LabtekII	152453	Culturing cells for microscopy
5-HT	Gibco	70013-032	Not a hazardous substance
95% O2- 5% CO2 cylinder	KPL	71-00-27	Not a hazardous substance
Agar (for Agar plates)	Fischer	BP151-100	Acute toxicity, Ora
Agar (for electrode)	Sigma	G7126-1KG	Not a hazardous substance
Alexa Fluor Phalloidin	Sigma	C3867-1VL	Not a hazardous substance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	P6148-500G	Harmful if swallowed or if inhaled
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Not a hazardous substance
Caco-2 Cells	Sigma	A8806-5G	Not a hazardous substance
Cell lysis Buffer	Fischer	BP337-100	Not a hazardous substance
Chabered slides	Sigma	S5886-1KG	Not a hazardous substance
Collagen Type-1 Solution	Sigma	S8045-500G
Electrodes	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco by Life Technologies	25200-056
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	356234	Used as Extracellular matrix
Fluoxetine	Qiagen	74104
Gentamicin	ATCC	30-2003	Cell culture Media
Glycin	Cell Signaling, Danvers, MA
Hepes	Roche	11836145001
Indomethacin	Gibco by Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco by Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco by Life Technologies	15630-080
L-ascorbic acid	Gibco by Life Technologies	10082147
Liquid scintillation counter	Gibco by Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA	EM-CSYS-8
Mannitol	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2304
Matrigel	Physiologic Instruments, San Diego, CA	VCC MC8
MgCl2	Physiologic Instruments, San Diego, CA	DM MC6
Multichannel Voltage/current Clamp	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, CA	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Normal Goat Serum (NGS, 10%)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Protein assay reagent	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Proteinase Inhibitor Cocktail	MEDOX, Chicago, IL	style G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Single Channel Electrode Input Module	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Sliders for snapwell Chambers	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Sodium Phosphate (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Sodium-Hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-β1	Perkin-Elmer,Waltham, MA	NFT1167250UC
Triton X-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Ussing Chamber (chamber only)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Ussing Chamber Systems	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296