JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

ne olursa olsun çalışma koşulları, ICP bölgenin ilerlemesini durdurabilir yeni bir iyon konsantrasyon kutuplaşma (ICP) platformu için protokol açıklanmıştır. Platformun bu sağlıyor ICP olgusunun iki polarizasyona olan iyon tükenmesi ve zenginleştirme, birleştirme kullanılması yatmaktadır.

Özet

iyonu konsantrasyonunun polarizasyon (ICP) olgu düşük bolluk biyolojik örnekler önkonsantreyi en hakim yöntemlerden biridir. ICP yüklü biyomoleküllerin (yani, iyon tükenmesi bölgesi) için bir non-invaziv bölgeyi uyarır ve hedefler bu bölge sınırında zenginlestirilerek edilebilir. ICP ile yüksek zenginleştirme performansları rağmen, non-yayılan iyon tükenmesi bölgelerinin çalışma koşullarını bulmak zordur. Bu dar çalışma penceresi üstesinden gelmek için, biz son zamanlarda spatiotemporally sabit zenginleştirilmesi için yeni bir platform geliştirdi. Sadece iyon tükenmesi kullanan yöntemleri önceki aksine, bu platformu da iyon tükenmesi bölgenin yayılmasını durdurmak için ICP (yani, iyon zenginleştirme) karşıt polaritesi kullanır. tükenmesi bölgesi ile zenginleştirme bölgesini karşı karşıya tarafından, iki bölge birbirine birleştirmek ve durdurun. Bu yazıda, bu spatiotemporally tanımlanan ICP platf inşa etmek için detaylı bir deneysel protokol tariform ve konvansiyonel cihaz olanlar ile karşılaştırarak yeni platformun zenginleştirme dinamiklerini karakterize. Nitel iyonu konsantrasyonu profilleri ve şimdiki zaman tepkiler başarıyla birleştirilmiş ICP ve tek başına ICP arasında farklı dinamiklerini. sadece ~ 5 V zenginleştirme yerini çözebilirsiniz geleneksel birinde aksine, yeni bir platform çalışma koşulları geniş aralıklar içinde belirli bir konuma bir hedef yoğunlaştırılmış fiş üretebilir: voltaj (0,5-100 V), iyonik kuvvet (1-100 mM) ve pH değeri (3,7-10,3).

Giriş

İyon konsantrasyon kutuplaşma (ICP) iyonu konsantrasyon gradyanı 1, 2 ek bir potansiyel azalma ile sonuçlanan bir seçici bir zar üzerinde iyon zenginleştirme ve iyon azalması sırasında meydana gelen bir olaydır değinmektedir. Bu konsantrasyon gradyanı, doğrusaldır ve daha yüksek bir gerilim membran iyon konsantrasyonu kadar (Ohmik rejim) olarak uygulanır dik hale gelir, sıfır (sınırlayıcı rejim) yaklaşır. Bu difüzyon ile sınırlı bir durumda da, gradyan (ve karşılık gelen iyon akışı) / ekranı 1 doymuş bilinmektedir. Gerilim (veya akım) daha fazla arttığında bu geleneksel anlayışın ötesinde, bir overlimiting geçerli bölge sınırı 1, 3 yassı tükenme bölgeleri ve çok keskin konsantrasyon geçişlerini ile görülmektedir. Düz bölge çok düşük iyon konsantrasyonuna sahiptir, ancak yüzey iletimi, elektro-osmoti Cı akışı (EOF), ve / veya elektro-ozmotik instabilite iyon akımına tanıtılması ve bir overlimiting akımı 3, 4, 5, yol açar. 6, 7, 8, 9 ve / veya prekonsantratlar filtreleyen bir elektrostatik bariyer, 10, 11 hedef olarak İlginçtir, düz tükenmesi bölge hizmet vermektedir. (Tatmin edici Elektronötralliğin için) yüklü parçacıkların yüzey yükleri taranması için bir iyon miktarı yetersiz olduğundan, parçacıklar, bu azalmanın bölümü içinden geçmek ve bu nedenle sınırda hizaya olamaz. Bu doğrusal olmayan ICP etkisi, membran 10, 11, 12, 13 çeşitli bir genel olgudur> 14 ve geometriler 6, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21; Araştırmacılar filtrasyon 6, 7, 8 çeşitli geliştirmek mümkün olmuştur bu yüzden, 9 ve doğrusal olmayan ICP 10, 11 cihazları Zenginleştirme.

Hatta böyle yüksek esneklik ve sağlamlığı ile, hala doğrusal olmayan ICP cihazları için çalışma koşullarını açıklığa kavuşturmak için pratik bir sorundur. ICP doğrusal olmayan rejimi hızlı anoda doğru hareket anyonların yer değiştirmesine neden olan bir katyon değişim zarı yoluyla katyonları kaldırır. OlarakSonuç, düz tükenmesi bölgesi şok yayılma 22 olduğunu hatırlatan, hangi hızla yayılır. Mani ve ark. Bu dinamik deiyonizasyon (veya tükenmesi) 23 şok denir. İyon tükenmesi bölgesinin genişlemesini önlemek, belirli bir algılama pozisyonda hedef prekonsantratı için, örneğin, bölge genişleme 24 karşı EOF veya basınçla çalışan akışı uygulanmak suretiyle, gereklidir. Zangle ve diğ. 22, bir tek-boyutlu bir model ICP yayılma kriterlerini açıklık ve oldukça elektroforetik mobilite 17, iyonik kuvvet 18, bu nedenle pH 25 ve bağlıdır. Bu uygun çalışma koşulları örnek şartlarına göre değiştirilebilir belirtir.

Burada, bir spatiotemp içinde hedeflere prekonsantratlar yeni bir ICP platformu için detaylı tasarım ve deneysel protokolleri mevcutoral konum 26'da tanımlandığı gibidir. İyon tükenmesi bölgesinin genişlemesi, bağımsız olarak çalışma süresi, bir atanmış konumunda bir deriştirme fiş bırakarak iyon zenginleştirme bölgesinde uygulanan voltaj, iyonik kuvvet ve pH engellenir. Bu ayrıntılı video protokolü mikroakışkan cihazlara katyon değişim membranları entegre ve geleneksel bir oranla yeni ICP platformu önderiştirme performansını göstermek için basit bir yöntem göstermek için tasarlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Katyon Değişimi 1. Fabrikasyon mikroakışkan Chips Membran entegre

  1. Silikon ustaların hazırlanması
    1. Tasarım silikon ustaların iki çeşit: bir katyon değiştirme reçinesi ve polidimetilsiloksan (PDMS) bir mikrokanalı oluşturmak için diğer model için.
      NOT: ayrıntılı geometrisi adımları 1.3.1 ve 1.4.1 bir şekilde tarif edilecektir.
    2. Geleneksel fotolitografi veya 27 gravür derin reaktif iyon birini kullanarak silisyum ustaları Üretiyor.
    3. 30 dakika boyunca bir vakum kavanoz trichlorosilane (~ 30 ul) ile micropatterned silikon ustaları Silanize.
      UYARI: Trichlorosilane yanıcı ve akut toksisite (inhalasyon, ağızdan yutma) sahip bir piroforik sıvıdır.
  2. PDMS kalıpların hazırlanması
    1. 10 bir sertleştirici madde ile birlikte bir silikon elastomer başlangıç ​​karışımı: 1 oranında ve vulkanize edilmemiş PDMS ile fincan yeri(30-40 mL silikon 4-in gofret mikro çoğaltılması için), 30 dakika için bir vakum kavanoz kabarcıklarını çıkarmak için.
      NOT: silikon ham vinil grupları ve bir platinyum bazlı katalizör ile sona eren siloksan oligomer içerir. Sertleştirme ajanı üç silikon-hidrür bağları 28 olan oligomer çapraz bağlantı içerir.
    2. Silikon ustaları vulkanize edilmemiş PDMS dökün bir üfleyici ile kabarcıklarını çıkarmak ve bir konveksiyon fırınında, 2 saat boyunca 80 ° C'de PDMS tedavi.
    3. Bıçakla PDMS şekil düzgün silikon ustaları tedavi PDMS ayırın ve (Şekil 2A-B'de görüldüğü gibi, kare şekiller IV).
  3. Katyon değişim membranları desenlendirme
    1. iki paralel Mikrokanallarda dik PDMS kalıp yarısı kesilmiş ve bir 2.0 mm biyopsi yumruk ile PDMS kanalları ucunda delikler.
      NOT: katyon seçici membran desenlendirme için PDMS kalıp iki par vardırallel mikrokanallar (genişlik: 100 mikron; height: 50 mikron; kanallar arası mesafe: 100 mikron; Şekil 1a). kalıbın orijinal şekil kesme hattı boyunca dilimlenmiş kalıp yansıtma hayal edilebilir. L şeklindeki mikrokanallar örtüşen olmadan iki delik delme için tavsiye edilir.
    2. Bir cam slayt ve bant ile PDMS kalıp ve bir körük temizleyin ve aralarında geri dönüşümlü eki oluşturmak için cam slayt üzerine kalıp koydu.
    3. Microflow model verme tekniği 29 göre, basamak dilimlenmiş kanalın açık ucunda bir katyon değiştirme reçinesinin 1.3.1 salma ~ 10 uL (Şekil 1b). Delikli delikleri şırınga başını yerleştirin ve pistonu (Şekil 1b siyah oklar) çekin; hafif bir negatif basınç katyon değişim reçinesi çeker ve reçine iki kanalı dolduracaktır.
      NOT: Mikrokanallı yüksekliği daha fazla 15 olması tavsiye edilir81 m, reçinenin viskozitesi yüksek kanallarını doldurmak için yüksek basınç gerektirir. Öte yandan, desenli iyon seçici membran daha kalın 1 um hale gelmesi nedeniyle, boy, 100 um'den daha fazla olmayan daha iyi olduğu; Böyle kalın bir zar membran ve PDMS kanal 13 arasında bir boşluk yaratabilir.
    4. desenli reçine dokunmadan PDMS kalıp ayırın ve reçine içinde çözücünün buharlaştırılması için 5 dakika boyunca 95 ° C 'de ısıtma cam slayt yerleştirin.
      NOT: Desenli zarının kalınlığı <1 mikron genellikle daha azdır. Kalıp hafifçe açık uçlu tarafı için kalıp hinging ile müstakil (noktalı çizgi ve şekil 1b ok gibi). Bu reçine doldurduktan sonra kalıba az 1 dakika ayırmak en iyisidir. Kalıp bir kaç dakika sonra ayrılmış ise, kalın zarlar elde edilebilir, ancak bunlar kılcal etki içbükey bir şekle sahip olacaktır.
    5. Gereksiz soyunbir jiletle desenli membran kısmı, iki ayrılmış hattı-desen (Şekil 1c) adrestir.
      Not: Burada kullanılan katyon değişimli malzeme kuvvetli cama bağlı değildir desen anlamına grupları perfluorinatlı sahiptir. Bu nedenle, basit bileme yöntemi kolayca membranın gereksiz kısmını kaldırabilirsiniz.
  4. Mikrokanallı ve membran desenli substrat Entegrasyonu
    1. mikro uçlarında iki delik ve membran desen adım 1.3 imal membran desenli alt tabaka PDMS kanalı bağlandıktan sonra yer alacak bir iki delikler.
      Not: PDMS mikro bir kanal vardır (: 50-100 mikron; height: genişlik 10 mm), ancak komşu kanal (Şekil 1d) uçlarına bağlanır.
    2. W 100 ve 50 mTor 40 s için hemen oksijen plazma tedavi sonrası membran desenli alt tabaka PDMS mikrokanalı Bond.
      NOT: Mikrokanallı ortasında dik desenli membran yerleştirin.

2. ICP Önderiştirme

  1. Deney hazırlığı
    1. 1-100 mM KCI, 1 mM NaCI içeren, çeşitli test solüsyonları hazırlayın (pH 7), 1 mM NaCI ve 0.2 mM HCI (pH ~ 3.7), 1 mM NaCI ve 0.2 mM NaOH (pH karışımının karışımı, ~ 10.3), ve 1 x fosfat tamponlu tuzlu su.
    2. test çözeltileri için negatif yüklü floresan boya (~ 1.55 uM) ekleyin.
      NOT: Bu yüklü boyaları bir elektrik akımı 30, 31 katkı böylece ilave boya konsantrasyonu tuzu iyonları (<10 uM) çok daha düşük olması gerekir.
    3. Kanalın bir rezervuar örnek çözümü yükleyin ve çözümü ile kanal doldurmak için diğer rezervuar negatif basınç uygulayın. r tarafından hidrodinamik iki rezervuar bağlayınbüyük damlacık eleasing kanalı (Şekil 2a) boyunca basınç farkı ortadan kaldırmak için.
    4. rezervuar ICP etkisi telafi için bir şırınga ya da bir pipet kullanılarak tampon çözeltileri (1 M KCI ve 1 M NaCI) ile katyon değiştirme modelleri bağlı iki rezervuar, doldurun.
    5. İki desenli membranların (sağda solda rezervuar ve katot üzerinde anot) karşısında, rezervuarlar de tellerini yerleştirin ve kaynak ölçüm ünitesi (Şekil 2a) ile bağlayın.
  2. ICP olgusu ve ICP önderiştirme görselleştirme
    1. bir ters Epifloresans mikroskop ICP cihazı yükleyin. bir gerilim (0,5100 V) uygulayın ve bir kaynak ölçüm birimi ile cari tepkisini ölçmek.
    2. Bir şarj çiftli aygıt kamera ile floresan görüntüler yakalayın ve görüntüleme yazılımını 32 kullanılarak floresan yoğunluğu analiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir zar ile tümleşik mikroakışkan ön yoğunlaştıncı şematik üretim adımları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. imalat ayrıntılı bir tarif protokolü verilmiştir. Tasarımları ve spatiotemporally tanımlanan ön yoğunlaştıncı 26 cihaz görüntüleri geleneksel bir ön yoğunlaştıncı 11 (Şekil 2) olanlar ile tezat vardır. Spatiotemporally tanımlanan ön yoğunlaştıncı ICP fenome...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bir 10.000 kat elde, imalat protokolü ve uygulanan voltajı (0.5-100 V), iyonik kuvvet (1-100 mM) aralığında bir spatiotemporally tanımlanan ön yoğunlaştıncı performansını ve pH (3,7-10,3) tanımlamışlardır 10 dakika içinde boyalar ve protein zenginleştirme. Bir önceki ICP cihazlar gibi, zenginleştirme performansı yüksek gerilimde daha iyi ve daha düşük iyonik güçte olur. Burada düşünebilirsiniz ek bir parametre iki katyon değişim zarlarının arasındaki mesafedir. Biz arası zar mesafe a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

This work was supported by the internal fund of the Korea Institute of Science and Technology (2E26180) and by the Next Generation Biomedical Device Platform program, funded by the National Research Foundation of Korea (NRF-2015M3A9E202888).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Sylgard 184 Silicone Elastomer kitDow Corning
TrichlorosilaneSigma Aldrich175552Highly toxic
Nafion perfluorinated resin, 20 wt%Sigma Aldrich527122
Sodium chlorideSigma Aldrich71394
Potassium chlorideSigma Aldrich60121
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, succinimidyl esterInvitrogenA20000
Isothiocyanate-conjugated albuminSigma AldrichA9771
Phosphate buffer saline, 1xWengeneLB004-02
Tween 20Sigma AldrichP1379
Epifluorescence microscopeOlympusIX-71
Charged-coupled device cameraHamamtsu Co.ImageEM X2
Source measurement unitKeithley Instruments2635A
Covance-MPFemto Science

Referanslar

  1. Probstein, R. F. Physicochemical Hydrodynamics: An Introduction. , Wiley-Interscience. New York. (2003).
  2. Strathmann, H. Ion-Exchange Membrane Separation Processes. , Elsevier. Amsterdam. (2004).
  3. Dydek, E. V., et al. Overlimiting Current in a Microchannel. Phys. Rev. Lett. 107 (11), 118301(2011).
  4. Kwak, R., Pham, V. S., Lim, K. M., Han, J. Y. Shear flow of an electrically charged fluid by ion concentration polarization: scaling laws for electroconvective vortices. Phys. Rev. Lett. 110 (11), 114501(2013).
  5. Rubinstein, I., Zaltzman, B. Electro-osmotically induced convection at a permselective membrane. Phys. Rev. E. 62 (2), 2238-2251 (2000).
  6. Kwak, R., Kim, S., Han, J. Continuous-flow biomolecule and cell concentrator by ion concentration polarization. Anal. Chem. 83 (19), 7348-7355 (2011).
  7. Jeon, H., Lee, H., Kang, K. H., Lim, G. Ion concentration polarization-based continuous separation device using electrical repulsion in the depletion region. Sci.Rep. 3, 3483(2013).
  8. Kim, S. J., Ko, S. H., Kang, K. H., Han, J. Direct seawater desalination by ion concentration polarization. Nat. Nanotechnol. 5 (4), 297-301 (2010).
  9. MacDonald, B. D., Gong, M. M., Zhang, P., Sinton, D. Out-of-plane ion concentration polarizationfor scalable water desalination. Lab Chip. 14 (4), 681-685 (2014).
  10. Schoch, R. B., Han, J. Y., Renaud, P. Transport phenomena in nanofluidics. Rev.Mod. Phys. 80 (3), 839-883 (2008).
  11. Kim, S. J., Song, Y. A., Han, J. Nanofluidic concentration devices for biomolecules utilizing ion concentration polarization: theory, fabrication, and applications. Chem. Soc. Rev. 39 (3), 912-922 (2010).
  12. Mai, J. Y., Miller, H., Hatch, A. V. Spatiotemporal mapping of concentration polarization Induced pH changes at nanoconstrictions. ACS Nano. 6 (11), 10206-10215 (2012).
  13. Kim, B., et al. Tunable ionic transport for a triangular nanochannel in a polymeric nanofludic system. ACS Nano. 7 (1), 740-747 (2013).
  14. Mangano Syed, A., Mao, L., Han J, P., Song, Y. -A. Creating sub-50 nm nanofluidic junctions in a PDMS microchip via self-assembly process of colloidal silica beads for electrokinetic concentration of biomolecules. Lab Chip. 14, 4455-4460 (2014).
  15. Wang, Y. C., Stevens, A. L., Han, J. Y. Million-fold preconcentration of proteins and peptides by nanofluidic filter. Anal. Chem. 77 (14), 4293-4299 (2005).
  16. Lee, J. H., Cosgrove, B. D., Lauffenburger, D. A., Han, J. Microfludic concentration-enhanced cellular kinase activity assay. J. Am. Chem. Soc. 131 (30), 10340-10341 (2009).
  17. Cheow, L. F., Han, J. Y. Continuous signal enhancement for sensitive aptamer affinity probe electrophoresis assay using electrokinetic concentration. Anal. Chem. 83 (18), 7086-7093 (2011).
  18. Ko, S. H., et al. Nanofluidic preconcentration device in a straight microchannel using ion concentration polarization. Lab Chip. 12 (21), 4472-4482 (2012).
  19. Gong, M. M., Nosrati, R., Gabriel, M. C. S., Zini, M., Sinton, D. Direct DNA analysis with paper-based ion concentration polarization. J. Am. Chem. Soc. 137 (43), 13913-13919 (2015).
  20. Hong, S., Kwak, R., Kim, W. Paper-based flow fractionation system applicable to preconcentration and field-flow separation. Anal. Chem. 88 (3), 1682-1687 (2016).
  21. Han, S. I., Hwang, K. S., Kwak, R., Lee, J. H. Microfluidic paper-based biomolecule preconcentrator based on ion concentration polarization. Lab Chip. 16, 2219-2227 (2016).
  22. Zangle, T. A., Mani, A., Santiago, J. G. Theory and experiments of concentration polarization and ion focusing at microchannel and nanochannel interfaces. Chem. Soc. Rev. 39 (3), 1014-1035 (2010).
  23. Mani, A., Bazant, M. Z. Deionization shocks in microstructures. Phys. Rev. E. 84, 061504(2011).
  24. Slouka, Z., Senapati, S., Chang, H. C. Microfluidic systems with ion-selective membranes. Annu. Rev.Anal. Chem. 7, 317-335 (2014).
  25. Kirby, B. J., Hasselbrink, E. F. Zeta potential of microfluidic substrates: 1. Theory, experimental techniques, and effects on separations. Electrophoresis. 25 (2), 187-202 (2004).
  26. Kwak, R., Kang, J. Y., Kim, T. S. Spatiotemporally defining biomolecule preconcentration by merging ion concentration polarization. Anal. Chem. 88 (1), 988-996 (2016).
  27. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  28. Campbell, D. J., et al. Replication and compression of surface structures with polydimethylsiloxane elastomer. J. Chem. Educ. 76 (4), 537-541 (1999).
  29. Lee, J. H., Song, Y. A., Han, J. Y. Multiplexed proteomic sample preconcentration device using surface-patterned ion-selective membrane. Lab Chip. 8 (4), 596-601 (2008).
  30. Kwak, R., Guan, G., Peng, W. K., Han, J. Microscale electrodialysis: concentration profiling and vortex visualization. Desalination. 308, 138-146 (2013).
  31. Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81, 3022-3028 (2009).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. U.S. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
  33. Minerick, A. R., Ostafin, A. E., Chang, H. C. Electrokinetic transport of red blood cells in microcapillaries. Electrophoresis. 23 (14), 2165-2173 (2002).
  34. Phan, D. -T., Shaegh, S. A. M., Yang, C., Nguyen, N. -T. Sample concentration in a microfluidic paper-based analytical device using ion concentration polarization. Sens. Actuators B. 222, 735-740 (2016).
  35. Rubinstein, S. M. Direct observation of a nonequilibrium electro-osmotic instability. Phys. Rev. Lett. 101, 236101(2008).
  36. Ouyang, W., et al. Microfluidic platform for assessment of therapeutic proteins using molecular charge modulation enhanced electrokinetic concentration assays. Anal. Chem. 88, 9669-9677 (2016).
  37. Cheow, L. F., Sarkar, A., Kolitz, S., Lauffenburger, D., Han, J. Detecting kinase activities from single cell lysate using concentration-enhanced mobility shift assay. Anal. Chem. 86, 7455-7462 (2014).
  38. Chen, C. -H., et al. Enhancing protease activity assay in droplet-based microfluidics using a biomolecule concentrator. J. Am. Chem. Soc. 133, 10368-10371 (2011).
  39. Kwak, R., Pham, V. S., Kim, B., Lan, C., Han, J. Enhanced salt removal by unipolar ion conduction in ion concentration polarization desalination. Sci. Rep. 6, 25349(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 120iyon konsantrasyon polarizasyonzenginle tirmeiyon de i im membranlak melektro ozmotik akelektro ozmotik istikrars zl k overlimiting

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır