<em&gt; Ex Vivo</emAntimikrobiyal Konak savunma Çalışmaları&gt; Kolon Organ Kültür ve Kullanımı

Özet

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

Özet

bağırsak epitel hücrelerinin, farklı türde lamina bağışıklık hücrelerini ihtiva eden propia ve stroma oluşan tekrarlanan kript yapılarının bir mimariyi gösterir. Bu heterojen hücrelerin tüm intestinal homeostasis katkıda bulunmak ve antimikrobiyal konak savunmasında katılmak. Bu nedenle, in vitro ortamda bir bağışıklık yanıtı ve bağırsak antimikrobiyal aktivitesini incelemek için bir vekil örneğin belirlenmesi son derece zordur. In vitro çalışmalar, normal bağırsak ve mikroçevresinin tam fizyolojisini temsil etmemektedir organoid kültür ölümsüzleştirdi bağırsak epitel hücre hatları ya da birincil crypt kullanarak. Burada, bir kültür kabı ve bunun nasıl ex vivo organ kültürü sistemi antimikrobiyal konak savunma yanıtları ile ilgili çalışmalarda uygulanabilir kültürlemenin fare kolon dokusu için bir yöntem tartışılmaktadır. Örnek deneylerde, organ kültüründe kolonlar resp antimikrobiyal peptitleri ifade olduğunu göstermiştireksojen IL-1 ve IL-18'e Onse. Ayrıca, organ kültüründe kolon dokular tarafından üretilen antimikrobiyal efektör molekülleri verimli in vitro Escherichia coli öldürmek. Bu yaklaşım, bu nedenle, bağırsak doğuştan gelen bağışıklık yanıtlarını ve antimikrobiyal bir ev sahibi savunma tepkilerini düzenleyen patojen ve tehlike ilişkili moleküler desen ve hücresel reseptörlerin rol incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Bağırsak, ortakçı mikroorganizmalar için bir bariyer olarak görev yapan bir dinamik bir sistemi temsil eder, işgalci patojenlere karşı mücadele ve mikrobik bileşim ¹ düzenler. bağırsak epitel hücreleri, enterositlerde, goblet hücreleri, Paneth hücreleri ve enteroendokrin hücrelerden oluşan, bağırsak mikrobıyota karşı konak savunma yanıtları sağlamak önemli hücre popülasyonları vardır. Goblet hücreleri epitel tabakası ^2'nin üstünde bir askerden arındırılmış bölge oluşturmak müsinleri üretirler. Paneth hücreleri ve enterositler antimikrobiyal peptidler, sitokinler ve antimikrobiyal konak savunma yanıtları oluşturan ve bağırsak mikrobiyal kompozisyon ^{3, 4} şekillenmesine katkı reaktif oksijen ve nitrojen türlerinin üretirler. epitel hücrelerine ek olarak, makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller, doğal katil hücreler, lenfositler ve Inna gibi immün hücrelerin ^{7 -} lamina propria ve submukozada te lenfoid hücreler üreten sitokinler, kemokinler ve diğer arabulucular ⁵ bağırsak antimikrobiyal konak savunma yanıtları kritik bir rol oynamaktadır. mukozal bağışıklık sistemi Mikrobiyota düzenler ve mikrobik enfeksiyonlara karşı koruma sağlar anlamak amacıyla, gut heterojen hücre popülasyonu karmaşık etkileşimi dikkate alınması önemlidir. Bununla birlikte, bağırsak tüm özelliklerini kapsayan bir in vitro model için mevcut değildir. Bu nedenle, bağırsakta konak-patojen etkileşimi üzerinde moleküler çalışmalar son derece zordur.

Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, bağırsak mukozasının yönlerini taklit birkaç model sistemler enflamatuar barsak hastalıkları (IBD) ve diğer gastrointestinal bozukluklar ⁸ katılan patofizyolojik süreçlerin araştırılması için geliştirilmiştir ^-= "xref"> 14. Ölümsüzleştirilmiş intestinal epitelyal hücre hatları genellikle epitel hücre spesifik yanıtlar incelemek için kullanılır. Bununla birlikte, farklı gen ifadesi ve ölümsüzleştirilmiş hücre fonksiyon, veriler genellikle, in vivo çalışmalarda gözlenen ile eşleşmiyorsa, bu hücreler kullanılarak elde edilen. Son zamanlarda farklı uyaranlara ¹³ bağırsak epiteli yanıtını değerlendirmek için potansiyel bir araç olarak ortaya çıkmıştır organoid kültür bağırsak crypt. Bu sistemde, kript kök hücrelerin büyümesine ve 3D organoid yapısını geliştirmek için izin verilir. organoid kültür sistemi, bağırsak epiteli birçok açıdan çalışmak için çok yararlı olsa da, bağışıklık hücreleri, epitel hücreleri ve mikrobiyal ürünler kompleks bir etkileşim taklit etmez. Bağırsak dokusunun ex vivo kültür içinde in vivo konukçu savurma tepkilerin daha iyi bir temsilini sunar. Bu yöntemde, bağırsağın bir bölümü, bir hücre kültür plakası wit kültürlenirbağırsakta hücre popülasyonlarının farklı sağlayan h uygun ortam en az 48 saat süreyle metabolik olarak aktif olması için. Bu nedenle, organ, bir ex vivo kültür antimikrobiyal gen ekspresyonunu ve belirli bir uyarana bağırsak konak savunma tepkilerini ölçmek için kullanılabilir.

^{21 -} Müfettişler bağırsakta ¹⁵ mikrobiyal enfeksiyonlara karşı konak savunma yanıtları incelemek için ex-vivo organ kültürü sistemi kullanılarak edilmiştir. Biz son zamanlarda fare iki nokta üst üste ²² antimikrobiyal konak savunma yanıtları inflammasome rolünü incelemek için organ kültürü sistemini benimsemiştir. inflammasome olgunlaşmış IL-1 p ve IL-18 üretimi için gerekli olan kaspaz-1 aktivasyonu için moleküler bir platformdur. Bu, IL-1β ve IL-18, E. coli gibi etkili bir ortakçı pathobionts öldürmek antimikrobiyal peptitler neden olduğunu gösterdi . Bu gözlem, inflammasome kusurlu fare kolon ²² artmış, E. coli yükü ile tutarlıdır. Bu sistem, bu nedenle bu tür enflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD) ve kolorektal kanserin (CRC) gibi, bağırsak rahatsızlıklarının bağırsak antimikrobiyal konak savunma karşılıklarında eden örüntü tanıma reseptöleri (PRR'ler) ve diğer doğal bağışıklık moleküllerinin rolü ve hastalık oluşumunun incelenmesinde kullanılabilir. Bu genlerin çoğu bağırsağında değiştirilmiş mikrobiyal bileşim ile ilişkilidir 200'den IBD yatkınlık genleri ve mutasyon vardır. Bu IBD-yatkınlık genleri bağırsak Mikrobiyota düzenleyen hangi aracılığıyla hassas mekanizmasını belirlemek için büyük bir klinik öneme sahiptir. Bu yöntemin genel amacı, ex vivo kolon organ kültürü temel bir protokol tanıtmak ve bu kültür yöntemi bağırsak antimikrobiyal konak savunma yanıtları incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektir.

Protokol

Burada açıklanan tüm deneyler Hayvan Resource Center (ARC), UT Southwestern Tıp Merkezi'nde belirli bir patojen free (SPF) tesiste muhafaza 6-8 haftalık erkek vahşi tip (C57BL6 / J) fareleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm çalışmalar Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve IACUC kurallarına ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes göre yapılmıştır.

1. Toplama ve Colon hazırlanması

1. Servikal dislokasyon tarafından takip CO ₂ boğulma ile fareler Euthanize.
2. % 70 etanol ile fareler Sprey ve gemide aşağı fare dorsal yüzü tutmak iğneleme kuruluna bacaklarda pin.
3. önceden sterilize edilmiş kesme makasları ve forseps kullanarak, karın periton bir orta hat kesi yapmak. forseps ile periton katlanarak karın açın.
4. karın boşluğu wi gelen bağırsak kaldırinci forseps ve makas diseksiyon. çekum alt ve rektum diğer ucunda kesilerek ince bağırsaktan kolon ayırın.
5. buz soğukluğunda PBS içeren steril bir petri kolon yerleştirin. kolon lümeni içinde dışkı tamamen kaldırılması, bir 20 G iğne veya oral gavaj iğnesi tutan bir 20 ml şırınga kullanılarak buz gibi soğuk PBS ile kolonun lümen içeriği çalkalayın.
6. uzunlamasına makasla kolon kesin. Steril bir Petri kabındaki buz gibi soğuk PBS ile şiddetli bir şekilde çalkalayarak kolon yıkayın.
7. yaklaşık 1 cm uzunluğunda bir steril neşter veya makas kullanarak parçalar halinde kolon doku kesin.
8. Kolon parçaları ağırlığını kaydedin.
   Not: Bölüm 1 'de tüm adımlar içinde ya da biyolojik güvenlik kabini dışındaki ya da gerçekleştirilebilir. Kolonlar kültür için hazır olduğunda, tüm adımları kısırlık korumak için bir biyolojik güvenlik kabini içinde yapılmalıdır.

2. Kolon Orgbir Kültür

1. 6 oyuklu hücre kültürü plakasının bir hücre süzgecinden (100 um) yerleştirin. hücre süzgecinden içine bir fare toplanan kolon parçalarının hepsini aktarın.
2. % 5 FBS, penisilin-streptomisin (1x) ve gentamisin (20 ug / ml) ihtiva eden 5 ml DMEM / F12 ortamı ekleyin. Tamamen medya ile kolon parçaları kapsamaktadır.
3. % 5 _CO2 ve% 95 hava içeren bir inkübatörde 37 ° C'de 2 saat süreyle inkübe edin.
4. Hücre süzgeç kaldırın ve medya aspire.
5. geri çukuruna hücre süzgeç yerleştirin ve herhangi bir antibiyotik olmadan 5 ml taze medya ekleyin. Hücre süzgeç kaldırın ve medya aspire.
6. bakiye antibiyotikler kaldırmak için yukarıdaki yıkama adımı (adım 2.5) iki kez daha (toplam 3x) tekrar edin.
7. steril 12-yuvalı hücre kültürü plakasının tek kuyuya tek bir hücre süzgecinden alınan kolon parçaları aktarın.
8. (Antibiyotikler olmadan),% 5 FBS içeren DMEM / F12 ortamı ekleyin. Weig ile orta ses seviyesini ayarlamakKolon parçaları HT örneğin, doku, 100 mg, 1 ml aracı. % 5 _CO2 ve% 95 hava enjekte bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 12 saat boyunca inkübe edilir.
9. steril 1.5 ml tüp içinde kültür süpernatant toplayın.
10. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 12,000 x g'de santrifüjleyin. deneyi ve / veya diğer bağışıklık tahlilleri öldürme bakteride kullanım için yeni bir 1.5 ml tüp içine yüzey maddesi ayrılır. Süpernatan, deneye kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
11. RNA izolasyonu için bir tüp kolon parçaları toplamak.

Öldürme Denemesi 3. E.coli

1. 15 ml'lik bir tüp içinde 5 ml Luria-Bertani (LB) sıvısında E. coli inoküle ve gece boyunca 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin. biraz gevşek kültür tüpünün kapağını tutun.
2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1200 x g'de bakteriyel kültür tüpü santrifüjleyin. Süpernatantı ve 5 mi buz soğukluğunda PBS içine bakteriyel pelletini.
3. Bact Devri 1 mL600 nm 'de bir küvet ve ölçü OD içine eri süspansiyon. Bir boş olarak PBS kullanın.
4. önceden tespit edilmiş bir standart eğri kullanılarak koloni oluşturan birimi (CFU) hesaplayın. Burada, bu 1 OD = 2 x 10 ⁹ kob / ml (yaklaşık) varsayalım.
5. Stok süspansiyon 1 x 10 ⁵ cfu / ml yapmak için bakteri süspansiyonu sulandırmak.
6. 24-iyi hücre kültür plakası yinelenen kuyulara Bölüm 2.10 toplanan kolon organ kültür süpernatant aktarın (500 ul / oyuk).
7. Bir de içeren 500 uL kolon organ kültürü süpernatant içine 10 uL E.coli kültürü (1.000 cfu) ekleyin. Kolon, organ kültür süpernatanı herhangi bir bulaşmayı içermiyor onaylamak için herhangi bir E.coli aşılamadan olmadan başka kuyu bırakın.
8. Bir kontrol olarak bir antibiyotiksiz kültür ortamı (DMEM / F12 +% 5 FBS) içinde bakteri aynı sayıda (1.000 CFU) inkübe edin.
9. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
10. Her bir örnek açılan wi 50 uL yerleştirinMacConkey agar plaklarına se. gece boyunca 37 ° C 'de MacConkey agar plakaları inkübe edin.
11. kolonilerin sayısını ve kob / ml hesaplayın.

4. Kolon Antimikrobiyal Konak savunma Yanıtları üzerinde Dış ve iç Faktörlerin Etkisi

NOT: Burada açıklandığı gibi antimikrobiyal öldürme tahlil organ kültürü süpernatant bakterisidal aktivitesi üzerine patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) ve sitokinler etkisini incelemek üzere kabul edilebilir. IL-1 ve IL-18 ile bu deney bir örneği, aşağıda tarif edilmektedir.

1. Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi farelerden nokta üst üste toplar.
2. steril bir kağıt havlu üzerine kolon yerleştirin. Makas kullanarak üç bölümden (Şekil 2) içine uzunlamasına kolon kesin.
3. Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi bu gibi soğuk PBS kolonun her bir bölümü yıkayın.
4. küçük parçalar halinde kolonun her bir parçasını kesin ve aseptik tartın. her bir parçanın parçaları aktarın6-yuvalı hücre kültürü plakasının üç kuyu (Şekil 2) üzerine yerleştirilmiş üç ayrı hücre süzgeçler (100 um) olarak kolonun.
5. % 5 FBS, penisilin-streptomisin (1x) ve gentamisin (20 ug / ml) ihtiva eden 2 ml DMEM / F12 ortamı ekleyin.
6. % 5 _CO2 ve% 95 hava enjekte bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edilir.
7. 2.4-2.6 de tarif edildiği gibi kolon parçaları yıkayın. steril 12-yuvalı hücre kültürü plakasının tek kuyuya tek bir hücre süzgecinden kolon parçaları aktarın. Tek bir fare kolon üç parça içeren üç kuyu (Şekil 2), tedavi edilmemiş, IL-1 olarak adlandırılan, ve IL-18 olmalıdır.
8. (Antibiyotikler olmadan),% 5 FBS içeren DMEM / F12 ortamı ekleyin. Kolon parçaları ağırlığı, örneğin, doku 100 mg 1 ml orta ile orta ses seviyesini ayarlayın.
9. 12 saat, IL-1 p (20 ng / ml) ya da IL-18 (20 ng / mL) ile kolon organ kültürü teşvik. Tedavi edilmeyen kolon Organ kültürü kontrol olarak hizmet vermektedir.
10. % 5 _CO2 ve% 95 hava enjekte bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 12 saat inkübe edildikten sonra, steril bir 1.5 ml bir tüp içinde kültür süpernatan toplamak.
11. 24-iyi plaka çift kuyulara 500 uL kültür süpernatant aktarın.
12. Her bir durum için, Bölüm 3'te tarif edildiği gibi tek bir kuyuda E. coli inoküle, kolon organ kültür yüzey maddesinde E. coli (1000 CFU) inoküle. E. coli olmadan diğer iyi içeren aynı organ kültürü süpernatant bakteriyel kontaminasyon için bir kontrol olarak görev yapacak.
13. Bir kontrol olarak bir antibiyotiksiz kültür ortamında bakteri aynı miktarda inkübe edin.
14. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
15. damla damla MacConkey agar plakaları üzerinde her numunenin 50 uL yerleştirin. gece boyunca 37 ° C'de MacConkey agar plakaları inkübe edin.
16. Kolonilerin sayısını ve kob / mL (Şekil 4) hesaplayın.

e_title "> 5. Antimikrobiyal Genlerin İfade ölçümü

1. kolon organ kültürü bir gece inkübe (12 saat) sonra, 2 ml buz soğukluğunda PBS (2x) ile kolon parçaları yıkama Bölüm 2 ve 4'te tarif edildiği gibi.
2. 2 ml RNaz / DNaz ücretsiz vidalı kapaklı tüp içine kolon parçaları toplamak. buz üzerinde tüpler yerleştirin.
3. tüp içine 1 ml ticari bir Trizol reaktif ve yokedici matris boncuk ekleyin.
4. Lyse otomatik bir doku homojenleştirici kullanılarak doku.
5. Bir yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine doku lizatındaki toplayın.
6. standart protokolü kullanarak RNA izole.
7. RNA konsantrasyonu ölçün.
8. iyonu giderilmiş su ile uygun bir şekilde RNA seyreltilir ve cDNA sentezi için, 500 ng RNA kullanın.
9. hedeflenen antimikrobiyal gen, sitokinler, kemokinler ve diğer ilgi genleri gerçek zamanlı RT-PCR analizi için cDNA'nın kullanılmasıdır.

Sonuçlar

Organ kültüründe iki nokta üst üste bir temsili resmi, Şekil 1 'de gösterilmiştir. kültürde kolon parçaları metabolik ve fizyolojik olarak aktif kalır. Bu kültür ortamına ilave ekzojen uyarıcılara etkin yanıt. Ex vivo kültür ve dış uyarılara ile uyarma, örneğin IL-1 ve IL-18 için kolon dokusunun hazırlanması şematik bir iş akışı, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Organ kültüründe kolonlar gibi a...

Tartışmalar

Bağırsak epitelial hücreler büyüme şartları açısından çok hassas ve kültür nedenle zordur. EDTA muamelesi ile izole epitel hücreler, DMEM ⁸ gibi geleneksel hücre kültür ortamında hayatta yoktur. Bu nedenle, izole crypt veya birincil epitel hücreleri kullanılarak konak-patojen etkileşim çalışmaları çok zorlu. Son zamanlarda, Sato ve ark. Bağırsak patofizyolojisi ¹³ ile ilgili çalışmalar için çok umut verici ve yararlı bir crypt organoid kü...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/ F12	Life Technologies	12634-010
Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride	Sigma	5634
FBS, heat inactivated	Sigma	F4135
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063
Gentamicin solution	Sigma	G1272
Mouse IL-1b recombinan	Reprokine	RKP10749
Mouse IL-18 recombinant	Reprokine	RKP70380
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Difco Luria-Bertani Broth	BD Bioscience	244620
BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar	Fisher Scientific	DF0075-17-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		Uded to measure RNA concentration
UV/Vis Spectrophotometer	BECKMAN	DU 530	Used to determine E. coli count
iScript RT Supermix, 100 rxns	Bio-Rad	1708841
iTaq Univer SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725125
Lysing Matrix S (1/8"), 2 ml Tube	MP Biomedicals	116925500	Used to homgenize colon organ for RNA isolation
FastPrep-24 5G System	Bio-Rad	116005500
100 mm x 15 mm Petri Dish	Falcon	5687
Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile	Cellstar	5085
100 μm cell strainer	Falcon	5698
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Sorvall ST40R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Forma Scientific orbital shaker	Thermo Fisher Scientific