JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.

Özet

elastik hidrojel yüzeyinde biyomoleküllerin temas baskılı kombinasyonları oluşur microfabricated hücresel mikroarray'ler, hücre farklılaşması üzerine dizilmiş biyokimyasal sinyallerin etkisini ölçmek için bir sıkı kontrol, yüksek verimli mühendislik sistem sağlamak. Hücre mikrodiziler kullanarak Son çalışmalar, birçok microenvironmental faktör paralel olarak sunulduğu kombinasyon çalışmaları için kendi programını ortaya koymuştur. Ancak bu çabalar hücre yanıtları biyokimyasal ipuçlarının etkilerini araştıran öncelikle odaklanmıştır. Burada, çekiş kuvveti mikroskobu ile immünofloresan ve biyomekanik hücre-substrat etkileşimleri hem hücre farklılaşması değerlendirmek için ayarlanabilir malzeme özelliklerine sahip bir cep mikroarray platformu sunuyoruz. Bunu yapmak için, biz ya mikroskop lamı veya cam alt Petri kapları üzerinde fabrikasyon Young modülü değişen poliakrilamid hidrojeller kullanan iki farklı biçimleri geliştirmişlerdir. Biz bes sağlamakBu hidrojel yüzeylerde microarrays imalat, mikrodizinlerinde sonraki hücre kültürü ve veri edinimi için t uygulamaları ve sorun giderme. Bu platform da biyokimyasal (örneğin, hücre dışı matris bileşimi) hem ve biyofiziksel (örneğin, alt-tabaka sertliği) işaretler rolleri kesişen önemli oynayabilir biyolojik proseslerin incelenmesi kullanılmak için çok uygundur.

Giriş

Hücre ve çevresindeki mikro-çevresel faktörler arasındaki etkileşimler geliştirme, homeostaz ve hastalığın patojenezi, 1, 2, 3, 4 boyunca biyolojik süreçlerin büyük bir çeşitlilik aracılık eder. Bu mikro-çevresel etkileşimler ligand-reseptörü aracılığıyla hücrelere çözünür faktörlerin teslim bağlayıcı hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri bulunmaktadır. Yukarıda biyokimyasal açıdan ek olarak, bu tür alt-tabaka mekanik özellikleri biofiziksel parametreleri (örneğin, Young modülü, gözeneklilik) ve hücre şekli ve ilişkili alt mechanotransduction artan hücre farklılaşması 5, 6, 7, 8, anahtar aracılar olarak tanındı adres 9 10. Bu microenvironmental etkileşimler kaynaklanan sinyaller gen ağları ve sinyal yolları girdi olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, bu hücre iç bileşenler aynı zamanda hücre hakiki genetik programlar ve hücre dış mikro-çevresel faktörlerin 5, 11, 12 arasındaki karmaşık eş düzenleyici döngü tamamlayan salgılanan faktörler ve matris-parçalayıcı enzimler yoluyla mikro geri bildirimde bulunur.

Mikro-çevresel faktörler tarafından kontrol edilen sunum için tasarlanmış sistemlerinin kullanımı farklı bağlamlarda 13, 14, 15, bir dizi yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle mikrofabrike sistemleri, minyatürleştirme 13 ile protein ve hücreleri hem de yüksek paralelleştirilmiş analiz hassas mekansal model oluşturmanın kolaylaştırmıştır 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Hücre mikrodizileri biyomoleküllerin kombinasyonları iletişim baskılı bir esnek poliakrilamid hidrojel alt-tabaka 23, 24, 25 üzerine olan bu tür bir mikrofabrike sistemi temsil eder. Hücre-yapışkan bileşenlerin (yani matriks proteinleri) dahil sık sık immünsitokimya ve floresan gazetecilere yoluyla aşağı analizi ile takip edilmektedir mikrodizinlerinde sürekli hücre yapışması ve kültürünü mümkün kılar. Hücre mikroarray'ler verimli karaciğer hücre fenotip 23, 26, nöral prekürsör farklılaşma 27 mammar geliştirilmiş bir anlayış elde yönelik edilmiştiry progenitör kader kararları 28, embriyonik kök hücre bakım / farklılaşma 23, 29, 30, akciğer kanseri metastazı 31 ve melanom 32 tedavi yanıtı. Son zamanlarda endoderm tarifnamede 33, karaciğer progenitör farklılaşma 34, 35, ve akciğer tümör hücre tedaviye yanıt 36 hücre dışı matris (ECM) protein bileşiminin rolünü tanımlamak için hücre mikrodizileri kullanımını göstermiştir. Bu çalışmalarda, biz dizi platformunun kombinasyon yeteneklerinin artırılması ve hücre dışı matriks kompozisyonu ve biyomekanik ile hücre içsel sinyalizasyon kavşakları keşfetmeye odaklanmıştır. Ayrıca, yetenek kantitatif şekilde karakterize sağlamak için bu dizi platformda biyofizik readouts hayata geçirdikfarklılaşma hücre kontraktilite terize rolü 35 işler. Bunu yapmak için, biz hücre tarafından üretilen çekiş yüksek verimlilik değerlendirilmesini sağlamak için hücre mikroarray'ler ile çekme kuvvet mikroskobu (TFM) entegre edilmiştir. TFM hücresi tarafından oluşturulan çekme kuvvetlerinin ölçülmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, bileşim ve yerel mikro-37, 38, 39, 40 biyomekanik tek-hücre ve doku düzeyinde işlev koordinasyonu ile ilgili önemli bilgiler sağlamıştır. Bu nedenle, hücre mikrodizileri ile TFM birleştiren temel fizyolojik olarak uygun biofiziksel parametreleri ölçmek için yüksek verimli bir sistem sağlar.

Burada anlatılan hücre mikroarray platformu dört bölümden oluşmaktadır: poliakrilamid yüzeylerde, diziler, hücre kültürü ve tahlil okuma üretiminde ve verilerin analizi imalatı. Görmekİlk üç deney bölümleri şematik özeti Şekil 1 'dir; immünofloresan verilerin analizi odaklanarak son bölümde bir şematik özeti için bakınız Şekil 2. Biyomekanik hücre alt-tabaka etkileşim çalışmalar hücre mikrodizi platformu adapte amacıyla, Wen et al başına ayarlanabilir Young modülü ama benzer gözenekli poliakrilamid substratlar kullanılır. 41. onların alt tabaka üzerinde hücreler tarafından uygulanan kuvvetlerin TFM ölçümleri etkinleştirmek için, biz sık sık diğer gruplar tarafından kullanılan slaytlar kalın cam mikroskop ek olarak cam alt Petri kabı biçimi uyguladı. Bu nedenle, bu hücre mikrodizi platformu ayrı cam alt yemekler TFM ile mikroskop lamı ve hücre tarafından üretilen kuvvetlerin immünofloresan ile hücre farklılaşmasının paralel ölçümler yeteneğine sahiptir. Biz de yaygın hücre mikroarray'ler ile kullanılan analitik yaklaşıma çeşitli iyileştirmeler uyguladık. Özelly, yerine genel ada yoğunluğu parametrik Z-puanlama, biz tek hücreli yoğunluğunu ölçmek ve normal olmayan dağılımlar için hesap ve daha doğru hücresel davranışını tanımlamak için kantil normalleşme uygulayın. Biz bu gelişmeler biyokimyasal ve biyofiziksel hem ipuçları önemli, kesişen rol oynadığı biyolojik süreçlerin araştırılması yönünde özellikle yarar sağladığına inanıyoruz. Ayrıca, bizim analitik gelişmeler tek hücreli ve nüfus seviyesi davranışı sapmak hangi hücresel fonksiyonları bir dizi çalışmalara hücre mikroarray'ler uygulanmasını sağlar.

Protokol

Poliakrilamid Yüzeyler 1. Fabrikasyon

  1. Temiz cam yüzeyler - hücre kültürü sırasında optimum poliakrilamid hidrojel imalat ve bütünlüğünü sağlamak amacıyla - son nokta immünfloresans veya cam-alt TFM için 35 mm Petri kapları için standart mikroskop slaytlar ya. Alternatif olarak, kullanım cam yüzeyler önceden temizlenmelidir.
    1. Triton X-100, distile su içinde (DH 2 O) hac /% 0.25 v cam substratlar bırakın. 30 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde substratlar yerleştirin.
    2. Triton X-100 çözeltisi çıkarın ve substratlar, 30 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde son durulama ve yerine batırma DH 2 O ara yüzeyler ile 5 kez yıkayın.
    3. DH 2 O çıkarın ve aseton substratlar batırmayın. 30 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde substratlar yerleştirin.
    4. aseton çıkarın ve metanol substratlar batırmayın. 30 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde substratlar yerleştirin.
    5. metanol çıkarın ve 2 O daldırın 0.05 N NaOH içinde substratlar ve yer.
      DİKKAT: NaOH son derece yakıcı ve Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olabilir. Koruyucu eldiven, giysi ve koruyucu gözlük takın.
    6. NaOH çözeltisi çıkarın ve alt tabakaları kuru ve kuruyana kadar sıcak bir levha üzerinde 110 ° C 'de fırında substratlar DH 2 O kullanımlar süzüldü basınçlı hava ile 5 kez yıkayın (5-15 dakika). Temizlenmiş substratlar süresiz oda sıcaklığında saklanabilir.
  2. poliakrilamid hidrojel yapışmasını sağlamak için temiz bir cam alt tabakaların Silanize.
    1. etanol içinde taze hazırlanmış% 2 h / h, 3- (trimetoksisilil) propil metakrilat (3-TPM) temiz bir cam alt tabakaların bırakın. 30 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde substratlar yerleştirin.
      DİKKAT: 3-TPM yanıcı bir sıvıdır. Isı, kıvılcım, açık alev ve sıcak yüzeylerden uzak tutun ve bir kimyasal davlumbaz sadece kullanın.
    2. 3-TPM çözüm çıkarın ve Etal substratlar batırmakHayır ben. 5 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde substratlar yerleştirin.
    3. (- 15 dakika 5) alt tabakaları kuru ve kuruyana kadar sıcak bir levha üzerinde 110 ° C 'de fırında filtre basınçlı hava kullanın. Silanlanmış yüzeyler 1 aya kadar oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
  3. 1. Seçenek: Son nokta immünofloresan için Silanlanmış mikroskop lamı üzerine poliakrilamid hidrojeller Üretiyor.
    1. DH bir pre-polimer solüsyonu hazırlayın 2 4 kPa (% 4 akrilamit,% 0.4 bisakrilamid), 13 kPa (% 6 akrilamid, 0.45 Young modüllerine sahip substratlar imal edilmesi için istenen akrilamid / bisakrilamid yüzdesi (ağırlık / hacim) oranı Ç Wen ve diğ için% bisakrilamid) ya da 30 kPa (% 8 akrilamid,% 0.55 bisakrilamid) ve benzeri gözenekli. 41. 0.2 mikron şırınga ile Vortex berrak gelene kadar çözüm ve filtre. Ön-polimer çözeltileri 3 ay için 4 ° C'de saklanabilir.
      DİKKAT: akrilamid veya bisakrilamid maruz kalma Neurot, akut toksisite neden olabiliroxicity ve tahriş. Koruyucu eldiven, giysi ve koruyucu gözlük takın.
    2. Metanol / Irgacure h 2959 W% 20 bir foto-tetikleyici çözelti hazırlayın. Bu foto-başlatıcı çözeltisi depolanamaz ve taze her hazırlanmalıdır.
    3. 1 (pre-polimer: foto-başlatıcı) oranında 9 ön-polimer ve bir ışık başlatan çözüm karıştırın. 15 dk kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum odası ile isteğe bağlı olarak gazını.
    4. Cam kurutma tepsisine silanize slaytlar yerleştirin, 9, 100 uL pipetleyin: 1 ön-polimer: Her bir slayt üzerine foto-başlatıcı çözeltisi. baloncuklar oluşturulmasını kaçınarak nazikçe bir 22 × 60 mm lamel ile her slayt kapsamaktadır. lamel oksijen polimerizasyon reaksiyonunun engellemesini önler unutmayın.
    5. Yeri kurutma UV çapraz bağlayıcı tepsi ve 10 dakika (4 W / m 2) için 365 nm UV A slaytlar maruz bırakmaktadır. gerektiği gibi polimerizasyon süresini optimize. Uzun nedeniyle overpolymerization için lamel çıkarmadan risk zorluk maruz kalmaktadır. Kısa pozlama risk underpolymerization ve düşük hidrojel kararlılığı.
    6. 5 dakika boyunca dH 2 O hidrojeller daldırın. polimerize hidrojeller zarar vermemeye özen bir ustura ile lamelleri çıkarın.
    7. DH 2 O gün değişen, 3 d - 1 oda sıcaklığında dH 2 O hidrojeller bırakın. En fazla 3 ay boyunca oda sıcaklığında - (30 dakika 15) ve mağaza kuruyana kadar sıcak bir plaka üzerinde 50 ° C'de hidrojeller kurutmak.
  4. 2. Seçenek: TFM kullanılarak hücre-substrat etkileşimleri canlı değerlendirilmesi için Silanlanmış 35 mm cam alt Petri kapları üzerinde floresan boncuk içeren poliakrilamid hidrojeller Üretiyor.
    1. 15 dakika topaklan dağıtmak için 1 uM floresan boncuk bir stok solüsyonu sonikasyon.
    2. DH bir pre-polimer solüsyonu hazırlayın 2 4 kPa (% 4 akrilamit,% 0.4 bisakrilamid), 13 kPa (% 6 akrilamid, 0 Young modüllerine sahip substratlar imal edilmesi için istenen akrilamid / bisakrilamid yüzdesi (ağırlık / hacim) oranı ÇWen ve diğ ortalama .45% bisakrilamid) ya da 30 kPa (% 8 akrilamid,% 0.55 bisakrilamid) ve benzeri gözenekli. 41. 0.2 mikron şırınga ile Vortex berrak gelene kadar çözüm ve filtre. Ön-polimer çözeltileri 3 ay için 4 ° C'de saklanabilir.
      DİKKAT: akrilamid veya bisakrilamid maruz kalma akut toksisite, nörotoksisite ve tahrişe neden olabilir. Koruyucu eldiven, giysi ve koruyucu gözlük takın.
    3. % 0.2 v / v'dir ve karıştırmak için girdap nihai konsantrasyonda ön polimer çözeltisine flüoresan boncuklar ekleyin.
    4. Metanol / Irgacure h 2959 W% 20 bir foto-tetikleyici çözelti hazırlayın. Bu foto-başlatıcı çözeltisi depolanamaz ve taze her hazırlanmalıdır.
    5. 1 (pre-polimer / boncuk: foto-başlatıcı) oranı 9 ön polimer / boncuk ve foto başlatıcılar çözüm karıştırın. 15 dk kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum odası ile isteğe bağlı olarak gazını.
    6. Bir cam kurutma tepsi ve p içine Silanlanmış 35 mm cam alt Petri kapları yerleştirin9 Ipet 20 uL: 1 ön-polimer / boncuk: her yemeğin merkezi üzerine foto-başlatıcı çözeltisi. baloncuklar oluşturulmasını kaçınarak nazikçe bir 12 mm'lik dairesel bir örtücü her slayt kapsamaktadır. lamel oksijen polimerizasyon reaksiyonunun engellemesini önler unutmayın.
    7. Hidrojelin yüzey flüoresan boncuklar dağıtmak için, yemekler ters çevirin ve Knoll ve ark başına 20 dakika için oda sıcaklığında bırakın. 42.
    8. Hala ters birlikte, 10 dakika boyunca (4 W / m2) 365 nm UV A yemekler maruz kalmaktadır. gerektiği gibi polimerizasyon süresini optimize. Uzun nedeniyle overpolymerization için lamel çıkarmadan risk zorluk maruz kalmaktadır. Kısa poz risk underpolymerization ve düşük hidrojel kararlılığı.
    9. 0.1 M 4- (2-hidroksietil) hidrojeller daldırın -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponu ve karanlık gece boyunca oda sıcaklığında bekletin. özen, bir ustura ile dikkatlice lamelleri kaldırmak polimer zarar vermemeyerized hidrojeller.
    10. (- 30 dakika 15) kadar kuru sıcak bir plaka üzerinde 50 ° C'de hidrojeller kurutmak. Hidrojeller 3 ay boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında saklanabilir.

Diziler 2. Fabrikasyon

  1. biyomoleküllerin yazdırmak için tamponlar hazırlayın. ilgi biyomoleküllerin uygun baskı tampon kullanın. Büyüme faktörü (GF) baskı tamponu, hücre-hücre ligandları olarak moleküllerin diğer sınıfları için genel olarak uygundur.
    1. Sodyum asetat, 164 mg, 6 ml DH 2 O Vortex etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 37.2 mg ekleyin ve iyice çözündürülmesi için 37 ° C'de inkübe, 2 x ECM proteininde baskı tamponu hazırlamak. Çözündürme işleminden sonra, önceden ısıtılmış, Triton X-100'ün 50 ul ve gliserol 4 ml. Vorteks ve çözündürülmesi için daha 37 ° C'de inkübe edin. 4.8 pH ayarlamak için titre, buzlu asetik asit, 80 uL - 40 ekleyin. 2 x ECM proteininde baskı Tampon 4 saklanabilir1 ay boyunca ° C.
      DİKKAT: Asetik asit yanıcı ve tahriş edicidir. Koruyucu eldiven, giysi ve koruyucu gözlük takın.
    2. , 2 x GF baskı tamponu hazırlamak 6 ml fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile 105.5 mg sodyum asetat ve 37.2 mg EDTA ekleyin. Vorteks ve iyice çözündürülmesi için 37 ° C'de inkübe edin. gliserol [(3-kolamidopropil) -dimetilamonyo] -1-propansülfonat (CHAPS) ve 4 mL - Çözündürme işleminden sonra, 100 mg 3 ekleyin. 2 x GF proteini baskı tamponu 1 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  2. Kaynak tabak hazırlayın.
    1. 384-oyuklu V tabanlı bir mikrolevhadaki çift hedef konsantrasyonda her bir biyomolekülün çözeltisi ile 2 x baskı tamponu eşit hacimlerde bir araya getirir.
      Not: dizilmiş faktörlerinin diğer türleri için, hedef konsantrasyonu, hidrojel, biyolojik işlevde tutma bağlı olarak değişmekle birlikte en çok ECM proteinleri için uygun bir hedef konsantrasyonu, 250 ug / mL'dir. Her oyuktaki toplam hacim olabilirgibi, 5 uL kadar düşük ve gereken en fazla 15 uL olacak. ilgi biyomolekülün kombinasyonları ilave olarak, alt-görüntü analizi kolaylaştırmak üzere bir dizilen fluoresan işaretleyici içerir. rodamin kaplı dekstran (2.5 mg / ml) kullanın.
    2. kabarcıklar oluşturmak için özen, pipet ile iyice iyice her karıştırın. 100 x g 'de, 1 dakika için kaynak mikroplak santrifüjleyin. Kaynak plakaları aynı günde hazırlanmış ve mikrodizi üretimi kadar 4 ° C'de saklandı Mikrodizilerin kullanıldığı imal.
  3. Her mikroarray fabrikasyon çalıştırmadan önce üreticinin talimatlarına göre temizleyin pimleri. doğrudan mikro dizicinin baskı kafasının içine temiz işaretçilerine yükleyin.
  4. üreticinin yazılımını kullanarak mikro-dizici ve programı hazırlayın. Aşağıdaki adımlar, burada kullanılan özel mikro dizicinin kısmen özel olmakla birlikte, en microarrayers çalışması benzerdir.
    1. , Nemlendirici ünitesi açmak (% 65 RH olmayan ayar noktasını ayarlamakReometre ayar noktasını maçları kadar -condensing), ve bekleyin. Uygun adaptör kaynak plaka koyun.
    2. 15 dakika boyunca 50 ° C 'de hidrojel tabakaları kurutmak ve uygun adaptör içine koyun. mikro-dizici mikroskop lamı ve mikroplitelerin hem de adaptörleri vardır. 35 mm cam alt Petri kapları arraying için, 6-çukurlu mikro içine yemekler yüklemek ve arrayer üzerinde mikroplaka adaptörü içine mikroplağı yerleştirin.
    3. Doğru (35 mm Petri kapları içeren, örneğin mikroskop lamı veya mikrolevha'sının) kaynak plakası, dizi tasarım ve istenen biçim düzenini yansıtmak için programın parametrelerini ayarlayın. taşıma-over ve çapraz kontaminasyonu önlemek için, her bir durum arasında hem su hem de dimetil sülfoksit (DMSO) kullanılarak yıkama adımlarını içerir.
    4. nem% 65 RH (yoğuşmasız) altına düşmediği kez bir saatten daha ve iğneler tıkalı olup olmadığını az sıklıkla kontrol dizi imalat başlayın. Humi Eğerdity nemlendirici doldurup yoğunlaşma ilişkili tüpleri temizlemek için arraying duraklatmak, beklenmedik bir şekilde düştü. pimleri tıkalı olup olmadığını, iğnelerini temizlemek veya başka önceden temizlenmiş pimleri ile değiştirmek arraying duraklatmak. Yeterli kuruma süresi sağlanan aynı yüzeylerde (yani, 4 saat gecede) üzerine biyomoleküllerin sırayla dizi çok tip mümkün olduğunu unutmayın.
    5. Program tamamlandığında, bir gecede alüminyum oda sıcaklığında folyo ve% 65 RH (yoğuşmasız) ile kaplı bir slayt kutusu veya mikrolevha'sının imal dizileri yerleştirin. genel protein lekeleri veya immünofloresan kullanarak dizi kalite ve tutma değerlendirmek için gerekli olabileceğini unutmayın; Brafman et al. Daha fazla bilgi 25.

3. Hücre Kültürü ve Analiz Okuma

  1. imalat gün sonra, 4-odacıklı yemekler (mikroskop slayt) veya 6 oyuklu mikroplakalar (Petri kutularında) dizilmiş substratları yer ve% 1 sokmakPBS içinde hac / hac penisilin / streptomisin; slaytlar için 4 ml ve yemekler için 3 ml kullanın. 30 dakika boyunca UV C Açığa. Değişim penisilin / hücre kültür ortamı için streptomisin çözüm.
  2. Toplayın ve hücreleri saymak. 500 x 10 3 de diziler üzerine tohum - mikroskop lamı başına 4 mL, 35 mm Petri çanağı başına 3 ml, 2 x 10 6 hücre / dizisi. 24 saat veya iyi nüfuslu hücre adaları oluşumuna kadar - 2 CO 2 37 ° C'de dizi kültürleri inkübe ve% 5. tohum yoğunluğu ve hücre ve belirli bir uygulama için gereken zaman, her iki ayarlayın. (Yani, düşük yoğunluğa veya ekim zamanı) Underseeding kötü dizi nüfus ve çarpık biyolojik sonuçlara neden olabilir. (Yani, yüksek yoğunluklu veya ekim zamanı) overseeding azaltılmış dizi bütünlüğü nedeniyle ada dekolmanı meydana gelebilir.
  3. Önceden ısıtılmış hücre kültür ortamı ile iki kez dizi kültürleri yıkama hücre adaların oluşması için bırakıldıktan sonra, Yine slaytlar ve yemekler için 3 ml için 4 ml kullanın. seçeneğiniziâlly uygun kontrol ve tedavi biyolojik sisteme ilgi (örneğin, küçük molekül inhibitörleri, büyüme faktörleri, vb) ekleyin. Herhangi bir tedavi konsantrasyonunu sağlamak için 2 d - diziler her 1 medyayı değiştirin. Dizi kültürleri başlatılması 5 d - - 1 içinde TFM tarafından immünofloresan ya da hücre-substrat etkileşimleri hücre işaretleyici ifade ve hücre fonksiyonunu değerlendirmek Seçenek 1 ve aşağıdaki Seçenek 2 bakınız.
  4. 1. Seçenek: Son nokta immünofloresan gerçekleştirin. Bazı proteinlerin immünofloresan metanol, etanol veya HCI kullanılarak daha sıkı geçirgenliği gerektirebilir. Nedeniyle diziler potansiyel hasar, değerlendirmek ve büyük ölçekli deneylerde kullanılmadan önce her permeabilization protokolü optimize.
    1. Aspire hücre kültürü 4 odacıklı yemekler dizi slaytlar medya ve taze hazırlanmış% 4 v 4 mL / slayt eklemek / v paraformaldehid PBS (PFA). Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
      DİKKAT: ExposPFA için ure akut toksisite neden olabilir ve aynı zamanda tahriş veya temas cildi zarar edebilirsiniz. Koruyucu eldiven, giysi ve koruyucu gözlük kullanınız ve kimyasal davlumbaz sadece kullanın.
    2. Aspire PFA çözümü ve PBS 4 mL her slayt 3 kez yıkayın. Bu noktada, sabit slaytlar 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Bu dizi bütünlüğünü sağlamak amacıyla immunolabeling ve sabitlenmesi ile aynı günde monte boyunca devam etmesi, bununla birlikte, tavsiye edilir.
    3. PBS aspire edildi ve PBS içinde Triton X-100 hac% 0.25 V 4 mL / slayt / ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Aspire Triton X-100 çözümü ve PBS 4 mL her slayt 3 kez yıkayın. İkinci antikorun türe eşleşen% 5 h / h serum 4 mL / slayt ekleme (örneğin, eşek eşek sekonder antikor serum) PBS içinde 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    5. İyice her slayt engelleme çözüm kaldırmak. PBS içinde% 5 h / h serumu içinde seyreltilmiş birincil antikor 500 uL / ​​slayt ekleme. Bu hacim, 4 ° C'de, oda sıcaklığında iki 1 saat inkubasyon diziler ve gece boyunca inkubasyon karşılamak için yeterlidir.
    6. PBS 4 mL her dizi sürgünün 3 kez yıkayın. İyice son yıkama çıkarın ve PBS içinde% 5 h / h serumu içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikor, 500 uL / ​​slayt ekleyin.
    7. PBS 4 mL her dizi sürgünün 3 kez yıkayın. Dikkatle çözüm kullanarak forseps gelen dizi slaytlar çıkarmadan önce dH 2 O ile kısaca yıkayın. O. fitil veya kuru kalıntı dH 2 laboratuar doku kullanın
    8. görsel tüm dizinin tam kapsama teyit ederken slayt karşısında DAPI ile montaj çözümü pipetleyin 100 ul.
    9. mount slayt üzerinde bir 22 × 60 mm lamel yerleştirin. şeffaf tırnak cilası ile lamel kenarları mühür. erken bir sonraki gün daha görüntüleme kadar 4 ° C de karanlıkta muhafaza edilmelidir.
    10. Bir mikrodizi tarayıcı veya ters floresan mikroskop equipp kullanarak görüntü tüm dizilerbir robot sahne ile ed. Mikroarray tarayıcılar daha hızlı okuma sağlar ancak Cy3- veya Cy5 uyumlu fluorophores isteyebilir ve tek hücre için sık sık sınırlı çözünürlük (yani, 1 - 10 mikron). Floresan mikroskop floresan çeşitli kanallar kullanmak için bu seçeneği ve daha yüksek çözünürlük (<1 mikron, ~ 100 × toplam büyütme) sağlar, ancak robotik sahne ve büyütme / objektif kalitesine bağlı olarak daha yavaş okuma sağlar.
    11. Kaydet (örneğin, JPG) diğer dosya biçimleri ile ilişkili veri sıkıştırma veya kaybını önlemek için TIFF dosyaları olarak yöntemiyle ya kadar tüm dizilerin görüntülerini ele geçirdi.
  5. 2. Seçenek: TFM kullanılarak hücre-substrat etkileşimleri canlı değerlendirmesini yapın.
    1. TFM esnasında alt-tabakalardan hücreleri ayırmak% 1 h / h bovin serum albumin (BSA) ve% 1 v / PBS v sodyum dodesil sülfat (SDS) ihtiva eden bir çözelti hazırlayın.
    2. için dizi kültürleri içeren 35 mm Petri kapları taşımakBir inkübe (37 ° C,% 5 CO 2), TFM ölçümleri için bir robot sahne ile ters floresan mikroskop.
      1. bir tabak, uçaklar pozisyonları (X koordinatı Y koordinatı) işaretlemek ve odak faz kontrast mikroskobu kullanılarak bireysel hücre adaları (Z-koordinatı).
      2. boncuk görselleştirmek için çok kırmızı floresan mikroskopi geçin. Önceki adımda kaydettiğiniz pozisyonların her dönün ve hücre adanın altında boncuk sadece ilk katman odakta böylece odak düzlemi Z koordinatı düzeltin. Yeni koordinatları kaydetmek ve ön ayrışma faz kontrast ve uzak kırmızı floresan görüntü yakalamak için tüm cep adaların otomatik görüntüleme geçin.
    3. Dikkatle çanak BSA / SDS çözeltisi 150 ul ekleyin ve alt-tabaka arasında tam hücre ayrılması için izin vermek için 5 dakika bekleyin; Faz kontrast mikroskopi kullanılarak hücre ayrışmasını izlemek.
    4. Hücre adaları alt-tabaka ayrışmış sonra, t gerio pozisyonları işaretlenir ve boncuk birinci katman odak hala emin olun. Bu boncuklar out-of-düzlemi nedeniyle hücre oluşturulan traksiyon tarafından uyarılan deformasyona iseniz, o zaman bunların odak içinde tekrar böylece odak düzlemi Z koordinatı düzeltin. düzeltilmiş Z koordinatları kaydetmek ve post-ayrışma çok kırmızı floresan görüntü yakalamak için tüm adaların otomatik görüntüleme tekrarlayın.
    5. Kalan yemekler için 3.5.4 - Tekrar 3.5.1 adımları.

Verilerin 4. Analizi

  1. immünofloresan verilerinin analizi.
    1. Süreç dizisi görüntüleri satın aldı. (Yani, kırmızı, mavi veya yeşil) ayrı ayrı kanallar içeren dosyaları içine kompozit dizi görüntüleri bölünmüş ve 8-bit TIFF görüntüleri 43, 44 dönüştürmek. Binning uygulayın (örneğin, 2 × 2 veya 4 × 4) ~ kanal başına 32 megapiksel enti aşağısında tek hücreli analizi sırasında bellek gereksinimlerini azaltmak için görüntü boyutunu azaltmak içinDizi görüntüleri yeniden. Bu dizi işlem adımları bir ImageJ makro uygulanması için "array_processing.ijm" başlıklı Yan Kod Dosyası bakın.
    2. sol üst, sol alt ve sağ alt rodamin-konjuge dekstran belirteçleri veya dizilmiş koşulları piksel koordinatlarını unutmayın. 8-bit TIFF görüntülerini döndürmek için bu koordinatları kullanın mükemmel dikey olmak ve daha sonra, belirli dizilmiş koşullara sahip tek hücre analizi çıktı açıklama. Dönen ve adımları gridding bu dizinin uygulamaları için ek kod Dosyalar başlıklı "rb_array_rotater.ijm", "rg_array_rotater.ijm", "rgb_array_rotater.ijm" ve "array_gridding.ijm" bölümüne bakın.
    3. IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecondaryObjects ve MeasureObjectIntensity: binned tek hücreli analizi yapın, aşağıdaki modülleri kullanarak CellProfiler içinde (versiyon 2.1.1) 45 8-bit TIFF görüntülerini döndürülmüş. IdentifyPrimaryObjects, IdentifySecond çekirdek tanımlararyObjects her bir hücre çekirdeği ile bağlantılı immunolabels tanımlar ve MeasureObjectIntensity çekirdek etiketler ve immunolabels hem quantifications içerir.
      1. ExportToSpreadsheet modülü kullanılarak kanal tarafından bir CSV dosyası olarak her üç modülden çıkışı tek hücreli verileri daha sonra aşağı analizi kolaylaştırmak için. Kırmızı, yeşil veya mavi kanallar içeren görüntü setleri için bu adımları uygulamak CellProfiler boru hatları için ek kod Dosyalar başlıklı "b_array_image_analysis.cppipe", "gb_array_image_analysis.cppipe", "rb_array_image_analysis.cppipe" ve "rgb_array_image_analysis.cppipe" bölümüne bakın.
    4. Deneysel değişkenliği ve Gauss olmayan tek hücreli dağılımlar için hesap verileri dönüştürmek için, biyolojik tekrarında 46 kantil normalleşme uygulayın. Bu süreç çoğaltır arasında paylaşılan bir dağıtım üretir ve immunolabel yoğunluğundaki değişiklikleri tarafsız karşılaştırmalar sağlar. Bundan başka, UNLike Z-puanlama ve diğer parametrik yöntemler, kantil normalleşme parametrik olmayan ve daha fazla temsilci için izin veri belirli bir dağılım kabul etmez dizilmiş durumunun bir fonksiyonu olarak tek hücreli davranışı analiz eder.
    5. veri arsa ve yorumlamak. biyolojik sisteme ve hipoteze göre hesaplamak ve her dizilmiş bir durum için şu grup önlemlerden bir ya da daha fazla çizmek:
      1. Hesaplayın ve deney boyunca yapışma ve hayatta kalma kombine ölçüsü olarak adanın başına hücreleri arsa.
      2. Hesaplayın ve hücre kader veya fonksiyon bir önlem olarak quantile-normalize immunolabel yoğunluğunu arsa.
      3. Hesaplamak ve genellikle 2 SD negatif kontrolün ortalama yoğunluğu üzerinde tutarlı bir eşiğin üzerinde yoğunluk ile saptandığı haliyle, bir immunolabel pozitif hücrelerin yüzdesi çizilir.
      4. Alternatif olarak, sırayla immunolabel yoğunluk arsa dağıtımları incelemek ve tek hücre davranışını kategorizedizilmiş durumunun bir fonksiyonu olarak göstermektedir. Bu dağılımlar ayrıca merkezi eğilim (ortalama, medyan, mod) ve varyasyon (varyans, değişim katsayısı, Fano faktörü) ve Kolmogorov-Smirnov testi gibi hipotez test yöntemlerinin önlemler kullanılarak karakterize edilebilir.
  2. TFM verilerin analizi. İşte Butler ve ark tarafından daha önce geliştirilen algoritma içeren bir yaklaşım tarif edilmektedir. ve Wang ve diğ. 40, 47.
    1. toplu ImageJ kullanın 8 bit TIFF dosyaları görüntüleri dönüştürmek. Piksel ortalama binning uygulayın (örneğin, 2 × 2) aşağı analiz hesaplama maliyetini ve süresini azaltmak için. TFM için algoritmalar büyük ölçüde tek bir hücre analizi, tek bir hücrenin hücre alt-tabaka arabirimine göre adalar (~ 17.5 x 10 3 um 2) büyük hücre alt-tabaka ara yüzü (75 um 2) necessi üzerinde odaklanmıştırtates binning adım.
    2. Girdi yakalanan faz kontrast ve MATLAB ve süreç Butler ve ark daha önce geliştirilen algoritmaların kullanılması gibi bilimsel bir programlama ortamına kadar kırmızı floresan görüntüler (hem ön ayrışma ve sonrası ayrılma). ve Wang ve diğ. 40, 47.
      1. Hücre adanın uzak üç bölge seçin. Bu bölgeler, bir görüntü ya da örnek kayması nedeniyle yer değiştirmeler için hesap etmek için kullanılır.
      2. Mikrometre (örneğin, 0.454 piksel / mikron) piksel arasında dönüştürmek için faktörünü sağlamak, alt tabakanın Young modülü (örneğin, 13 kPa) ve Poisson oranı (örneğin, burada açıklanan poliakrilamid jeller için 0,48).
      3. Her ada için, geometrik kısıtlamaları tanımlamak için çevresine bir sınır çizmek; Bu sınırın dışındaki tüm güçler Sıfırlı. Bu kısıtlı sistem büyük dista verilen makulnce adalar arasında (yani, 450 mikron).
    3. Her ada için kök ortalama kare çekme stresi ve kasılma anı hesaplayın. Kasılma anı hücre ada boyunca artık gerilme bir ölçüsüdür ve hücre-hücre etkileşimleri 48 gücünü yansıtacak şekilde gösterilmiştir. Her dizilmiş durumda, birden çok adalar ve biyolojik çoğaltır ve hesapla boyunca ortalama kök ortalama kare değerlerinin hipotez testi için varyansı ilişkili. Adanın merkezinden bir geometri işlevi, örneğin, mesafe olarak hem tedbir temsili harita sağlamak için birçok adalar üzerinde stresleri ya da anları dağılımını ortalama etmek de mümkündür.

Sonuçlar

Bu platformu kullanarak, karaciğer atalarıdır 34, 35 kaderi şartnamede hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının rolünü araştırdık. Protein A / G-konjuge Çentik ligandlan poliakrilamid hidrojel (Şekil 3A), geliştirilmiş saklama ve kümelenme gösterdi ve safra kanalı, hücre kaderine (Şekil 3B) doğru karaciğer progenitörlerin farklılaşmasını sürüş Ayrıca sahip idi. Tek hücreli bir analiz kullanarak, liganda karaciğer progenitörlerinin tepkisi de bağlıdır bulgu, ECM proteinleri kolajen I, kolajen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin (Şekil 3C) çentik ligandlarına yanıt sayısal ECM bağlam. Son olarak, ligandlar DLL1 ve Jag1 olmadan karaciğer atalarıdır oluşturmak için ShRNA demonte kullanılmaktadır. dizilmiş Notch bağına yanıt pr bağlı olarak değişiklikHer iki ligandın özünü, hücre dışsal liganda yanıt hücre iç ligand ifade (Şekil 3D) bir fonksiyonu da doğrular. Dahası, çift pozitif bir tat alt popülasyonunu gözlenmiştir (ALB + / OPN +) DLL1 demonte (Şekil 3D) hücreler. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) tek tek ligandların devirme ile birden dizilmiş ECM proteinleri ve Çentik ligand eşleştirme ile gösterildiği üzere bir dizi formatı kombinasyon yetenekleri; (2) sadece bir işlevi ECM proteinlerini dizilmiş değil, aynı zamanda protein A / G-aracılı birleştirme aracılığı ile hücre-hücre ligand dizilmiş; ve (3) bizim tek hücreli analizi ve benzersiz alt popülasyonlar ayırt etme yeteneği uygulanması.

Ayrıca karaciğer progenitörlerinin farklılaşma alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimi (Şekil 4a, her iki bağımlı olduğu görülmektedir fibronektin sadece sert yüzeylerde (Şekil 4B) üzerinde farklılaşma desteklerken ong>), özellikle kolajen IV bulma hem yumuşak ve sert yüzeylerde farklılaşma destekleyicidir. TFM ölçümlerinin Temsilcisi ısı haritaları kollajen IV düşük substrat sertliği de sürekli çekiş stres safra yolu hücreleri (Şekil 4C), ortalama kök ortalama kare değerleri (Şekil 4D) tarafından teyit bir bulgu haline farklılaşmayı teşvik önerdi. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) bir ayarlanabilir sertlik yüzeylerde hücre mikroarreyleri ile TFM başarılı entegrasyon hücre fenotipi ve çekiş stres hem değerlendirmek için; (2) matris bileşimi ve alt tabaka sertlik hem karaciğer progenitör hücre kaderinin koordinasyonu; ve (3) hücre mikrodizilerinde bizim TFM analizi ve tipik bir gerilim profillerini uygulanması.

e 1 "src =" / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg "/>
Şekil 1: İlk Üç Deneysel Bölümler gösteriliyor Özet şematik. Bölüm 1, cam yüzeylerde temizlenmeli ve poliakrilamid hidrojeller fabrikasyon kolaylaştırmak için Silanlanmış edilir. Bölüm 2'de, ilgi konusu biyomolekülün kombinasyonları 384 kaynağı mikro-hazırlanır. Bir robot arrayer sonra hidrojeller üzerinde diziler imalatı, temiz pimleri, kaynak mikroplaka ve poliakrilamid hidrojeller ile yüklenir ve başlatılır. Bölüm 3, hücreler dizilmiş alan üzerine ekilip ilgi kültür protokolü uygulandı, bundan sonra, uygun izin verilir. uç noktada, hücreler ya TFM kullanarak immünsitokimya / Immünofloresan için sabit veya analiz edilir. Ölçek çubukları 75 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

= "1"> sayfa içinde figure-results-3783
Şekil 2: İşleme ve Diziler gelen İmmünofloresan Verilerin Analizi. (A) Karo, kompozit 32 bit RGB görüntüleri ilk binned ve daha sonra tek tek 8-bitlik kanallara ayrılır. dizilmiş floresan belirteçler ve hücre adaların bir arada kullanarak, dizinin üç köşesi otomatik yönlendirme ve dizilerin gridding sağlamak için belirlenmiştir. (B) tek-hücreli veri giriş dizilerinin her kanal için oluşturulur. Deneysel sürüklenme hesaba amacıyla, kantil normalleştirme tüm çoğaltır genelinde tek bir paylaşılan dağıtım üreten, biyolojik tekrarında uygulanır. Quantile normalize veri sonradan ya da tek hücreli dağılımlarının doğrudan analizi (bir etiket için pozitif yüzde hücre yoğunluğu ortalama örneğin, hücre / ada) çizilen ve topluluk ölçümlerinin hesaplanması yoluyla yorumlanır.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4899
Şekil 3: Notch Ligand Sunum Aracılık Karaciğer Progenitör Farklılaşma. (A) Fc-rekombinant Çentik ligandları Jagged-1 (JAG1) ve Delta gibi 1 (DLL1) Protein A / G ile dizilmiş gelişmiş tutma ve kümelenme sergiledi. Ölçek çubuğu 50 mm. (B) Karaciğer ataları Notch ligand ile ibrazı üzerine safra yolu hücrelerine diferansiye. 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer bir etiket, albümin (ALB) bir karaciğer hücre belirteci olduğu ve osteopontin (APN) olan bir safra kanalı, hücre belirtecidir. Ölçek çubuğu 150 mm. (C) ECM proteinleri üzerinde çentik ligandlar JAG1, DLL1 ve Delta gibi 4 (DLL4) için APN için pozitif hücrelerin yüzdesi miktarının belirlenmesi I kollajenin, collagen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin. Student t-test P <0.05 (*) için belirtilen P-değerleri, her ECM proteininde içinde her dizilmiş Çentik ligand için kontrol IgG karşı yapıldı. Notch ligandları JAG1, DLL1 ve DLL4 mevcuttur kollajen III hücreler için ALB ve APN (D) Görüntüleme sitometri. Çentiksiz karaciğer progenitörler DLL1 ve Jag1 (yani, shDll1 ve shJag1) shRNA demonte kullanılarak elde edilmiştir ligandları. Ortalama ± sem Bu rakam Kaylan'ın ark tadil edilmiş olduğu (C) 'de veriler sunmuşlardır. 34. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-6583
Şekil 4: The Matrix Kompozisyon ve Yüzey Sertlik CooKaraciğer Progenitör Farklılaşma rdinate. Kanal hücreleri safra (A) Karaciğer progenitör farklılaşma ECM kompozisyon ve alt tabaka sertlik hem bağlıdır. DAPI ALB bir karaciğer hücre işaretleyici ve APN bir safra kanalı, hücre işaretleyici, nükleer bir etikettir. (B) Young modülü alt tabakalar 30 kPa, 13 kPa, kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve iki yönlü kombinasyonları ile ilgili APN için pozitif hücrelerin yüzdesi kantifikasyonu bu ECM proteinleri. (C) Celi bir gerilim alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimin hem bağlıdır. (D) Young modülü alt tabakalar 30 kPa ve kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve bu her iki yollu kombinasyonları, çekiş stres kök-ortalama-kare değerlerinin miktarının belirlenmesi ECM proteinleri. (B) ve (D) 'de, veriler SEM ve Student t-test, ortalama ± olarak sunulduP <0.05 (*) p <0.01 (**) için belirtilen P-değerleri, her ECM kombinasyonu için 30 kPa karşı gerçekleştirilen edildi ve p <0.001 (***). Ölçek çubukları 50 mikron. Bu rakam Kourouklis ark modifiye edilmiştir. 35. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bölüm Sorun potansiyel Nedenler Çözüm
Poliakrilamid Yüzey 1. Fabrikasyon. Coverglass hidrojelden kaldırılamaz. Overpolymerization. <10 dakika (4 W / m 2) polimerizasyon süresini azaltın. UV crossli kontrolnker çıkış beklenen aralığı içindedir.
Kötü poliakrilamid hidrojel polimerizasyon. Underpolymerization. Polimerizasyon süresi> 10 dakika (4 W / m 2) artırmak. UV çapraz bağlayıcı çıkışı beklenen aralıkta olup olmadığını kontrol edin.
Poliakrilamid hidrojellerin coverglass çıkarıldıktan sonra zarar görmektedir. Yumuşak poliakrilamid hidrojeller zarar kolaydır. Biz özellikle (yani, 4 kPa) hidrojeller yumuşak hidrojel üretim verimi (~% 50) azalan gözlemlemek. nazikçe hidrojeller Kulp ve istenilen verimi elde etmek için başlangıç ​​sayısını artırmak.
Diziler 2. Fabrikasyon. Kötü veya tutarsız nokta morfolojisi. Tutarsız nemlendirici fonksiyonu. Bu nemlendirici kontrol edin ve her yazdırma çalışması boyunca işlevsel reometre ve% 65 RH korumak.
baskı kafası veya takunya sıkışmış pimleriged. ücretsiz pim hareketine izin vermek için yazıcı kafasını temizleyin. iyice önce veya her baskı çalışmasından sonra temiz iğneler pim kanallarından agrega kaldırmak için.
3. Hücre Kültürü ve Tahlili Yürütme. İlk eki sonra diziler Hücre dekolmanı ya da ölüm. Overseeding ve aşırı çoğalması. İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini azaltın. hücre çoğalmasını azaltmak için dizi kültürü sırasında "bakım" veya "farklılaşma" ortamını kullanın.
hidrojel toksik akrilamid Yayın. Akrilamid difüzyon / tahliyesine imkan vermek ve hücre toksisitesini azaltmak için en az 3 gün boyunca dH 2 O hidrojeller bekletin.
Hücreler diziler eklemek gerekmez. Underseeding. İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini artırın. Bir daha güçlü yapışık hücre türünü kullanın.
Zayıf birikimimatris veya Biyomoleküllerin durum. Parçacıkların ve agrega temiz iğne, baskı parametrelerini onaylamak ve floresan belirteçler, örneğin, rodamin-konjuge dekstran lekelenme değerlendirir.
hücre-matris etkileşimlerinin spesifikliği. Farklı hücre tipleri, bazı ancak diğer ECM proteinleri spesifik olarak yapışır. senin hücreleri ile birden fazla farklı ECM proteinleri test edin.
imalattan sonra suboptimal dizi depolama. Biz dondurma sırasında faz değişiklikleri önlemek için kısmen,% 65 RH ve oda sıcaklığında gece boyunca fabrikasyon dizileri saklamak öneririz. Hücre yapışması, her iki nem, sıcaklık ve depolama süresi karşı duyarlıdır; Bu parametreler deneyler için optimize / tutarlı olduğundan emin olun.
Hücre kültürü sırasında cam alt tabakadan hidrojel dekolmanı. Kötü slayt temizleme ve silanizasyon. slayt temizliği için çalışan çözümler değiştirin vesilanizasyon.
Overdehydrated hidrojel. daha uzun 15-30 dakika süreyle sıcak bir plaka üzerinde kurutucu hidrojeller bırakmayın.
Verilerin 4. analizi. tekrarlanan noktalar ve slaytlar arasında yüksek değişkenlik. Dizi üretiminde değişkenliği. pim ve yazıcı kafası temiz olup olmadığını kontrol edin. nemlendirici işlevi onaylayın. Görselleştirmek ve floresan işaretlerini kullanarak spot ve dizi kalitesini ölçmek. olarak saklayın dizileri yukarıda önerilir.

Tablo 1: Sorun Giderme.

Tartışmalar

Deneylerde, biz en yaygın hataları uydurma dizilerin kalitesi ile ilgili ve kötü ilgi biyolojik sistem yanıtı karakterize bulduk. Biz cep mikroarray deneylerde yaygın arıza modları ve ilişkili sorun giderme adımları için Tablo 1'de okuyucu bakın. Özellikle dizilerin kalitesiyle ilgili, biz aşağıdaki öneriyoruz. Böyle rodamin-konjuge dekstran gibi floresan etiketli molekülleri kullanarak programları parametreler ve tamponlar arraying teknik kalite ve sağlamlığı onaylayın. önce ya da daha fazla görsel üreticinin talimatlarına göre arraying ve sonra ya tamamen temiz pimleri pim kanalları ışık mikroskobu kullanılarak enkaz açık olup olmadığını kontrol edin. genel protein lekeleri veya immün kullanarak dizilmiş biyomolekül tutma onaylayın. 70 kDa altında bir moleküler ağırlığa sahip biyomoleküller sık hidrojel 23 korunmaz unutmayın sup> 31. Birden fazla hücre tiplerini kullanarak dizilmiş biyomolekül hücre işlevselliğini doğrulamak. Sadece yapışık hücreler diziler ile uyumlu olduğunu unutmayın; Buna ek olarak, diziler kaynaşmasının hücreye özel özellikleri (örneğin, integrin ifade profili) ve seçilen ECM proteinleri bağlıdır.

Sınırlı yer nedeniyle, burada dizi tasarım, düzen ve imalat geniş bir tedavi verilmez ve daha önceki 23 çalışır için, 25 okuyucu bakın. Biz genel olarak 10-20 benzersiz biyomolekül koşulları (yani, 5-10 noktalar / durumu) oluşan 100 nokta Altdizilim (150 mikron nokta çapı 450 mikron merkez-merkez mesafesi) kullanın. bir dizide altdizilimlerden sayısı rahatça biri 25 × 75 mm mikroskop lamı üzerine 1,280 kadar ölçeklendirilebilir ilgi biyomolekül koşulları sayısına bağlı olarak değişir (~ 64 altdizilimlerden içinde 6.400 noktalar)xref "> 25, 31 parametre üzerinde daha fazla ilgi desen boyutuna bağlı olarak değişir;. 75 desen üretme kapasitesine sahip pimleri - 450 mikron kolayca kullanılabilir.

Dizi deneyler en iyi diğer kültür biçimlerini kullanarak yüksek faiz-puanlama dizilmiş koşulları, tahlil okumalara ve biyolojik model sistemleri doğrulama ile tamamlanmaktadır. Spesifik olarak, daha ayrıntılı bir şekilde, standart moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, QRT-PCR, immün) veya standart TFM ile bağlantılı dökme kültürleri kullanılarak seçme dizilmiş koşullarının kanıtlayan önerilir. Genetik manipülasyon Ayrıca diziler gözlenen etkileri onaylamak için hizmet, uygun bir biyolojik model sisteminde ilgi faktörünün (örneğin, demonte veya aşırı ifadesi). In vivo hayvan modelleri doğrulama başka bir yöntem temsil en son galektin-3 ve galektin-8 merkezi rolü teyit etmek için, örneğin, kullanılanAkciğer kanseri metastatik niş, başlangıçta hücre mikroarray 31 49 aracılığıyla belirledi.

Diğer bir dizi yöntem, iki boyutlu bir mikrofabrike sistemleri 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ve üç boyutlu tasarlanmış biyomalzeme sistemleri 56, çeşitli 57, 58 dahil olmak üzere, hücresel fonksiyonları microenvironmental düzenleme, problamak için kullanılmıştır , 59, 60, 61. diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada tarif edilen hücre mikrodizi platformun özel avantajlar oluşur: (1) ila yukarı çıktıyüzlerce veya etkileşim etkilerinin analizi sağlayan faktörlerin farklı kombinasyonları, binlerce; (2) erişilebilir, otomatik görüntüleme ve analizi; (3) dizilmiş faktörlerin kontrollü sunumu ile hem biyokimyasal ve biyofiziksel okumalarla entegrasyonu; (4) alt-tabaka malzemesi özellikleri değiştirme yeteneğini de; hücre kaderinin ve fonksiyonu ve (5) yüksek içeriği tek hücre analizi.

Özetle, ayarlanabilir alt tabaka sertliği yüzeylerde TFM hücre microarrays kombinasyonu hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının kapsamlı karakterizasyonu sağlar. Burada görüldüğü gibi, bu platform genellenebilir ve hali hazırda hücre farklılaşması ve mechanotransduction kombinatoryal mikro-çevresel bir düzenleme daha iyi anlaşılması doğru yapışık hücre tipleri ve doku çeşitli bağlamlarda da uygulanabilir.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Teşekkürler

Biz kabul Austin Cyphersmith ve Mayandi Sivaguru (Genomik Biyoloji Carl R. Woese Enstitüsü, University of Illinois at Urbana Champaign) mikroskobu ile yardım için ve cömertçe mikroskopi özünde ekran ve video çekimi barındırmak için.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 µm syringe filterPall Corporation4433Match with appropriately-sized Luer lock plastic syringes.
100 × penicillin–streptomycin solutionFisher ScientificSV30010
22 × 60 mm coverglassesElectron Microscopy Sciences63765
3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate (3-TPM)Sigma-Aldrich440159Store under inert gas per manufacturer's instructions. Exposure of 3-TPM to air could compromise silanization of glass substrates. CAUTION: 3-TPM is a combustible liquid. Keep away from heat, sparks, open flames, and hot surfaces and use only in a chemical fume hood.
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate (CHAPS)Sigma-AldrichC3023
35 mm glass-bottom Petri dishesCell E&GGBD00002-20013 mm well consisting of #1.5 coverglass. Enables TFM and live-cell imaging.
384-well polypropylene V-bottom microplate, non-sterileUSA Scientific1823-8400
6-well polystyrene microplatesFisher Scientific08-772-1B35 mm glass-bottom Petri dishes fit into wells of microplate, easing array fabrication.
AcetoneSigma-Aldrich179973
AcrylamideSigma-AldrichA3553CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Collagen I, rat tailEMD Millipore08-115MI
Collagen III, humanEMD MilliporeCC054
Collagen IV, humanEMD MilliporeCC076
Crosslinker, 365 nmUVPCL-1000
Dextran, rhodamine B-conjugated, 70 kDaThermoFisher ScientificD1841Used as a marker for array location.
Dimethyl sulfoxideFisher ScientificBP231
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific (HyClone)SH3001302
Ethyl alcoholDecon Labs2701
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichED
Fc-recombinant DLL1, mouseR&D Systems5026-DL-050
Fc-recombinant DLL4, mouseAdipoGenAG-40A-0145-C050
Fc-recombinant JAG1, ratR&D Systems599-JG-100
Fibronectin, humanSigma-AldrichF2006
Fluorescent microscope, invertedZeissAxiovert 200MEnsure microscope is equipped with a robotic stage for both automated fluorescent imaging and TFM. Environmental control (i.e., 37 °C and 5% CO2) is highly advisable for TFM.
Fluoromount G with DAPISouthernBiotech0100-20
Glacial acetic acidSigma-Aldrich695092CAUTION: Acetic acid is flammable and corrosive. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
GlycerolSigma-AldrichM6145
Irgacure 2959BASF Corporation55047962
Laminin, mouseEMD MilliporeCC095
MethanolSigma-Aldrich179957
Microarray scannerGenePix4000BFluorophores must be Cy3- or Cy5-compatible.
MicroarrayerDigilabOmniGrid MicroOther microarrayers of similar or greater capability can readily be substituted.
Microscope slides, 25 × 75 mmSigma-AldrichCLS294775X25~0.9 – 1.1 mm thickness.
N,N′-Methylenebisacrylamide (bisacrylamide)Sigma-AldrichM7279CAUTION: Exposure to acrylamide can result in acute toxicity and irritation. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Paraformaldehyde (PFA), 16% v/vElectron Microscopy SciencesRT15710Prepare PFA fresh (do not store) for optimal fixation. CAUTION: Exposure to PFA can result in acute toxicity and can also irritate or corrode skin on contact. Wear protective gloves, clothing, and eye protection and use only in a chemical fume hood.
Protein A/G, recombinantThermoFisher Scientific21186
Pyrex drying tray, 2,000 mLFisher Scientific15-242B
Rectangular 4-chambered culture dishFisher Scientific (Nunc)12-565-495For cell culture on arrayed microscope slides.
Sodium acetateSigma-AldrichS2889
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413CAUTION: NaOH is highly caustic and can cause severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Stealth pin for arrayingArrayItSMP3Clean pins after each array run using the instructions of the manufacturer. Produces 150 micron domains; purchase other pin sizes (75–450 microns) as suited to your particular application.
Triton X-100Sigma-AldrichX100

Referanslar

  1. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
  2. Hsu, Y. C., Fuchs, E. A family business: stem cell progeny join the niche to regulate homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (2), 103-114 (2012).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (1), 11-21 (2008).
  5. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  6. Trappmann, B., et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nat Mater. 11 (7), 642-649 (2012).
  7. Ivanovska, I. L., Shin, J. W., Swift, J., Discher, D. E. Stem cell mechanobiology: diverse lessons from bone marrow. Trends Cell Biol. 25 (9), 523-532 (2015).
  8. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  9. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  10. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell. 6 (4), 483-495 (2004).
  11. Legate, K. R., Wickstrom, S. A., Fassler, R. Genetic and cell biological analysis of integrin outside-in signaling. Genes Dev. 23 (4), 397-418 (2009).
  12. Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141 (1), 52-67 (2010).
  13. Underhill, G. H. Stem cell bioengineering at the interface of systems-based models and high-throughput platforms. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 4 (6), 525-545 (2012).
  14. Underhill, G. H., Galie, P., Chen, C. S., Bhatia, S. N. Bioengineering methods for analysis of cells in vitro. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 385-410 (2012).
  15. Zorlutuna, P., et al. Microfabricated biomaterials for engineering 3D tissues. Adv Mater. 24 (14), 1782-1804 (2012).
  16. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  17. Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends Biotechnol. 29 (4), 183-190 (2011).
  18. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  19. Ranga, A., Lutolf, M. P. High-throughput approaches for the analysis of extrinsic regulators of stem cell fate. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 236-244 (2012).
  20. Kobel, S., Lutolf, M. High-throughput methods to define complex stem cell niches. Biotechniques. 48 (4), ix-xxii (2010).
  21. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. M. S. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends Biotechnol. 27 (6), 342-349 (2009).
  22. Montanez-Sauri, S. I., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microscale screening systems for 3D cellular microenvironments: platforms, advances, and challenges. Cell Mol Life Sci. 72 (2), 237-249 (2015).
  23. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat Methods. 2 (2), 119-125 (2005).
  24. Underhill, G. H., Flaim, C. J., Bhatia, S. N., Parekkadan, B., Yarmush, M. . Methods in Bioengineering: Stem Cell Bioengineering Artech House Methods in Bioengineering. , 63-73 (2009).
  25. Brafman, D. A., Chien, S., Willert, K. Arrayed cellular microenvironments for identifying culture and differentiation conditions for stem, primary and rare cell populations. Nat Protoc. 7 (4), 703-717 (2012).
  26. Brafman, D. A., et al. Investigating the role of the extracellular environment in modulating hepatic stellate cell biology with arrayed combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (8-9), 513-524 (2009).
  27. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol Syst Biol. 2, 37 (2006).
  28. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integr Biol. 1 (1), 70-79 (2009).
  29. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
  30. Brafman, D. A., Shah, K. D., Fellner, T., Chien, S., Willert, K. Defining long-term maintenance conditions of human embryonic stem cells with arrayed cellular microenvironment technology. Stem Cells Dev. 18 (8), 1141-1154 (2009).
  31. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nat Commun. 3, 1122 (2012).
  32. Wood, K. C., et al. MicroSCALE screening reveals genetic modifiers of therapeutic response in melanoma. Sci Signal. 5 (224), rs4 (2012).
  33. Braga Malta, D. F., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  34. Kaylan, K. B., Ermilova, V., Yada, R. C., Underhill, G. H. Combinatorial microenvironmental regulation of liver progenitor differentiation by Notch ligands, TGFbeta, and extracellular matrix. Sci Rep. 6 (23490), 23490 (2016).
  35. Kourouklis, A. P., Kaylan, K. B., Underhill, G. H. Substrate stiffness and matrix composition coordinately control the differentiation of liver progenitor cells. Biomaterials. 99, 82-94 (2016).
  36. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integr. Biol. , (2016).
  37. Mann, C., Leckband, D. Measuring Traction Forces in Long-Term Cell Cultures. Cellular and Molecular Bioengineering. 3 (1), 40-49 (2010).
  38. Heisenberg, C. P., Bellaiche, Y. Forces in tissue morphogenesis and patterning. Cell. 153 (5), 948-962 (2013).
  39. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  40. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  41. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13 (10), 979-987 (2014).
  42. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. J Vis Exp. (91), e51873 (2014).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  46. Bolstad, B. M., Irizarry, R. A., Astrand, M., Speed, T. P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics. 19 (2), 185-193 (2003).
  47. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. Am J Physiol Cell Physiol. 282 (3), C606-C616 (2002).
  48. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (1), C146-C154 (2011).
  49. Reticker-Flynn, N. E., Bhatia, S. N. Aberrant glycosylation promotes lung cancer metastasis through adhesion to galectins in the metastatic niche. Cancer Discov. 5 (2), 168-181 (2015).
  50. Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric control of cell life and death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
  51. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (11), 4872 (2010).
  52. Nelson, C. M., Chen, C. S. Cell-cell signaling by direct contact increases cell proliferation via a PI3K-dependent signal. FEBS Lett. 514 (2-3), 238-242 (2002).
  53. Hui, E. E., Bhatia, S. N. Micromechanical control of cell-cell interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 5722-5726 (2007).
  54. Lutolf, M. P., Blau, H. M. Artificial stem cell niches. Adv Mater. 21 (32-33), 3255-3268 (2009).
  55. Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nat. Methods. 8 (11), 949-955 (2011).
  56. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  57. Nelson, C. M., VanDuijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Sci. STKE. 314 (5797), 298 (2006).
  58. Liu Tsang, V., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
  59. Albrecht, D. R., Underhill, G. H., Mendelson, A., Bhatia, S. N. Multiphase electropatterning of cells and biomaterials. Lab. Chip. 7 (6), 702-709 (2007).
  60. Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab. Chip. 10 (16), 2062-2070 (2010).
  61. Boghaert, E., et al. Host epithelial geometry regulates breast cancer cell invasiveness. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (48), 19632-19637 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 121doku m hendisli ibiyomalzemelerbiyomekanikmikro evresininh cre mikroarraylerk k ve progenit r h cre biyolojisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır