Aβ mutlak Niceleme<sub&gt; 1-42</sub&gt; BOS bir kitle Spektrometrik Referans Ölçüm Prosedürü kullanma

Özet

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Özet

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Giriş

Alzheimer hastalığı (AD), demansın en yaygın biçimidir ve dünya çapında ¹ ila yaklaşık 35 milyon insanı etkiler. Yaygın AD patogenezinde özünde yalan inanılan hastalığın nöropatolojik işaretlerinden toplu amiloid-beta (Aβ) peptitler ³ oluşan hiperfosforile tau proteininin ² hücre içi nörofibrillerin ve hücre dışı plaklar vardır. Buna paralel olarak, biyomarkerların tarafından in vivo plak patoloji değerlendirmesi son zamanlarda AD ⁴ araştırma tanı kriterleri dahil edilmiştir. Aβ _1-42 BOS ölçümleri için, çok sayıda bağışıklık mevcuttur ve çok sayıda klinik laboratuarlarda ⁵ kullanılır. BOS Aβ _1-42 konsantrasyonu br plaklarda peptidin birikme yansıtan bilişsel normal yaşlılarda daha AD hastalarında yaklaşık olarak% 50 daha düşüktürain ^{6, 7.}

Bu biyolojik esas olarak immün (örneğin, antikor bazlı teknikleri) kullanılarak analiz edilir, ancak bu deneyler, matriks etkileri ⁸ etkilenebilir. Farklı teknoloji platformları üzerinde immunoassay ve tahlil standardizasyon ⁹ eksikliği ^{kullanımı 10 11, 12} zorlu küresel kesme konsantrasyonlarının giriş yapar. Analitik doğrulanmış RMP ideal analitik platformlarda daha iyi karşılaştırılabilirlik ve genel ölçüm değişkenliği katkıda bulunan faktörlerden daha iyi kontrol sonuçlanan farklı tahlil platformları üniforma kalibrasyonunu imkan verecek.

Geliştirilmiş LC-MS / MS yöntemi kullanılarak Aβ _1-42 mutlak ölçümü antikor bazlı techn ile bağlantılı sorunların üstesinden geliriques. Laboratuvar Tıp İzlenebilirlik için Ortak Komitesi (JCTLM veritabanı kimlik numarası C11RMP9) tarafından bir RPM olarak listelenen yöntem, BOS Aβ ₁ uyumlaştırmak için bir Sertifikalı Referans Malzeme (CRM) içinde Aβ _1-42 mutlak konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır teknikleri ve analitik platformlarda _-42 ölçümler. açıklanan iş akışı Tıbbın diğer alanlarında peptidler ve proteinler için aday başvuru yöntemlerinin geliştirilmesi için alaka olmalıdır.

Protokol

NOT: Bu protokol, başlangıç ​​malzemesi olarak, her Aβ peptidi için 50 ug / ml bir konsantrasyonda en az 50 uL hacimde, gerektirir. Aβ peptidler, deiyonize su içinde% 20 asetonitril (ACN) ve% 4, konsantre amonyak çözeltisi (hac / hac) içinde çözülmüş ve 80 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir.

Dikkat: güvenlik bilgisi için Tablo 1'e bakınız.

Çözümler 1. hazırlanması

1. ACN 20 ml deiyonize su içinde konsantre edilmiş amonyak 4 mL (~% 25) seyreltilmesi ile% 20 ACN ve% 4, 100 ml deiyonize edilmiş su (hacim / hacim) konsantre amonyak çözeltisi hazırlayın. iyonu giderilmiş su ile 100 mL nihai hacim ayarlayın. her gün taze olun.
2. 50 mL'lik bir son hacme kadar iyonu giderilmiş su içinde guanidin-hidroklorür 26.08 g çözülmesiyle 5 M guanidin-hidroklorid 50 mL hazırlayın. 20 ° C'de saklayın ve taze Aylık'ı yapmak.
3. (Deiyonize su içinde% 4 fosforik asit 200 mL Hazırlama V /h) deiyonize su içinde konsantre edilmiş fosforik asit (~% 85) 9.4 ml seyreltilmesiyle. iyonu giderilmiş su ile 200 mL nihai hacim ayarlayın. Buzdolabında saklayın ve taze haftalık yapmak.
4. ACN, 37.5 mL deiyonize su içinde konsantre edilmiş amonyak 5 mL (~% 25) seyreltilmesi ile deiyonize su içinde 50% 75 ACN mL ve% 10 konsantre edilmiş amonyak çözeltisi (hac / hac) hazırlayın. iyonu giderilmiş su ile 50 ml nihai hacim ayarlayın. her gün taze olun.
5. Rutin klinik analizden de tanımlanan artık örneklerden elde edilen kalibratör, insan CSF en az 2.5 mL çözülme.
6. 150 mM Na, 3.0 mM K, 1.4 mM Ca, 0.8 mM Mg, 1.0 mM p ve deiyonize su içinde 155 mM CI ihtiva eden suni CSF hazırlamak ve 4 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar sığır serum albümini ekleyin. Sadece 1 ml gelecekte kullanılmak üzere kısım bunu, ve mağaza, analiz başına gerekli, ama büyük hacimli hazırlamak olduğunu.

Kalibratörlerimizden 2. Hazırlık

1. 4 ug 0.5 mL hazırlayın / ml ¹0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 0.46 mL / ¹⁵ mL NAβ ₁₄₂ 50 ug 40 uL eklenmesiyle 5 NAβ _1-42 peptid. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
2. 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 1.95 mL 4 ug / ml ¹⁵ NAβ ₁₄₂ 50 uL eklenmesiyle, 100 ng / ml ¹⁵ NAβ _1-42 peptid 2 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
3. Tablo 2'de belirtilen her bir çözelti miktarı karıştırılarak altı kalibratör solüsyonları (AF) hazırlayın. 0.5, 1.5, ve 2 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
4. karşılık gelen kalibrasyon çözümleri ve 1 dakika boyunca bir vorteks karıştırıcıda Tablo 3. Karışımı uygun olarak insan CSF eklenerek 0.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde (çift olarak) son kalibratörleri hazırlayın.

Dahili standardın 3. hazırlanması

1. 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 1.968 mL / ¹³ mL CAβ ₁₄₂ 50 ug 32 uL eklenmesiyle / ml ¹³ CAβ _1-42 peptid 0.8 ug 2 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
2. 5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 4.9 ml 0.8 ug / ml 0.1 ml ilave edilerek 16 ng / ml ¹³ CAβ _1-42 peptid 5 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.

Yanıt Faktörü Numunenin 4. hazırlanması

Not: yanıt faktörü (RF) belirlenmesi kalibrasyon ⁽¹⁵ NAβ _1-42) için kullanılan işaretli peptidin konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu yerli Aβ _1-42 peptid konsantrasyonu amino asit analizi (AAA) ile tespit edilmiştir gerektirir. Bu durumda, ses ve yerli Aβ _1-42 peptid alikotları konsantrasyonuAAA gereklerini yerine getirmek gerekir.

1. 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 0.46 mL / mL nativ Aβ _1-42 50 ug 40 uL eklenmesiyle (etiketlenmemiş) 4 ug / mL nativ ^Aβ _1-42 0.5 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
2. % 20 1.96 mi, 4 ug / mL nativ Aβ _1-42 ve 4 ug 20 ul / ml ¹⁵ NAβ _1-42 20 uL eklenmesiyle yerli ¹⁵ NAβ _1-42 bir 2 mL 40 ng / ml karışımı hazırlayın ACN ve% 4 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde amonyak konsantre edildi. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
3. 0.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde suni CSF 0.38 mL 40 ng / ml karışımı 20 uL ekleyin. çiftleri hazırlayın ve 1 dakika boyunca bir vorteks karıştırıcıda karıştırılır.

5. Numune Hazırlama

NOT: örnekleri çözülme rulo üzerinde oda sıcaklığında ölçülecek.

1. Şekil 1'e göre, bir 1 ml protein 96 derin oyuklu plakaya her kalibratör, yanıt faktörü ve (kullanıldığı takdirde kalite kontrol [QC] örnekleri dahil) bilinmeyen numunenin 0.18 mL ekleyin (tam bir plaka varsayılarak kullanılır). örnekleri eklemeyi unutmayın, ya da kuyu dibine, yakın olun.
2. Her iyi (yani, kalibratörler, tepki faktörleri, QCS ve bilinmeyenler) iç standardın 20 uL ekleyin; o pipet batış olmadan numunenin yüzeyine iyice yakın tarafında damla serbest bırakmak için önemlidir.
3. Her bir oyuğa 0.2 ml 5 M guanidin-hidroklorür ekleyin.
4. bir mikro çalkalayıcı örnek plakasını ve 1100 rpm'de 45 dakika süre ile numuneler karıştırın. Optimal frekans enstrümantasyon bağlı olarak farklılık olabilir. Mikserin frekans ve genliği ayarlayın çözümler iyice karıştırılır ve iç standart veya CSF hiçbir damla kuyuların tarafında karışmamış bırakılır böylece.
5. % 4 fosforik asit 0.2 mL eklemeher oyuğa. Vortex kısaca karıştırın.

6. Katı Faz Ekstraksiyon

Not: Tüm yıkama, yükleme ve elüsyon adımlarda, çözelti ilave edildikten sonra mümkün olan en düşük vakum uygulanır ve yük veya çözelti elüt edilmesi için gerektiği şekilde yavaş yavaş artar. Her yükleme ve elüsyon adım arasındaki vakum devre dışı bırakın.

1. karma modunda atıklar için bir rezervuar tepsi koyun, ekstraksiyon plakası manifold bölmesi katyon-değişim, 96-çukurlu bir katı faz ekstraksiyonu (SPE) plaka.
2. Her bir oyuğa 0.2 ml metanol eklenerek SPE sorbent hale getirin.
3. her kuyuya% 4 fosforik asit 0.2 ml ilave edilerek sorbent dengelenmesi.
4. SPE plakasına derin kuyu plaka tüm örnekleri (her kuyuda yaklaşık 0.62 ml) aktarın. SPE plakasına derin kuyu plaka örnekleri aktarırken sekiz kanallı pipet kullanın; Numuneler, bir intern içeren, çünkü tüm örneklerin tamamı veya eşit hacimlerde aktarmak için önemli değildirdeğişimleri telafi edecek al standardı.
5. Numuneler her kuyuya% 4 fosforik asit 0.2 ml ilave edilerek üzerinden geçtikten sonra sorbent yıkayın.
6. yıkayıcı çözücü sorbentten elüt sonra, bir toplama plakası ve tüpler haznesi tepsisini değiştirin.
7. iki kez% 75 ACN /% 10 konsantre amonyak 50 uL eklenmesiyle sorbentten örnek Zehir, ve bu çözelti, sorbent geçmesi için çok düşük bir vakum gerektirdiğini not edin. her ilave arasında vakum devre dışı bırakmak için unutmayın.
   1. İSTEĞE BAĞLI: toplama plakası veya tüpleri Seal ve -80 ° C'de onları dondurmak. 6.8.2 adıma geçmeden önce toplama plakası veya tüplerden contayı sökün.
   2. (Isı uygulamadan) vakum santrifüj kullanılarak eluatları Kuru; Bu vakum santrifüj bağlı olarak birkaç saat birinden alabilir.
   3. kapları mühür ve -80 ° C'de onları dondurmak.

7. Sıvı Chromatografisi

1. Ve iğne yıkama (% 50 ACN (ACN [hacim / hacim]% 4, deiyonize su ve% 0.1 konsantre edilmiş amonyak), B (iyonu giderilmiş su [hacim / hacim]% 5 ACN ile% 0.3 konsantre edilmiş amonyak), mobil faz A Hazırlama ve% 4, deiyonize su içinde amonyak konsantre edildi: [hacim / hacim]).
   1. Mobil faz A, 500 ml ACN 25 mL deiyonize su konsantre amonyak 1.5 ml. iyonu giderilmiş su ile 500 mL nihai hacim ayarlayın.
   2. mobil faz B, 500 ml konsantre amonyak 500 uL ACN iyondan arındırılmış 25 ml su ilave edin. ACN ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın.
   3. ACN, 120 ml deiyonize su, konsantre amonyak 10 ml ilave iğne yıkama 250 mL hazırlayın. deiyonize su ile 250 mL son ses seviyesini ayarlayın.
   4. LC sistemi kullanmadan önce 20 dakika süreyle sonikasyon banyosunda açık mobil fazlar A ve B iğne yıkama şişeleri koymak
2. 25 uL konsantrasyon% ACN% 20 ve 4 ile her bir örnek çözülürted amonyak çözeltisi, 20 dakika süre ile bir çalkalama üzerine yerleştirin ve. örneklerin aşağı santrifüj ve alıcısı içinde koyun (7 ° C'de tutmak).
3. 50 ° C 'de muhafaza edilen bir 1 x 250 ila ² mm polistiren-divinilbenzen (ters faz) monolitik kolon üzerinde örneğin 20 ul enjekte edilir.
   1. 0.3 mL / dakika bir akış oranı ile Tablo 4'te gösterilmiştir LC gradyanı kullanın. kütle spektrometresi kirlenmesini azaltmak için yönlendirme vanası kullanılarak (post-sütun) atık ilk iki ve son beş dakika yönlendir.

8. Kitle spektrometrik analiz

NOT: Bu parametreler aheated elektrosprey iyonizasyon kaynağı ile teçhiz edilmiş bir dört kutuplu-Orbitrap hibrid kütle spektrometresi kullanıldı.

1. Tablo 5'e uygun iyon kaynağı parametrelerini ayarlar.
2. (Yerli Aβ _1-42 4+ şarj durumlarını izole etmek için 1,129.48 kütle cinsinden MS cihazı ayarlayın2,5 m / z yalıtım genişliği kuadruple kitle analizatöründe için şarj oranı [m / z]), _1-42 ¹⁵ NAβ (1,143.00 m / z), ve ¹³ CAβ _1-42 (1,179.50 m / z).
3. 17.0 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE) ile çarpışma hücresinde izole peptidler parçalara. (Örneğin, bir üçlü dört MS gibi araçlarla diğer türleri, kullanımı ve özellikle de) da aynı türde Bu, her enstrüman için ayarlanmış olması gerekebilir.
4. 2 x 10 ⁵ ücretleri otomatik kazanç kontrol hedefine ve 250 ms maksimum enjeksiyon süresi ile 17.500 çözünürlüğe sahip fragmanı spektrumları kaydedin.

9. Veri İşleme

1. Her peptit için kromatografik alanları hesaplamak için Tablo 6'da (± 250 mili kütle birimlik [mmu] kütle toleransla) Ürün iyonlarının toplamı kullanın. iyon türleri ve sayıları yalnızca yerel Aβ için gösterilen unutmayın _{1-42 ürün iyonları, bu ¹⁵ NAβ 1-42 ve ¹³ CAβ 1-42 için aynı olduğundan.}
2. Yerel Aβ _1-42 eğri altında kalan alan ¹⁵ NAβ _1-42 eğrisi (kromatografik tepe) altındaki alanı bölünmesiyle iki farklı yanıt faktörü numunelerin ortalama yanıt faktörünü belirleyin.
3. Adım 9.2 hesaplanan tepki faktörü ile çarpılarak kalibrasyon için kullanılan ¹⁵ NAβ _1-42 konsantrasyonu ayarlayın.
4. Konsantrasyonuna karşı kalibratör iki grup ¹³ CAβ _1-42 kadar NAβ ^{_1-42, 15} alan oranları işaretlenmesiyle bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak.
5. lineer regresyon kullanılarak kalibrasyon eğrisinin eğimini ve kesişme hesaplayın.
6. Un iç standart (CAβ _1-42 ¹³⁾ yerli Aβ _1-42 alanı oranını hesaplamakBilinen örnekler.
7. Adım 9.5 'de elde edilen eğim ve kesişme kullanarak kalibrasyon eğrisinden bilinmeyen örneklerinin konsantrasyonunu tahmin.

Sonuçlar

Şekil 1 'de plaka kurulumu numune tam levha kullanılır. Daha az bilinmeyen numuneler analiz edilecek ise, ikinci kalibratör, RF, ve QC setleri bilinmeyen numunelerin ilk yarısından sonra konulmalıdır.

Şekil 2'de görüldüğü gibi, kalibratörler, düşük ve standart sapmalar, regresyon çizgisine yakın bulunmaktadır. Bu yöntem, 150 pg / ml ve 4,000 pg / ml miktarının b...

Tartışmalar

Tarif edilen yöntem için, bunun yerine bir yedek matris kullanılarak, insan CSF kalibrasyon sağlar taşıyıcı analit yaklaşım ^{13, 14, 15, 16,} kullanılır. vekil analit yaklaşım iki farklı izotopik olarak etiketlenmiş standartları içerir. Başka bir ⁽¹³ CAβ _142), dahili standart olarak kullanılır ise bir ⁽¹⁵ NAβ _142), insan CSF kali...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000