Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, nörobilim ve nörofarmakoloji araştırmalarında in vitro bir model olarak kullanılan birincil nöronal kültür olan kültürlenmiş serebellar granül nöronlarında Fluorescein diasetat (FDA) ve Propidyum İyodür (PI) çift boyasını kullanarak nöronal canlılığı nasıl doğru bir şekilde ölçtüğümü açıklamaktadır.

Özet

Primer kültürlü Serebellar Granül Nöronları (CGN'ler) sinirbilimi ve nörofarmakoloji araştırmalarında in vitro bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, CGN kültüründe glial hücrelerin ve nöronların bir arada bulunması, nöronal canlılığın doğru bir şekilde değerlendirilmesinde önyargılara neden olabilir. Flöresein diasetat (FDA) ve Propidium Iodide (PI) çift boyama, canlı ve ölü hücreleri aynı anda değerlendirerek hücre yaşayabilirliğini ölçmek için kullanılmıştır. Kolorimetrik deneylerin duyarlılıklarını arttırmak ve CGN'lerde nöronal canlılığı değerlendirmek için FDA-PI çift boyamayı kullandık. Ayrıca, doğruluğunu artırmak için mavi floresan DNA lekelerini ( örn. Hoechst) ekledik. Bu protokol, CGN kültüründe bu yöntemleri kullanarak nöronal canlılığın değerlendirilmesinin doğruluğunu nasıl geliştireceğini açıklar. Bu protokolü kullanarak, glial hücrelerin sayısı floresan mikroskopisi kullanılarak çıkarılabilir. Benzer bir strateji istenmeyen gliyi ayırt etmek için de uygulanabilirÇeşitli hücrelerde, örneğin birincil kortikal kültür ve hipokampal kültürdeki nöronlardan hücreler.

Giriş

3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolyum bromür (MTT) tahlili gibi kolorimetrik sitotoksiklik testleri , hücre canlılığını in vitro olarak ölçmek için yaygın olarak kullanılır. Sıçanlardan alınan primer kültüre edilmiş Serebellar Granül Nöronları (CGN'ler) 1-metil-4-fenilpiridinyum iyonu, hidrojen peroksit ve glutamat ^{1 , 2} de dahil olmak üzere çeşitli nevrotoksinlere duyarlıdır. Bu nedenle, CGN kültürleri sinirbilimi alanında in vitro bir model olarak kullanılabilir. CGN kültürleri, CGN kültüründeki toplam hücrelerin yaklaşık% 1'ini oluşturabilen nöronlar ve glial hücreler de dahil olmak üzere çeşitli hücreler içerebilir. Bununla birlikte, glial hücreler, nöronlara kıyasla nörotoksinlere farklı şekilde tepki verirler, bu da kolorimetrik testler ^{3 ile} ölçülen nöronal canlılığın önyargısına neden olurlar.

Canlı hücrelerde, floresein diasetat (FDA), esteraz ile floreseine dönüştürülebilir.Propidyum iyodür (PI) ölü hücrelere nüfuz ettikten sonra DNA ile etkileşime girebilir ve kültür içinde apoptozu göstermek için kullanılabilir. Bu nedenle, FDA-PI çift boyama, canlı hücre ve ölü hücreleri aynı anda değerlendirebilir, bu da, her iki kolorimetrik yöntemi birleştirerek hücrenin yaşayabilirliğinin daha doğru bir şekilde ölçülebileceğini düşündürür. Ayrıca, çekirdekler için mavi bir flüoresan lekesi olan Hoechst eklenerek hücre canlılığının doğruluğu daha da geliştirilebilir. Burada sunulan protokol, primer kültürlenmiş CGN'lerin nöronal canlılığını doğru bir şekilde analiz etmek için kullanılabilen FDA-PI çift boyama ve FDA-PI-Hoechst üçlü boyamayı anlatmaktadır.

Bu protokol CGN'leri ve glial hücreleri farklı boyut ve şekillerle görselleştirmek ve ayırt etmekten yararlanmaktadır. Boyama sonrasında, canlı nöronların ve ölü ölü hücrelerin sayıları, flüoresan mikroskobu ile alınan temsili görüntülerden sayılır. Büyük boyutlu glial hücreler, tipik CGN'lerin karşılaştırılmasıyla hariç tutulurFloresan modu altında afiş kontrast modunda alınan ile. Primer kortikal kültürler ve hipokampal kültürler gibi nöronlar ve glial hücreler içeren karışık hücre kültürlerinde nöronal canlılığı ölçmek için benzer bir strateji uygulanabilir.

Protokol

Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (NIH Yayınları No. 80-23, 1996'da revize edilmiştir) ve Ningbo Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ( SYXK-2008-0110).

1. Çözeltilerin ve Kültür Ortamlarının Hazırlanması

Not: Reaktifler ve stokların steril koşullar altında hazırlanması gerekir. 0.22 μm gözenek boyutlu bir filtre kullanarak filtrelemek suretiyle sterilize edin.

1. 10 mL çift damıtılmış suya (ddH2O) 5 mg PLL ilave ederek Poli-L-Lizin (PLL) stok solüsyonu hazırlayın. Filtreleme ile sterilize edin. Birkaç ay süreyle -20 ° C sıcaklıkta PLL stok solüsyonunu alın ve saklayın.
2. Krebs tamponunu, 7.2 mL NaCl, 0.4 g KCI, 0.14 g NaH2P04, 2.6 g D-glikoz ve 5.94 g 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit ilave ederek hazırlayın. DdH2 _</ Sub> O. Filtreleme ile sterilize edin. Krebs tampon çözeltisini 1 a kadar 4 ° C'de saklayın.
3. 100 mL ddH2O'ya 3.82 g Mg2S04 ilave ederek% 3.82 Mg2SO4 çözeltisi hazırlayın. Süzüntü ile sterilize edin. Mg ₂ SO ₄ solüsyonunu birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
4. 100 mL ddH2O'ya 1.2 g CaCl2 ilave ederek% 1.2 CaCI2 çözeltisi hazırlayın. Filtreleme ile sterilize edin. CaCl ₂ solüsyonunu birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
5. 100 mL ddH2O'ya 15 g KCI ekleyerek 2M KCI solüsyonu hazırlayın. Süzüntü ile sterilize edin. KCl solüsyonunu birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
6. D-glikoz stok solüsyonunu, 100 mL ddH20'ya 1,8 g D-glikoz ilave ederek hazırlayın. Süzmek suretiyle sterilize edin. D-glukoz çözeltisini 4 ° C'de bir aya kadar alıkoyun ve saklayın.
7. Sitozin β-D-Arabinofuranosid (Ara-C) stok solüsyonu hazırlayınIyonu 0.24 g Ara-C'yi 10 mL ddH20'ya ekleyerek filtre ederek sterilize edin. Ara-C stok solüsyonunu aylarken ve birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
8. 25 mL Fetal Sığır Serumu (FBS), 2.5 mL 100x glutamin, 2.78 mL 2M KCl solüsyonu ve 2.5 mL Bazal Orta Kartal (BME) içinde 100x antibiyotik kullanılarak 250 mL kültür ortamı hazırlayın (25-30 yavru için) . Hacmi 250 mL'ye ayarlayın ve filtreleyerek sterilize edin.
9. BME'de 2.5 mL 100x glutamin, 2.78 mL 2M KCl solüsyonu ve 2.5 mL 100x antibiyotik kullanılarak 25K ortam hazırlayın. Hacmi 250 mL'ye ayarlayın ve filtreleyerek sterilize edin.
10. BME'de 2.5 mL 100x glutamin ve 2.5 mL 100X antibiyotik kullanılarak 5K ortam hazırlayın. Hacmi 250 mL'ye ayarlayın ve filtreleyerek sterilize edin.
    NOT: Kültür ortamı, 25K orta ve 5K orta yeni hazırlanmalıdır
11. 1 mL asetona 5 mg FDA ilave ederek FDA stok solüsyonu hazırlayın. Uzun süreli saklama için FDA stok solüsyonunu 4 ° C'de saklayın.
12. 1 mL ddH ₂ O'ya 1 mg PI ilave ederek PI stok solüsyonu hazırlayın. PI stok solüsyonunu birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklayın.
13. 1 mL ddH ₂ O'ya 5 mg Hoechst 33342 ekleyerek Hoechst stok solüsyonu hazırlayın. Hoechst stok solüsyonunu birkaç ay boyunca 4 ° C'de saklayın.

2. Diseksiyon Çözümlerinin Hazırlanması

NOT: Diseksiyon öncesinde 1 gün yapın.

1. 15 mL Krebs tamponu, 1.2 mL% 3.82 Mg ₂ SO ₄ solüsyonu ve 0.45 g Sığır Serum Albümini (BSA) 150 mL ddH 2 O'ya ilave ederek diseksiyon çözeltisini hazırlayın. NaOH kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
2. 5 x 50 mL tüpleri aşağıdaki gibi etiketleyin: 1, 2, 3, 4 ve 5.
3. 40 mL disseksiyon çözeltisi, 50 mL'lik şırıngaya filtre ile yerleştirilir. Tüp 1'e 30 mL diseksiyon solüsyonu ve dokuları işlemek için kullanılacak birkaç 35 mm hücre kültürü bulgusuna her biri 2 mL'lik bir filtre uygulayın.
4. TUbe 2, 50 mL diseksiyon çözeltisine 12.5 mg tripsin ekleyin. Vorteksleme ile tamamen karıştırın. Filtreleme ile sterilize edin.
5. Tüp 3'e 15 mL diseksiyon çözeltisi içinde 1.2 mg DNAse I, 7.8 mg soya fasulyesi tripsin önleyicisi ve 150 uL% 3.82 Mg2S04 çözeltisi ilave edin. Vorteksleme ile tamamen karıştırın. Filtreleme ile sterilize edin.
6. Tüp 4'e, tüb 3'ten 5 mL solüsyon ekleyin. 10.5 mL diseksiyon solüsyonu ekleyin. Filtreleme ile sterilize edin.
7. Tüp 5'e 12.5 mL diseksiyon solüsyonunda 100 μL% 3.82 Mg ₂ SO ₄ solüsyonu ve 15 uL% 1.2 CaCl ₂ solüsyonu ilave edin. Vorteksleme ile tamamen karıştırın. Filtreleme ile sterilize edin.
8. Kullanmadan önce tüm tüpleri 4 ° C'de saklayın.

3. Hücre Kültür Plakalarını Kaplama

NOT: Diseksiyon öncesinde 1 gün yapın.

1. 100 mL ddH2O'ya (son konsantrasyon: 5 μg / mL) 1 mL PLL stok solüsyonu ilave edin. Plastik kap5-μg / mL poli-L-lisin çözeltisi ilave edilerek 6-çukurlu veya 12-çukurlu hücre kültürü plakalarına (6 oyuklu hücre kültürü plakaları için oyuk başına 2 mL veya 12 oyuklu hücre kültürü plakaları için oyuk başına 1 mL) eklenmiştir.
2. Oda sıcaklığında 1 gün inkübe edin (veya 37 ° C'de 2 saat süreyle). Diseksiyontan 1-2 saat önce, bir pipet kullanarak çözeltiyi çıkarın. Bir kez ddH20 ile yıkayın ve hücre kültür kapağında kurutun.

4. 8 günlük Sprague-Dawley Sıçanlarında Dokuların İşlenmesi.

1. Buz üzerinde 100 mm'lik bir tabak koyun. Sterilize edilmiş bir makas kullanarak sıçan yavrularını çanağın içine koyun.
2. Makasları foramen magnuma sokun ve kafatasının iki yanını kulaklardan gözlere kesin. Bir çift forseps kullanarak kafatasını kaldırın. Bütün beynin kafatasında olduğundan emin olun. Serebellanı ayırın ve bir çift forseps kullanarak yukarıda adı geçen 35 mm'lik tabağa koyun.
3. Bir diseksiyon mikroskopu altında çalışın. İki çift forsepsle meninks ve kan damarlarını çıkartın.
4. Dokuları bir bıçakla kesin. Dokuları tüpe 1 yerleştirin. Oda sıcaklığında ve 1,500 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
5. Süpernatantı aspire. Topağı sakla.
6. Tüp 2'deki çözeltiyi peleğe ilave edin. Nazikçe sallayarak tekrar askıya al.
7. Tüp, 37 ° C'lik bir su banyosuna 15 dakika boyunca yerleştirilir. Her 3 dakikada bir hafifçe sallayın.
8. Bu çözeltiye, tüp 4'teki çözeltiyi ekleyin. Oda sıcaklığında ve 1500 x g'de 5 dakika çalkalayın ve santrifüjleyin.
9. Süpernatantı aspire. Topağı sakla.
10. Peleti tekrar süspansiyon haline getirmek için tüp 3'e çözelti ekleyin.
11. İki adet 15 mL tüp hazırlayın. Hücrelerin yarısını her boruya yerleştirin. Hücreleri homojenleştirmek için pamuk takılı bir Pasteur pipet kullanarak 60-70x'lik bir pipetle aşağı yukarı indirin.
12. Her bir 15 mL'lik tüp içine 3 mL solüsyonu tüp içine ekleyin. RT'de 10 dakika bekletin ve sonra peynirle tıkanan bir Pasteur pipetiyle süpernatanı dikkatle kaldırın. Süpernatantı yeni 15 mL tüplere yerleştirin ve oda sıcaklığında ve 1,500 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
13. birSüpernatantı ısıtın. Topağı sakla.
14. Pelet içine yaklaşık 1.5 x 10 ⁶ hücre / mL (10 yavru için yaklaşık 100 mL) hücre yoğunluğu elde etmek için kültür ortamı ekleyin.
15. Hücreleri kültür plakalarına yerleştirin ve inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 C02'de kültürleyin.

5. Kültür sırasında Ara-C ve D-glikoz ilavesi

1. 24 saat sonra, glial hücrelerin büyümesini inhibe etmek için Ara-C stok solüsyonu (12-iyi hücre kültürü plakaları için 10 uL / ​​iyi veya 6-iyi hücre kültürü plakaları için 20 uL / ​​iyi; son konsantrasyon: 1 mM) ekleyin.
2. 7. günde, nihai konsantrasyon 1 mM olacak şekilde 6 gözenekli hücre kültürü plakaları için 12 oyuklu hücre kültürü plakaları veya oyuk başına 100 mcL için oyuk başına 50 uL D-glikoz stok solüsyonu ilave edin.

6. CGN Kültüründe FDA-PI Çift Boyama ve FDA-PI-Hoechst Üç Boyalı Boyama

1. 20 uL FDA stok solüsyonu ekleyerek FDA-P çalışma solüsyonu hazırlayın (Nihai konsantrasyon: 10 ug / mL) ve 10 mL PBS içinde 50 ul PI stok solüsyonu (nihai konsantrasyon: 50 ug / mL) ilave edildi. Vorteks karıştırın ve buz üzerine yerleştirin.
   1. FDA-PI-Hoechst çalışma solüsyonu için 20 μL FDA stok solüsyonu (son konsantrasyon: 10 μg / mL), 50 μL PI stok solüsyonu (son konsantrasyon: 50 μg / mL) ve 10 μL Hoechst stok solüsyonu (Nihai konsantrasyon: 5 ug / mL) 10 mL PBS içinde. Vorteks karıştırın ve buz üzerine yerleştirin.
      NOT: Kullanmadan önce taze olarak FDA-PI çalışma solüsyonu ve FDA-PI-Hoechst çalışma solüsyonunu hazırlayın.
2. Kuluçka makinesinin hücre kültür plakasını çıkarın. Buza koyun.
3. Kültür ortamını aspire edin ve soğuk PBS ile değiştirin.
   NOT: Çözüm değişikliği yavaş ve dikkatle yapılmalıdır. Pipet ipuçlarıyla hücrelere dokunmaktan kaçının.
4. Soğuk PBS'yi aspire edin ve onu soğuk FDA-PI veya FDA-PI-Hoechst çalışma solüsyonu (500 uL / ​​we12 oyuklu hücre kültürü plakaları için ll veya 6 oyuklu hücre kültürü plakaları için 1 mL / çukur). 5 dakika boyunca buzda bırakın.
5. FDA-PI veya FDA-PI-Hoechst çalışma solüsyonunu aspire edin ve soğuk PBS (12-iyi hücre kültürü plakaları için 100 uL / ​​kuyu veya 6-iyi hücre kültürü plakaları için 50 uL / ​​kuyu) ekleyin.
   NOT: Resim çekerken hücrelerin kurumasına izin verilmemelidir.
6. Floresan mikroskobu kullanarak görüntü çekin. 450 - 490 nm'lik bir geçiş bandına sahip bir uyarım filtresi kullanın. Sırasıyla 520, 620 ve 460 nm'de FDA, PI ve Hoechst için floresans emisyonlarını tespit edin. Aynı koşullar altında floresan mikroskopisinin faz kontrast modunu kullanarak normal ışığın altında bir görüntü alın.
   NOT: FDA-PI veya FDA-PI-Hoechst boyamasından 15 dakika sonra görüntü alın. Pozlama süresi 100-300 ms'dir ve analog kazanç 2.8x'tir.

7. Nöronal canlılığın değerlendirilmesi

1. FDA-PI çift boyama için, filtreleme sonrasında tespit edilen hücrelerin görüntülerinin üzerine bindirinBir grafik düzenleyici yazılımında PI-pozitif katman üzerinde FDA-pozitif katman sürükleyerek farklı floresans filtreleri ile.
   1. "Katmanlar" panelinin "Opaklık" alanına "% 50" yazarak FDA pozitif katmanın opaklığını ayarlayın. "Katman" menüsündeki "Birleştir Görünür" düğmesine tıklayarak iki kat birleştirin. "Resim" altında "Kontrast" alanına "50" girerek kaplama görüntülerinin kontrastını ayarlayın | "Düzeltmeler" | "Parlaklık / Kontrast." Yerpaylaşımı görüntülerinde hiçbir FDA ve PI çift pozitif hücrenin bulunmadığından emin olun.
2. FDA-PI-Hoechst üçlü boyama için, bir grafik düzenleyici yazılımında PI-pozitif katman üzerindeki FDA-pozitif katmanını sürükleyerek, farklı floresans filtrelerini filtreledikten sonra tespit edilen hücrelerin görüntülerini bindirin. "Katmanlar & # 39; ın" Opaklık "alanına"% 50 "girerek FDA pozitif katmanın opaklığını ayarlayın.34; panel.
   1. "Katman" menüsündeki "Birleştir Görünür" düğmesine tıklayarak iki kat birleştirin. Birleştirilen katmandaki Hoechst pozitif katmanını sürükleyin. "Katmanlar" panelinin "Opaklık" alanına "% 50" yazarak Hoechst pozitif katmanın opaklığını ayarlayın. "Katman" menüsündeki "Birleştir Görünür" düğmesine tıklayarak iki katmanı birleştirin.
3. Floresan modda alınan görüntüleri faz kontrast modunda alınanlarla karşılaştırarak CGN'lerden büyük, düzensiz glial hücreleri görsel olarak ayırın - CGN'lerin üç kat daha büyük çaplı hücreler glial hücreler olarak kabul edilir ve hariç tutulmalıdır.
4. Görüntü işleme programında ( örn., ImageJ) hücre sayacı eklentisi kullanarak yaşayan nöronların sayısını ve ölü nöron sayısını ölçün ⁴ .
   1. FDA-PI çift boyama için, küçük FDA pozitif hücrelerini elle işaretleyin.Canlı nöronlar. PI-pozitif hücreleri elle ölü nöron olarak işaretleyin. FDA-PI-Hoechst üçlü boyama için, küçük FDA ve Hoechst-çift pozitif hücreleri, yaşamsal nöron olarak manuel olarak işaretleyin. Elle PI ve Hoechst-çift pozitif hücreleri ölü nöron olarak işaretleyin.
5. Aşağıdaki denklemi kullanarak nöronal canlılığın yüzdesini hesaplayın: Nöronal canlılığın yüzdesi = [yaşayan nöron sayısı / (ölü nöronların sayısı + canlı nöronların sayısı]) x% 100. Her kuyu için, beş rastgele alanı seçin ve ortalama nöronal canlılığın yüzdesini seçin.

Sonuçlar

GAP43 (kırmızı) ve GFAP (yeşil) ikili immün boyama, sırasıyla nöron ve glial hücrelerin şeklini analiz etmek için kullanıldı ^{2 , 5} . CGN kültüründe hem nöronlar hem de glial hücreler bulunur. GFAP pozitif glial hücreler görüntülerdeki oklarla gösterildiği şekilde büyük ve düzensizdir ( Şekil 1 ). Hücre canlılığı için geleneksel tahliller, nöronal canlılığı ölçmek için ku...

Tartışmalar

Bu protokol, daha önce ^{6 , 7'de} açıklanan prosedürlerden değiştirildi. Araştırmacılar in vitro olarak birincil nöronlar kültür ederken koşulları iyileştirerek nöronal olmayan hücre büyümesini azaltmaya çalışmak için zaman harcadılar. Bununla birlikte, gelişmiş kültür koşullarıyla bile, bazı glial hücreler kalır. Ayrıca, nöronal büyüme ve olgunlaşma ile yardımcı oldukları için, primer nöronal kültürlerde n...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100x glutamine	Gibco	25030081
100x antibiotics	Gibco	15240062
Basal Medium Eagle (BME)	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate (FDA)	Sigma	F7378
Propidium Iodide (PI)	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 mL	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 mL	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image processing software	NIH	ImageJ