JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, hücreye nüfuz eden floresan muhabir molekülleri olan canlı yapışık hücrelerde, mitokondriyal membran potansiyeli ve morfolojisinin yanı sıra mitokondriyal morfofonksiyon olarak da adlandırılan, hücre içi ROS seviyelerinin aynı anda ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi iş akışını sunuyor. 5- (ve- 6) -klorometil-2 ', 7'-diklorodihidrofloresan diasetat, asetil ester (CM-H2 DCFDA) ve tetrametilrhodamin metilester (TMRM).

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS) gen ekspresyonu, göç, farklılaşma ve proliferasyon da dahil olmak üzere gerekli hücresel süreçleri düzenler. Bununla birlikte, aşırı ROS seviyeleri, DNA'ya, lipitlere ve proteinlere geri döndürülemez oksidatif hasar eşlik eden bir oksidatif stres oluşturur. Böylece, ROS'un nicelendirilmesi, hücresel sağlık durumu için doğrudan bir vekil sağlar. Mitokondri, ROS'un başlıca hücresel kaynakları ve hedefleri arasında yer aldığından, patofizyolojik koşullarda arabağlantıyı daha iyi anlamak için aynı hücrelerde mitokondriyal fonksiyon ve ROS üretiminin ortak analizi önemlidir. Bu nedenle, hücre içi ROS seviyelerinin, mitokondriyal membran potansiyelinin (ΔΨ m ) ve mitokondriyal morfolojinin eşzamanlı olarak nicelendirilmesi için yüksek içerikli mikroskopi tabanlı bir strateji geliştirildi. Çok yönlü plakalarda yetiştirilen, yaşayan adherent hücrelerin otomatik geniş alan floresan mikroskobu ve görüntü analizine dayanıyor ve staineD hücreye geçirgen flüoresan haberci molekülleri CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (ΔΨ m ve mitokondriyal morfoloji) ile karşılaştırıldı. Florimetri veya akış-sitometri aksine, bu strateji hem deneysel uyarı öncesi hem de sonrasında, yüksek spatiotemporal çözünürlük ile tek tek hücre seviyesinde subselüler parametrelerin miktarının belirlenmesine izin verir. Önemlisi, yöntemin görüntü temelli doğası, sinyal yoğunluğuna ek olarak morfolojik parametrelerin çıkarılmasına izin verir. Kombine özellik kümesi, alt popülasyonlar, hücre türleri ve / veya tedavileri arasındaki farkları saptamak için araştırma ve istatistiksel çok değişkenli veri analizi için kullanılır. Burada, kimyasal pertürbasyon sonrasında hücresel durumlar arasındaki belirgin ayrımcılık potansiyelini kanıtlayan bir deney deneyiyle birlikte, deneyin ayrıntılı bir tarifi verilmektedir.

Giriş

Hücre içi ROS konsantrasyonu, ROS üreten ve ROS sıyırma sistemleri arasındaki dinamik bir etkileşim vasıtasıyla titizlikle düzenlenir. İkisi arasındaki dengesizlik, oksidatif stres durumunu kışkırtır. ROS'un ana kaynakları arasında mitokondri 1 bulunur . Hücresel solunumda rolleri göz önüne alındığında, hücre içi süperoksit (O 2 • - ) moleküllerinden 2 sorumludurlar. Bu, çoğunlukla elektron nakil zincirinin 1 kompleksinde elektron kaçağından kuvvetli negatif iç mitokondriyal zar potansiyeli (Δψ m ) koşulları, yani mitokondriyal hiperpolarizasyon sonucu ortaya çıkar. Öte yandan, mitokondriyal depolarizasyon, artmış ROS üretimi ile birden fazla etki moduna işaret eden 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 . Ayrıca, fizyon-füzyon mekanizmalarının proteinlerindeki redoks değişiklikleri ile ROS, mitokondriyal morfolojiyi birlikte düzenlemektedir 9.Farklı mitokondriyum, artmış ROS üretimi ve apoptoz ile korelasyon gösterirken, ipliksi mitokondri, besin yetersizliği ve korunma ile bağlantılıdır Mitofaji 12 . Hücresel ROS ile mitokondriyal morfofonksiyon arasındaki karmaşık ilişki göz önüne alındığında, ikisi de ideal olarak canlı hücrelerde nicelenmesi gerekir. Tam olarak bunu yapmak için, CM-H2 DCFDA (ROS) ve TMRM (mitokondriyal Δψ m ve morfoloji) floresan probları ile lekelenmiş yapışık hücre kültürlerinin otomatik geniş alan mikroskopisi ve görüntü analizine dayanılarak yüksek içerikli bir görüntüleme testi geliştirildi. Yüksek içerikli görüntüleme, sp'ninÇoklu tamamlayıcı işaretleyiciler ve otomatikleştirilmiş görüntü analizi kullanan hücresel fenotipler hakkında atiotemporal bakımdan zengin ( yani çok sayıda açıklayıcı özellik) bilgi. Otomatik mikroskop ile kombine edildiğinde, birçok numune paralel olarak taranabilir ( yani yüksek verimlilik), böylece tahlilin istatistiksel gücünü artırabilir. Aslında, protokolün temel bir öğesi, aynı hücredeki birden çok parametrenin aynı anda sayısallaştırılmasına ve çok sayıdaki hücre ve koşullara göre ayarlanmasına olanak sağlamasıdır.

Protokol 8 bölüme ayrılmıştır (aşağıdaki protokolde ayrıntılı olarak açıklanmıştır): 1) 96 oyuklu plakada hücrelerin tohumlanması; 2) Stok solüsyonlarının, çalışma solüsyonlarının ve görüntü tamponunun hazırlanması; 3) Mikroskop kurulumu; 4) CM-H 2 DCFDA ve TMRM ile hücrelerin yüklenmesi; 5) Bazal ROS düzeylerini ve mitokondriyal morfofonksiyonu ölçmek için ilk canlı görüntüleme yuvarlaklığı; 6) tert -butil ilavesinden sonra ikinci canlı görüntüleme turuIndüklenen ROS düzeylerini ölçmek için peroksit (TBHP); 7) Otomatik görüntü analizi; 8) Veri Analizi, Kalite Kontrolü ve Görselleştirme.

Test orijinal olarak normal insan dermal fibroblastları (NHDF) için geliştirildi. Bu hücreler geniş ve düz olduğundan, 2B geniş alanlı görüntülerde 13 , 14 mitokondriyal morfolojiyi değerlendirmek için çok uygundurlar. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle bu yöntem, diğer yapışık hücre tipleri için de geçerlidir. Üstelik, CM-H2 DCFDA ve TMRM'nin kombinasyonunun yanında, iş akışı farklı moleküler özgüllükleri olan 1 , 15'e sahip çeşitli floresan boya çiftlerine uygundur.

Protokol

Aşağıdaki protokol, NHDF hücreleri için ve materyal dosyasında belirtilen çoklu plakalar kullanılarak gerçekleştirildi. İş akışına genel bir bakış için Şekil 1'e bakın.

1. Reaktiflerin Hazırlanması

  1. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)% 10 v / v Fetal Sığır Serumu (FBS) ve 100 IU / mL penisilin ve 100 IU / mL streptomisin (PS) ile takviye ederek komple ortam hazırlayın. 500 mL komple ortam için, 445 mL DMEM'ye 50 mL FBS ve 5 mL PS ilave edin.
  2. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini (magnezyum ve kalsiyum ile, fakat fenol kırmızısı olmadan) 20 mM HEPES ile takviye ederek HBSS-HEPES (HH) görüntüleme tamponunu hazırlayın. 500 mL HH için, 490 mL HBSS'ye 10 mL 1M HEPES stok solüsyonu ekleyin. PH değerini teyit edin ve gerektiğinde pH 7.2 değerine ayarlayın.
  3. CM0H2 DCFDA liyofilize edilmiş tozun 50 ug'sini 86.5 ° C'de çözündürerek 1 mM CM-H2 DCFDA stok solüsyonu hazırlayın.# 181; L susuz DMSO. Vorteksleme veya pipetleme ile karıştırın ve kahverengi mikrosantrifüj tüplerinde 20 μL alikotlar yapın. -20 ° C'de karanlıkta saklayın ve 1 hafta içinde kullanın. N2 ortamında depolanırsa raf ömrü en az 1 ay artabilir.
    1. 25 mM TMRM tozunu 50 mL susuz DMSO'ya eriterek 1 mM TMRM stok solüsyonu hazırlayın. Vorteksleme veya pipetleme ile karıĢtırın ve kahverengi mikrosantrifüj tüplerinde 10 μL alikotlar yapın. -20 ° C'de karanlıkta saklayın. Bu çözüm en az bir yıl istikrarlıdır.
  4. % 70 stok çözeltisinden (10 uL / ​​96 oyuklu plaka) doğrudan bir miktar pipetleyerek her deney için Tert -bütil peroksit stokunun (~ 7 M) taze bir bölüm hazırlayın. Daha sonra kullanana kadar bu alikuotu 4 ° C'de tutun.
  5. Antikor çalışma çözeltisini (AB), iki ikincil antikoru (Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşanı ve CY3 eşek tavşanı) 1 kez, 1x HH-Bu'da 1,000 kez seyrelterek hazırlayınffer.

2. Mikroskop ve Alıcı Protokolün Kurulumu (± 15 dakika)

NOT: Görüntü elde etme işlemi, otomatik bir sahne ve panjurlarla donatılmış geniş alanlı bir mikroskop ile ve 20X hava Planlı düzeltilmiş objektif (NA = 0.75) ve EM-CCD kamera kullanan, donanıma dayalı bir otofokus sistemi ile gerçekleştirilir. Deneyi ilk kez kurarken, protokolün talimatlarına göre lekelenmiş kontrol hücreleri içeren bir test plakası, XY aşamasını kalibre etmek ve edinme ayarlarını optimize etmek için kullanılır. Kazanç ayarları önceden belirlenmişse, kalibrasyon boş bir plaka kullanılarak yapılabilir.

  1. Amacı mutlak taban seviyesine indirin ve yazılım talimatlarını izleyen XY aşamasını kalibre edin.
  2. Doğru filtre küplerinin takıldığından emin olun. CM-H 2 DCFDA'yı görselleştirmek için, 472/30 nm uyarma bant geçiren filtre, 495 nm'lik kesme dikrolu standart bir GFP filtre küveti kullanınBuz aynası ve 520/35 nm bant geçiren emisyon filtresi. TMRM için, 540/25 nm bant geçiren uyarılma filtresi, 565 nm'lik kesme dikroik ayna ve 605/55 nm bant geçiş emisyon filtresi ile TRITC için bir filtre küpü kullanın.
  3. Edinme yazılımını kullanarak bir görüntüleme protokolü oluşturun.
    1. Yazılım içinde bulunan mevcut plakalar listesinden doğru tipte çoklu plakayı seçin (üretici ve kod). Alternatif olarak plakalar ve kuyu boyutları kullanarak kendi çok plakalı tabla biçiminizi tanımlayın.
    2. Kuyu plakasını yazılımın talimatlarına uygun olarak, örneğin dört dış köşe kuyusunun iki köşesini tanımlayarak hizalayın. Bu adım fotoğraf makinesi yönü varyasyonlarını kapsar.
    3. Edinilmesi gereken kuyuları seçin. Bu seçenek yazılımda mevcut değilse, seçilen kuyulara karşılık gelen manuel olarak tanımlanmış bir XY-lokasyonları seti kullanın.
    4. Alım ayarlarını (pozlama süresi, lamba yoğunluğu, EM kazancı) optimize edin.İki kanalı ayrı olarak test plakasını kullanın. Floresans uyarma ışığının kendisinin ROS'u uyarmasıyla pozlama ve yoğunluğu en aza indirin. Ancak, sinyalin arka plan oranına, TBHP tedavisinden önce bazal CM-H 2 DCFDA ve TMRM için en az 2 olduğundan ve TBHP tedavisinden sonra doygunluğun olmadığından emin olun. Edinim ayarları büyük oranda kullanılan mikroskopi kurulumuna ve hücre türüne bağlıdır ancak referans olarak, ışık kaynağı olarak 130 W metal halid ampulünü ve protokolün talimatlarına göre boyanan NHDF hücrelerini kullanırken gösterge ayarları aşağıdaki gibidir: her iki CM- H 2 DCFDA ve TMRM, sırasıyla 15 (13 MHz; 14-bit) ve 4 (27 MHz; 14-bit) EM kazancı ile kombine edilen 200 ms'lik bir maruz kalma süresi ve ND filtre 8 kullanılmıştır. Belirli bir kurulum ve hücre türü için optimize edildiğinde, bu adım atlanabilir.
      NOT: edinme ayarlarının tüm görüntüleme işlemi boyunca aynı tutulması esastır. Büyük ölçekli, çok günlük deneyler için, lamba staBilitelik, düzenli kalite kontrolü ile garanti altına alınmalıdır.
    5. Ardışık bir lambda (dalga boyu) edinimi içeren bir edinim protokolü tanımlayın. Ölçümden önce ışık maruziyetini en aza indirgemek için, ilk önce edinilecek CM-H2 DCFDA kanalını seçin.
    6. 2.3.4'te tanımlanan edinim protokolünü kullanarak kuyu seçiminin her bir kuyusunun ortasına yerleştirilmiş düzenli olarak aralıklı, örtüşmeyen 4 adet görüntü elde etmek için iyi plakalı bir halkayı tanımlayın. Kayıplı görüntü toplama, yani soldan sağa , önce B02'den B11'e, sonra geri sağdan sola, C11'den C02 ye kadar ( şekil 2A ) seçin. Bu, soldan sağa resim edinme ile karşılaştırıldığında zamandan kazandırır. Bu seçenek yazılımda mevcut değilse, 2.3.3'te oluşturulan XY konumlarının özel setini bu görüntüleme modelini alacak şekilde ayarlayın.
    7. Yeniden gözden geçirme imkânı sağlamak için, görüntüleme konumlarının XY koordinatlarını kaydedin ( örn . Ayrı bir xml dosyası)Mikroskop yeniden kalibre edilmesi durumunda. Bu tahlilin okuması, aynı hücreler için bir post-hoc immünofloresan (IF) boyama ile korele edilmesi gerekiyorsa, bu özellikle önemlidir.

3 . 96-yuvalı bir plakada tohumlanan hücreler (45 - 90 dk, Farklı Hücre Hatlarının Sayısına Göre)

  1. Sınıf 2 biyogüvenlik kabini gibi steril ortamda çalışın ve eldiven giyin.
  2. Damıtılmış su içinde% 70 v / v etanol kullanarak tüm yüzeyleri ve malzemeleri temizleyin.
  3. İnkübatörden% 90 birleşmiş hücre kültürü bulunan bir hücre kültürü balonu alın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
  4. Hücreleri PBS 1x ile iki kez yıkayın.
  5. Hücrelere,% 0.05'lik tripsin-EDTA çözeltisinin uygun miktarını ekleyin, komple hücre yüzeyinin kaplandığından emin olun ( örneğin , bir T25 şişesi için 1 mL) ve 37 ° C'de ve% 5 C02'de 2 dakika inkübe edin.
  6. Tüm hücreler ayrılırsa (mikroskopta kontrol edin) ), Tripsin-EDTA çözeltisini inaktive etmek için kültür ortamı (DMEM +% 10 FBS +% 1 penisilin-streptomisin; T25 şişesi içinde ± 4 mL) ilave edin.
  7. Oda sıcaklığında 300 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  8. Süpernatantı atın ve hücre peletini kültür ortamında tekrar süspanse edin. Hücre sayımı ile uyumlu bir hücre konsantrasyonu elde etmek için her hücre türü için ortam miktarını belirleyin. Tipik olarak,% 90 konfluent T25 NHDF şişesi yaklaşık 1-1.5 milyon hücre içerir, bunlar 3-4 mL kültür ortamında yeniden askıya alınır.
  9. Bir hücre sayma odası veya Coulter sayacı kullanarak hücreleri sayın.
  10. İnce 60'lık bir plakanın iç 60 kuyusunun her birinde, ince sürekli polistiren veya cam altlı (görüntü sırasında bitişik kuyular arasında dağılma ve çapraz konuşmayı önlemek için siyah) 8000-10.000 hücre tohumlandı. Farklı koşullar / işlemler / hücre hatları kullanırken, plak etkilerini en aza indirgemek için tohumlama yerlerini homojen bir şekilde plakaya dağıtın (Incir "> Şekil 2A) B01 ve A01 kuyularının dışındaki dış kuyular, kenar efektlerine daha yatkın oldukları için kullanılmazlar.
  11. B01'de 8000-10.000 hücre tohumlandı. Bu kuyu, görüntü elde etmeden hemen önce odağı ayarlamak için kullanılacaktır.
  12. Kuyu ve çevre arasındaki gradyanlar (sıcaklık, nem, vb. ) En aza indirgemek için boş olan dış kuyuları ortamla doldurun.
  13. Hücrelerin yamalardan büyümesini önlemek için inkübatöre tekrar koymadan önce plakaya hafifçe dokunun.
  14. Hücreleri 24 saat boyunca veya yaklaşık birleşik bir dereceye kadar kültürleyin. % 70.
  15. Deneyin tedavi bilgilerini "Setup.xlsx" adlı bir e-tabloya kaydedin. Dosya dört sütun içermelidir ve veri analizi sırasında tedavileri kuyularla ve görüntü bilgileriyle bağlantılandırmak için kullanılacaktır. Dört sütun şunlardır: 'İyi', 'Tedavi Numarası', 'Tedavi' ve 'Kontrol' (her kuyu için bir sıra). Her tedavi birleştiğindeArsaların X ekseni üzerindeki işlemlerin sırasını belirlemek için veri görselleştirme sırasında kullanılan benzersiz bir tedavi numarası ile. Kontrol sütunu, geçerli sıradaki muamele için kontrol olarak işlev gören tedaviyi belirtir. Tipik bir deneysel düzenin ve buna karşılık gelen kurulum dosyalarının örnekleri Şekil 2'de gösterilmektedir.

4. CM-H 2 DCFDA ve TMRM ile Hücrelerin Yüklenmesi (± 45 dakika)

NOT: Deney günü hücrelerin tutulması steril bir ortamda (biyogüvenlik kabini) yapılabilir, ancak hücreler atılacak veya doğrudan test sonrasında sabitleneceğinden, bu zorunlu değildir.

  1. HH tamponunu 37 ° C'ye ısıtın.
  2. 1 mM stok solüsyonunu HH tamponu içinde 50 kez seyrelterek 20 μM TMRM çalışma solüsyonu hazırlayın (1 mıkron 10 μL TMRM stok solüsyonuna 490 μL HH tamponu ilave edin).
  3. Yük hazırla2 μM CM-H 2 DCFDA ve 100 nM TMRM içeren bir solüsyon. Bu amaçla, 1 mM CM-H2 DCFDA stok solüsyonu 500x ve 20 μM TMRM çalışma solüsyonu 200x HH tamponu içinde seyreltin.
    1. Tipik olarak, 60 kuyucuk için, 75 mL yükleme solüsyonu hazırlayın; bu hacim, 7447.5 μL HH'ye 15 μL CM-H 2 DCFDA ve 37.5 μL TMRM solüsyonu ilave ederek hazırlanır.
  4. Kültür ortamını plakaları ters çevirerek tek bir sıvı hareketi ile hücrelerden atın.
  5. Çok kanallı bir pipet (100 uL / ​​çukur) kullanarak HH tamponu ile hücreleri hafifçe iki kez yıkayın. Tek bir akışkan hareketle plakayı ters çevirerek HH tamponunu yıkama adımları arasına atın.
  6. Çok kanallı bir pipet kullanarak tekrar her bir oyuğa 100 μL yükleme çözeltisi ekleyerek hücreleri CM-H 2 DCFDA ve TMRM ile yükleyin. Karanlıkta, oda sıcaklığında 25 dakika inkübe edin. Unutmayın B01.
  7. Bu 25 dakika boyunca, oksidan TBHP'nin çalışma solüsyonlarını hazırlayın ve mikroskop ve aksesuar donanımının açık olduğundan emin olun.
    1. Çalışma solüsyonunu hazırlayın I: 7M stok solüsyonunu 70x 100 mM'ye seyreltin (690 μL HH tamponu içinde 10 μL stok).
    2. Çalışma solüsyonu II hazırlayın: WS I 100x'i 1 mM'ye seyreltin (990 μL HH tamponunda 10 μL WS I).
    3. Çalışma solüsyonu III hazırlayın: WS III 25x'i 40 μM'ye seyreltin (60 kuyu için 7200 μL HH tamponda 300 μL WS II ekleyin).
  8. 25 dakika sonra hücreleri, daha önce tarif edildiği gibi iki kez 100 uL HH tamponu ile yıkayın.
  9. 60 iç çukura 100 μL HH tamponu ekleyin.

5. Bazal ROS Düzeyleri ve Mitokondriyal Morfonksiyonu Ölçmek için İlk Canlı Görüntüleme Turu (± 15 dakika)

  1. Satın alma yazılımının çalışır durumda olduğundan ve görüntüleme protokolünün yüklendiğinden emin olun.
  2. Mikroskopta plakayı takın, donanımı açınSed otofokus sistemini kullanın ve TM01M kanalını kullanarak otofokus ofsetini ayarlamak için iyi B01 kullanın. Bu prosedür, CM-H2 DCFDA sinyal yoğunluğunda bir artış meydana getirdiğinden, bu kuyruk, aşağı akış görüntü analizinden çıkarılır.
  3. Görüntüleme protokolünü çalıştırın.

6. İndüklenen ROS Seviyelerini Ölçmek İçin TBHP Eklenmesinden Sonra İkinci Canlı Görüntüleme Yuvarlak (± 20 dakika)

  1. Mikroskoptan dikkatlice 96 oyuklu plakayı çıkarın.
  2. Çok kanallı bir pipet kullanarak her göze 100 μL TBHP WS III (40 μM) ekleyin (Kuyularda 20 μM TBHP konsantrasyonu elde edilir). Bu bileşik, indüklenen ROS düzeylerini ölçmek için bir araç olduğu kadar CM-H2 DCFDA boyamasında (sinyalin yükselmesi için) dahili pozitif bir kontrol olarak kullanılır.
    NOT: H 2 O 2 , TBHP yerine de kullanılabilir, ancak bu bileşik daha az kararlıdır ve bu nedenle daha az güvenilirdir.
  3. TBHP'nin tamamen reaksiyona girmesine izin vermek için en az 3 dakika bekleyin wIkincisi CM-H 2 DCFDA.
  4. Bu süre zarfında, iyi A01'e 100 μL antikor çalışma solüsyonu (1 / 1,000) ekleyin.
  5. Plakayı mikroskop üzerine geri monte edin ve yeniden B01 odak noktasını kullanarak odağı kontrol edin.
  6. Aynı görüntüleme protokolünü kullanarak ilk görüntüleme turunda olduğu gibi aynı konumları elde edin.
  7. Edindiğiniz veri kümelerini tek bir tiff dosyası olarak, altına ayılarla ayrılmış plakaya, TBHP öncesi veya sonrası tretmanlara, kuyuya, kanala ve kanaldan referans alan standart terminolojiyi kullanarak tek tek tiff dosyaları olarak dışa aktarın. Plaka 1, TBHP öncesi işlem, iyi B02, alan 1 ve kanal 1 için 'P01_Pre_B02_0001_C1'. Bu bilgi, görüntü analizinde ( örneğin , uygun segmentasyon ayarlarını seçmek için) ve veri analizi sırasında (analiz verilerini bağlamak için kullanılır Doğru tedaviler ile).
  8. Alım protokolünü kullanarak A01 kuyusunun ortasındaki dört konumda her iki kanal için düz alan görüntüleri elde edin. Inci kaydedinAşağıdaki standart terminolojiyi kullanarak diğer görüntülerle aynı klasöre bireysel tiff dosyaları olarak girin: '1 no'lu plaka 1, alan 1 ve kanal 1 için' P01_FF_A01_0001_C1 '. Sinyallerin dinamik aralıkta olduğundan emin olun; Doygunluk durumunda, daha düşük konsantrasyonda bir antikor çalışma solüsyonu kullanın.
  9. Plakayı atın veya ileri işlem için kaydedin.
    NOT: Plakayı mikroskoptan çıkarmak yerine, TBHP çözümünü eklemek için çok kanallı bir pipet kullanarak, otomatikleştirilmiş bir pipet mikroskop sahnesine yerleştirilebilir ve bir tetikleyerek işlev görecek şekilde satın alma yazılımı ile bağlantı kurabilir. Bu, bir sonraki kuyuya geçmeden önce, TBHP'yi ilk kazanımdan hemen sonra her kuyuya eklemeye izin verir. Bu şekilde, ilk görüntüleme turu tamamlandığında ikincisi hemen başlayabilir ve tüm kuyular TBHP ile eşit bir inkübasyon süresine sahip olacaklardır.

7. Görüntü İşleme ve Analiz (± 30 dakika / per96 gözlü plaka)

NOT: Tüm görüntü işleme FIJI (http://fiji.sc), ImageJ freeware paketlenmiş bir sürümünde yapılır. Hücre içi ROS ve mitokondriyal sinyaller ile morfolojik parametrelerin otomatik olarak analizi için özel bir senaryo yazılmıştır (RedoxMetrics.ijm, istek üzerine temin edilebilir). Altta yatan algoritmalar Sieprath ve ark. 1 .

  1. FIJI'nın kurulu ve çalışır durumda olduğundan emin olun.
  2. FIJI'yi başlatın ve makro setini yükleyin (Eklentiler -> Makrolar -> Yükle ...). Bu, Şekil 3A'da gösterildiği gibi, analiz ayarlarını optimize etmek için birkaç yeni makro komutunun yanı sıra bir dizi eylem aracını da çağıracaktır .
  3. 'S' düğmesine tıklayarak analiz ayarlarını yapmak için kurulum arayüzünü açın ( Şekil 3B ).
    1. Görüntü türünü, kanal sayısını ve kullanılan kuyuyu seçinDüz görüntü elde etmek için.
    2. Hangi kanalın hücreleri (CM-H2 DCFDA kanalı) veya mitokondri (TMRM-kanalı) içerdiğini belirtin ve görüntü kalitesine bağlı olarak her kanal için ön işleme ve segmentasyon parametrelerini ayarlayın ( Şekil 3B ). Sırasıyla arka plan çıkarma veya kontrastlı sınırlı uyarlanabilir histogram eşitleme 16 gerçekleştirmek için 'Arka Plan' ve 'Kontrast' onay kutularını işaretleyin. Hücrelerin Gauss bulanıklaştırılması ve mitokondriyanın Laplace geliştirilmesi için bir sigma tanımlayın. Otomatik bir eşikleme algoritması seçin ve boyut hariç tutma sınırlarını (piksel cinsinden) doldurun. Otomatik eşikleme algoritması yerine sabit bir eşik seçilirse üst eşik değerini girin.
    3. Elde edilen veri kümelerinin seçilen birkaç görüntüsündeki segmentasyon ayarlarını açarak ve sırasıyla hücre veya mitokondriyal segmentasyon için menüde 'C' veya 'M' düğmelerini tıklatarak test edin,Ve gerekirse ayarları yapın. Örnek bir sonuç Şekil 3C'de gösterilmektedir .
  4. Parti analizini, '#' düğmesini tıklayıp resimlerin bulunduğu klasörü seçerek, ilgili klasör (ler) üzerinde çalıştırın. Her klasör için, görüntü başına ayrı ROI setleri (zip dosyaları) ve sonuç dosyaları (.txt) içeren yeni bir 'Çıktı' dizini üretecektir. Her iki kanal için sonuç dosyaları yoğunluk ve morfolojik tanımlayıcılar içeriyor. CM-H 2 DCFDA kanalı (hücreleri) sonuç dosyası, bir resim içindeki toplam ROI'lerin ortalama değerini tanımlayıcı başına içerir. TMRM kanalı için sonuçlar dosyası, her ayrı ayrı bölünmüş mitokondriyal ROI için tanımlayıcı başına bir değer içerir.
  5. Toplu analizden sonra, 'V' düğmesine tıklayarak tüm ROI yer paylaşımı ile tüm görüntülerin bir hiper istifi olan bir 'Doğrulama yığıtı' üzerindeki segmentasyon performansını görsel olarak doğrulayın. Bu yolla, aşırı-/ Alt bölümleme, odak görüntüler dışında veya toz parçacıkları / görüntülerde bulunan lifler önceden hızlı bir şekilde fark edilebilir. Daha fazla kürasyon, veri kalitesi kontrolü sırasında yapılabilir (§8).

8. Veri Analizi, Kalite Kontrol (QC) ve Görselleştirme

Ham verilerin işlenmesi ve analizi, R statistik freeware (http://www.rproject.org - version 3.3.2) ve RStudio (http://www.rstudio.com/ - version 1.0.44) kullanılarak yapılır. Sonuçları çabucak elde etmek ve görselleştirmek için, sıcaklık haritaları ve kutu çizgelerindeki verileri bütünleştiren ve görselleştiren ve aynı zamanda istatistiksel analizler gerçekleştiren sezgisel bir Shiny uygulaması 17 (istek üzerine temin edilebilir) tasarlanmıştır. Genel olarak, iş akışı iki ardışık adımdan oluşur. İlk olarak, veriler anormal veri noktalarını algılamak için 96 gözlü plaka başına işlenir ve denetlenir. İkinci olarak, belirli bir deneyin tüm plakalarından seçilmiş veriler birleştirildi ve non-parametrik çokluDeğişken testler 18 ve bir ana bileşen analizi.

  1. R ve RStudio'nun kurulu ve çalışır durumda olduğundan emin olun.
  2. RStudio'yu başlatın.
  3. RedoxMetrics parlak uygulamasını açın ve uygulamayı çalıştırın (harici bir tarayıcıda çalıştırmayı seçin).
  4. 'Girdi' sayfasında, RedoxMetrics.ijm dosyasındaki sonuç dosyalarının bulunduğu dizini seçin.
  5. 'Setup.xlsx' (adım 3.15'de oluşturulmuş) dizininin de bu dizinde bulunduğundan emin olun.
  6. Sonuç dosyaları ve kurulum bilgileri otomatik olarak içe aktarılır, yeniden düzenlenir ve görselleştirilir.
    1. 'Deneysel kurulum' sayfası deneyin düzenini gösterir. Doğrulama için bu sayfayı kullanın.
    2. Bir sonraki sayfada 'levha başına sonuçlar', renk kodlu çoklu kuyu plakası düzeninde ve iyi isim ve resim numarasıyla etiketlenmiş aykırı değerlere sahip kutu çizimlerinde, her plakanın verilerini ayrı ayrı gösterir. Sonuncusu, kolay denetim ve identAnormal veri noktalarının belirtileri (belirli bir muamele için ölçülen ortalama değerlerle karşılaştırıldığında aşırı yüksek veya düşük değerler - örnek için Şekil 4'e bakın).
      Bu bilgileri kullanarak, anormal noktalara karşılık gelen görüntüleri doğrulayın. Anormallikler tespit edilirse, analizden çıkarılması gerekir. Çoğu anormallik, görüntünün (kısmi) odağın dışına çıktığında veya yüksek flüoresan toz parçacıklarının düzgün bölünmeyi bozması durumunda yanlış segmentasyon nedeniyle oluşur. Aşırı durumlarda, doğrulama yığın aracını kullanarak hızlı bir şekilde lekelenebilir (adım 7.5), ancak bu aşamada daha ufak olaylar keşfedilmiştir. Anormal değer için belirgin veya teknik bir neden bulunamadığında, görüntü analizden kaldırılmamalıdır.
    3. İsteğe bağlı: 'Bırak' adı verilen yalnızca bir sütun içeren 'Drop.xlsx' adlı yeni bir e-tablo oluşturun. Bu sütunda, tüm görüntülerin dosya adlarını (".tif" uzantısı dahil) listeleyin(Adım 7.5 veya adım 8.6.2'de tanımlanan) analizden kaldırılması gerekenler. Bu dosyayı 'giriş' sayfasını kullanarak yükleyin.
    4. 'Sonuçların tamamı deneyi' sayfası birleştirilen tüm tabakalardan alınan sonuçları gösterir. Bir açılan dosya yüklendiyse, bu dosya belirtilen veri noktalarını analizden kaldırmak için kullanılır.
      Her bir parametre için ayrı ayrı veriler, ilgili kontrollerine göre plaka başına normalleştirilir. Daha sonra, tüm plakalardan elde edilen veriler birleştirilir, ardından nparcomp paketi 18'den parametrik olmayan çok değişkenli testler yapılır. Sadece 2 tedavi karşılaştırıldığında parametrik olmayan Behrens-Fisher problemi için iki numune testi yapılır. 2'den fazla tedavi için non-parametrik kontrastlı çoklu karşılaştırma testi kullanılır. Sonuçlar, kutu çizimleri kullanılarak görselleştirilir.
    5. 'Küme analizi' sayfası bir ana bileşen analizi (PCA - R çekirdek 'istatistikler' paketi) sonuçlarını gösterir. 5 parametreden veri (baSal ve indüklenen ROS ve mitokondriyal zar potansiyeli, boyut ve dairesellik), farklı tedavileri duyarlı bir redoks profiline dayalı olarak ayırt etmek için birleştirilir. Bu amaçla ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirilir (R core 'stats' paketi). Sonuçlar biplot (ggbiplot paketi - http://github.com/vqv/ggbiplot) kullanılarak görselleştirilir.
    6. İşlenmiş ve yeniden düzenlenmiş verileri içeren arka uç veri çerçevelerini indirmek için 'veri indir' sayfasını kullanın; böylece daha gelişmiş veri görselleştirme veya istatistiksel analizler için yeniden kullanılabilirler.
      NOT: Tipik tuzaklar ve olası çözümler Tablo 1'de listelenmiştir.

Sonuçlar

Deney, çeşitli kontrol deneyleri kullanılarak kıyaslandı; bunların sonuçları Sieprath ve diğ. 1 . Kısacası, CM-H2 DCFDA ve TMRM'nin , sırasıyla , hücre içi ROS ve Δψ m'deki dışa bağımlı değişmelere karşı flüoresan yanıtı, dinamik aralığı belirlemek için nicelendirildi. CM-H 2 DCFDA için NHDF, 10 uM ila 160 uM aralığında artan TBHP konsantrasyonları ile tedavi edildiğinde flüo...

Tartışmalar

Bu yazıda, NHDF'de hücre içi ROS düzeyleri ve mitokondriyal morfofonksiyonun eşzamanlı olarak ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. SQV ile tedavi edilen NHDF üzerine bir vaka çalışmasıyla performansı gösterildi. Sonuçlar, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , <...

Açıklamalar

Yazarlar, yarışan finansal çıkarların veya başka çıkar çatışmasının olmadığını belirtiyorlar. İlgili yazar aynı zamanda tüm yazarlardan herhangi bir çıkar çatışmasını ifşa etmesini istemektedir.

Teşekkürler

This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)ThermoFisher ScientificT668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)ThermoFisher ScientificC6827
Dimethyl sulfoxideSigma)AldrichD8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass LiddedBrooks life science systemsMGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mLLonzaBE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamineLonzaBE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and MgLonzaBE17-516F
HEPES 1 M 500 mLLonza17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) SolutionLonzaBE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson711-166-152Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson711-546-152Antibody used for acquiring flat-field image
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscopeNikon
Perfect Focus System (PFS)Nikonhardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objectiveNikon
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS moduleNikonThis software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44Rstudio
R version 3.3.2

Referanslar

  1. Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
  3. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
  4. Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
  5. Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
  6. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
  7. Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
  8. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  9. Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
  10. Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
  11. Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
  12. Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
  13. Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
  14. Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
  15. Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
  16. Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
  17. Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
  18. Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
  19. Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
  20. Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
  21. Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
  22. Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
  23. Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
  24. Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
  25. Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
  26. Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
  27. . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
  28. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  29. Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
  30. Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
  31. Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
  32. Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
  33. Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
  34. Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
  35. Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
  36. Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
  37. Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
  38. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiSay 123Reaktif Oksijen T rleriMitokondriMitokondrial MorfofonksiyonCanl H cre G r nt lemeY ksek erikli MikroskopiFloresan MikroskopiNicel ok Parametrik MikroskopiRedoks Biyolojisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır