JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, hoşgörü Ekiminde teşvik ve içinde in vitro ve in vivo değerlendirmek için bir protokol farklı hücre alt kümeleri alıcıdan gelen süpresif kapasitesi ve donör veya eksojen antijenleri doğru alıcının bağışıklık durumu mevcut.

Özet

Ana endişe Ekiminde indüksiyon düzenleyici hücre aracılığıyla belirli tolerans ulaşmaktır. Dayanıklılık mekanizmaları güvenilir modelleri gerektirir. Burada, costimulation sinyalleri abluka veya gen transferi yoluyla immunoregulatory moleküllerinin upregulation indüklenen sıçan, kardiyak homogreft tolerans modelleri açıklar. Bu modellerin her düzenleyici T hücreleri (Tregs), düzenleyici B hücreleri (Bregs) veya düzenleyici myeloid hücrelerin (RegMCs) gibi düzenleyici hücreleri nesil vivo içinde izin. Bu makale, biz tanımlamak ve kendi sorumluluk tolerans indüksiyon ve bakım. belirlemek için vitro ve in vivo düzenleyici hücre etkinliği tanımlamak için kullanılan iki tamamlayıcı protokol tarif İlk olarak, vitro süpresif tahlil hücre hızlı kimlik efektör bağışıklık yanıtı üzerinde süpresif kapasiteli bir doz bağımlı şekilde izin ve sitokin ölçüm ve sitotoksisite gibi daha fazla çözümleme için kullanılabilir. İkinci olarak, hücreleri yeni radyasyonlu aşılı alıcıya, evlat edinen transferi hoşgörülü arıtılmış alıcıdan gelen vurgulanmış yönetmen graft bağışıklık yanıtı kontrol ve/veya dönüştürme yeni düzenleyici hücre (Bu hücreler tolerogenic özellikleri bulaşıcı tolerans olarak adlandırdığı tabaka). Bu yöntem bilinen fenotipik işaretçileri olan hücrelere sınırlı değildir ve herhangi bir hücre popülasyona uzatılabilir. Ayrıca, donör allospecificity düzenleyici hücre (alanında önemli bir hedefi) üçüncü donör hücreleri kullanarak tespit edilebilir veya içinde vitro veya vivo içindegrefti yönlendirilmiş. Son olarak, düzenleyici bu hücreleri belirli tolerogenic kapasitesini belirlemek için biz humoral Anti-donör antikor yanıt ve yeni veya eski bilinen antijenlere karşı humoral yanıt-e doğru geliştirmek için alıcının kapasitesini değerlendirmek için iletişim kuralları sağlar. Açıklanan tolerans modelleri daha fazla yeni biyolojik ve immunoregulatory molekülleri, belirlemek için düzenleyici hücreleri tanımlamak için kullanılan ve diğer nakli modelleri veya otoimmün hastalıklar kemirgen ya da insan için uyarlanabilir.

Giriş

Sıçan kalp homogreft hoşgörü indüksiyon tedavisi, hoşgörü indüksiyon ve bakım, mekanizmaları deşifre değerlendirmek için bir güvenilir organ nakli model ve işlevsel olarak yetkili ve baskın düzenleyici hücreleri uyarmak için bir potansiyele sahiptir. Aşağıdaki protokolleri bir tam uyuşmazlığı heterotopik kalp nakli Lewis 1W donör sıçan (LEW.1W, RT1u) dan Lewis 1A alıcı fareye (LEW.1A, RT1bir) açıklar. Bu greft birlikte akut ret hızla (yaklaşık 7 gün içinde) oluşur ve kolayca palpasyonla karın üzerinden ölçüm yenerek greft tarafından tespit edilebilir. Burada sıçan kalp homogreft tolerans ikna etmek için üç Protokolü öneriyorum. Bu modeller tolerans indüklenen ve/veya farklı düzenleyici hücre tipleri tarafından yapılmaktadır. İlk, bir adenovirus CD40Ig kodlama ile CD40-CD40L etkileşimleri engelleme (AdCD40Ig) indüklenen CD8 nesil+ Tregs tolerans adoptively ne zaman ikna yeteneğine sahip ikincil aşılı alıcıların1' e transfer. Ayrıca, CD8 tükenmesi+ hücreleri (anti-CD8α antikorlar ile) AdCD40Ig tedavi alıcılar oluşturulan Bregs ve RegMCs2'. CD8 derin analizi+ özellikleri vurgulanır İnterlökin-34 (IL-34) ve Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 tanımlanan çeşitli immunoregulatory moleküllerin önemli rol Tregs . IL-34 overexpression (bir AAV vektör ile) Tregs RegMCs üretimi ile indüklenen ise overexpression FGL-2 Bregs, karmaşık ağ düzenleyici hücrelerin temel indüklenen.

Kronik ret yavaş yavaş gelişir ve uzun vadeli bir derinlemesine analiz kronik ret karşı tolerans ayırt etmek zorundadır. Greft için hücre infiltrasyonu, genellikle değerlendirildi fibrozis, kalınlaşma yükünün vasküler duvar ve tamamlayıcı C4d tarafından immunohistology7. Histoloji yöntemleri hayvan kurban gerektirir veya biyopsi grefti iken, burada biz tolere homogreft farklı özelliklerini değerlendirmek için basit bir yöntem tarif: ortaya çıkması ve düzenleyici hücreleri ve kan Anti-donör spesifik antikor yanıtlarını fonksiyonu Akış Sitometresi tarafından örnek (burada, Floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanılır).

Bakım tedavisi tutuklanması sonra homogreft için hoşgörü genellikle düzenleyici hücreleri8indüksiyon ile ilişkilidir. Son yıllarda çalışmalar odaklı CD4 üzerinde+Tregs oybirliği ile karakterize onlar anahtar işaretleri Foxp3 tarafından+, CD25yüksekve CD127-9,10,11. Benzer şekilde, çeşitli işaretçileri için CD8 atfedilmiştir+ Tregs, CD122 gibi+, CD28-, CD45RCdüşük, PD1+ve Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. yaş, GITR, CTLA4 ve sitokinler ifadesi üzerinde (IL-10, TGFβ, Il-34, IL-35, FGL-2) bir Treg profil3,4,6,13, ayrıca ilişkili bulunmuştur 18,19,20,21. Ancak, Bregs, RegMCs veya NKTregs, gibi gelişmekte olan düzenleyici hücre popülasyonlarının ilgili belirli işaretleri yok. Gerçekten de, Bregs çoğunlukla olgunlaşmamış CD24 rapor edilen+ hücreleri, belirsiz CD27 ifade ve bazen üretimi IL-10, TGFβ veya granzyme B22,23,24. Myeloid hücre lineage karmaşıklığı CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a veya CD16325,26gibi onların Düzenleyici veya proinflamatuar profili tanımlamak için birkaç işaretleri bir arada gerektirir. Son olarak, bazı işaretleri NKTregs CD11b gibi tanımlamak için bildirilmiş olan+, CD27+, TGFβ+, ama daha fazla çalışmalar hakkında diğer phenotypically27,28,29 açıklamak için gerekli ,30,31,32. Böylece, delillerin baskılayıcı aktivitenin daha fazla yeni biyolojik, tanımlanması için fenotipik açıklama meşrulaştırmak için gerekli olan yeni immunoregulatory arabulucu ve yeni hücre tedaviler kapsamı genişletmek için.

Biz süpresif etkinliği hücre değerlendirmek için iki tamamlayıcı yöntem öneriyoruz. İlk olarak, etiketli efektör T hücrelerle hücreler (ZPT) farklı oranlarıyla 6 gün içinde sunulması allojeneik donör antijen tarafından uyarılan süpresif hücre kültürü çalışmalarının vitro yöntemi oluşur ve efektör analiz T Hücre proliferasyonu bu bağışıklık suppression donör yönetmen yansıtır. Tedavi fareler hücrelerden doğrudan hücrelere saf fareler ve aşılı fareler süpresif etkinliği için (veya diğer düzenleyici hücre nüfus), tedavi olmayan, bir bastırıcı: efektör oranları aralığındaki karşılaştırılabilir. Ayrıca, bu yöntem does değil istemek birisi nakli ve sonuçları 6 gün içinde alınır. İkincisi, in vivo yöntemi amaçlanan düzenleyici hücreleri tedavi bir sıçan gelen yeni radyasyonlu aşılı alıcıya transfer oluşur. Üzerinden B hücreleri, myeloid hücrelerin veya T hücreleri iken saf olmayan tedavi fareler genellikle akut ret inhibe ve greft hayatta kalma evlat edinen transferi üzerine uzatmak mümkün değildir, bu öznitelikleri hücreleri aktivitesiyle potentiated süpresif tedavi alıcılardan gelen var 1,2,3,4,33. Alıcının ışınlama tarafından indüklenen Lymphopenia adoptively transfer edilen hücreleri kan homeostazı tarafından etkilenmez ve daha kolay Anti-donör bağışıklık yanıtı master için izin vermek için önerilir. Her iki yöntem de allojeneik vitro kullanımı üçüncü parti ZPT veya vivo içinde evlat edinen transferini süpresif için bir üçüncü taraf kalp ile aşılı alıcılar hücrelere Anti-donör özgüllük analizine izin. Vivo yöntemi temsil önemli bir sayı bir hücre, kötü gerektirir, ancak hücre altgrupları daha kolay süpresif etkinlik vitro33için tespit edilebilir.

Humoral yanıt tolerans durumunu ve donör antijenleri için yönlendirilmiş antikor yanıt kontrolünü değerlendirmek için ölçülebilir. Nitekim, tolerans verici doğru humoral yanıt yokluğu ama alıcıların humoral yanıt-e doğru yeni antijenleri geliştirmek kapasite korunması ve bellek yanıtları korunması tarafından karakterize edilebilir. İlk olarak, alloantibody algılama prensibi üzerinde donör hücre tanıma alıcı antikorlar kuluçka donör hücre türü serum ile aşılı bir alıcıdan takip romanından uyarlandı. Eksojen antijenleri için yönettiği ikinci, humoral yanıt aşağıdaki uyarılması değerlendirildi: uzun vadeli hoşgörülü alıcılar ile anahtar deliği vantuzlu Hemocyanin (tam Freund's adjuvan ile emülsiyon KLH) olabilir. Belirli IgM ve IgG antikorlar antijenlere karşı varlığı 4 ila 13 gün, sırasıyla, ardından bağışıklama, enzim bağlantılı ImmunoSorbent Assay (ELISA)34ile tespit edilebilir. Üçüncü olarak, bağışıklık belleği yanıt korunması ve gün nakli alıcı serumu gün toplanan ile + 8 ve nakli takip +17 boyama RBCs -7 ve 3 xenogeneic kırmızı kan hücreleri (RBCs) enjeksiyonu ile tespit edilebilir. Tüm bu yöntemler belirli ikincil antikorlar ve hızlı FACS boyama tarafından daha az 1,5 saat sonuçlarında edinimi veya ELISA birkaç saat kullanarak immünglobulin alt türlerinden tanımlanması için izin.

Son olarak, bu protokoller nakli modelleri karakterizasyonu için tasarlanmıştır ve Otoimmün hastalık modelleri için uygulanan bir ölçüde olabilir. Yöntem ilkeleri tüm türler için aktarılmış.

Protokol

Not: Tüm iletişim kuralları burada bir Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve steril bir şekilde yapılmalıdır.

1. nesil hoşgörü, kardiyak homogreft fare modeli

  1. lew.1w LEW.1A homogreft yordamı için
    1. Bir donör erkek lew.1w isoflurane O2 inhalasyon, %1 N2ile O 5 dk. yer dorsal dekübitus, hayvan sonra takıma kullanarak fare ve karın Torakotomi gerçekleştirmek için betadin ile dezenfekte anestezi (Yani, kesi içine Plevral boşluk göğüs).
      1. İnferior ve superior venae cavae kelepçe, onlara bağlanma izleri ve kesin. Sonra aort ve pulmoner arter kesme ve greft soğuk %0,9 kaydeder NaCl.
    2. 5 dk. içinde dorsal dekübitus hayvan koyduktan ve karın xyphopubic laparotomi gerçekleştirmek için betadin ile dezenfekte sonra %1 N2ile O takıma isoflurane O2 inhalasyon kullanarak 250 g erkek LEW.1A alıcı fare (Toplam 8-12 hafta) anestezi (Yani, büyük xiphoid işlem kasık symphysis için kesi).
      1. Bağırsak yansıtmak, karın kan damarları kelepçe, bir termino-lateral anastomoz (Yani, bir kanal sonu ve diğer duvar arasında bağlantı) arasında greft aort ve abdominal aort ve pulmoner arasında gerçekleştirmek arter ve karın vena kava ve Kaldır kelepçeler.
    3. Kas uçak ve deri dikiş ve betadin ile dezenfekte.
    4. Nalbuphine (ağrı kesici) enjekte 6 mg/kg subkutan (SC) ve oksitetrasikline (antibiyotik) İntramüsküler (sohbet) ve belgili tanımlık hayvan uyanır kadar hayvan a ısı lamba altında koyun. Buprenorfin (opioid) (50 µg/kg) sohbet ve Meloksikam (steroid olmayan anti-inflamatuar ilaç) enjekte (0.3 mg/kg) SC günü nakli ve bir gün sonra.
  2. İndüksiyon hoşgörü abluka costimulatory etkileşimlerin tarafından
    1. 1.1.1 adımları. 1.1.2 için.
    2. İçinde gizli bir A2 alan hayvan tesisin AdCD40Ig 2 x 1010 bulaşıcı parçacıkların (bir adenovirus CD40Ig, chimeric molekül engelleyen CD40-CD40L etkileşimleri kodlama) 150 µL son hacmi ulaşmak için zil'ın laktat çözümde sulandırmak ve 3 puan (3 x 50 µL) greft apeks ventrikül duvarındaki enjekte.
    3. 1.1.3-1.1.4 adımları.
      Not: AdCD40Ig tedavi anti-CD8α, anti-ICOS veya anti-CD28 antikor enjeksiyonları2,35,36ile ilişkili olabilir.
  3. İndüksiyon hoşgörü rekombinant protein overexpression tarafından
    1. 1 x 1012 viral genom son hacmi 100 µL. ulaşmak için IL34-rekombinant AAV zil'ın laktat çözümde bir 150 gr LEW.1A fareyle isoflurane O2 inhalasyon anestezi ve intravenöz enjekte sıçan seyreltik (IV) penis ven.
    2. Bir ay AAV-IL34 enjeksiyon, takip LEW.1W greft LEW.1A alıcının 1.1 protokolüne göre gerçekleştirin.

2. karışık lenfosit reaksiyonlar (MLRs) hücreleri süpresif etkinliğinin Vitro değerlendirme

Not: Süpresif tedavi hoşgörülü fareler hücrelerden aktivitesinin eşdeğer nüfus syngeneic aşılı alıcılar veya saf fareler ile karşılaştırılmalıdır.

  1. Allojeneik ZPT yalıtım: plazmasitoid dendritik hücreler (PDC)
    1. Erkek LEW.1W saf donör sıçan isoflurane O2 inhalasyon, 5 dk. içinde dorsal dekübitus hayvan koyduktan ve karın splenektomi gerçekleştirmek için betadin ile dezenfekte sonra %1 N2ile O takıma kullanarak anestezi. Dalak gemilerin transecting tarafından kaldırmak, dalak soğuk 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) X kaydedin ve hayvan dikiş.
    2. Dalak bir tabak içinde transfer için 1 X PBS kaldırmak ve %0,2 collagenase d ile 5 mL sıvı Enzim sindirim geliştirmek için dalak küçük parçalar halinde kesilmiş ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
    3. 0.1 M ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 500 µL eklemek, dalak parçaları bir elek aktarmak ve dalak hücreleri ayırmak için şırınga'nın piston ile ezmek. Bir tüp içine aktarmak ve 15 mL 1 X PBS hücrelerle yıkayın. Santrifüj 430 x g., 10 min süpernatant atmak.
    4. RBCs ve trombosit ortadan kaldırmak için splenocyte Pelet 10 mL Hipotonik solüsyon içinde resuspend ve oda sıcaklığında (RT) 5 dk kuluçkaya. 1 X PBS ile yıkama ve 190 x g. atma süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi.
    5. Kollajen lifleri 100 µm doku filtre filtre uygulayarak kaldırın. Hücre konsantrasyonu 5 x 107 hücre/ml 1 X PBS/2% fetal buzağı Serumda (FCS) / 0.5 mM EDTA ayarlamak için hücreleri saymak.
      Not: Splenocytes sayısı 4 x 108 ve 7 x 108 hücreleri arasında olmalıdır.
    6. Hücre sıralama önce negatif seçime göre faiz hücreler için zenginleştirmek. 2 µg/mL saf antikorlar T hücreleri (anti-TCRαβ, R7/3 klon ve anti-TCRγδ, V65 clone), B hücreleri (anti-CD45RA, OX33 klon) ve NK hücreleri belirli ile 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya (CD161 anti 3.2.3 klonu), 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile yıkama ve 430 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi . Süpernatant atmak.
    7. 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile 3 kez manyetik boncuklar ile yıkayın. 30 mL 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA, mıknatıs üzerinde 1 dk. için yer ekleyerek yıkayın ve süpernatant atmak 3,5 µL boncuk/106 splenocytes kullanın. İki kez tekrarlayın. Boncuk 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA 10 cilt olarak resuspend (örneğin, 35 µL boncuk seyreltilmiş 350 µL 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA).
    8. 1 dk. için mıknatıs tüp yerleştirin ve süpernatant için yeni bir tüp transfer ajitasyon altında 4 ° C'de 10 dakika için manyetik boncuklar ile splenocytes karışımı ile istenmeyen hücrelerin çıkarın. İki kez tekrarlayın. Hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonu 5 x 107 hücre/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 mm EDTA ayarlayın.
      Not: Zenginleştirilmiş splenocytes sayı 5 x 107 ve 9 x 107mesafe.
    9. Daha fazla PDC'ler sıralama için etiketli antikorları kullanarak hücreleri leke: kalan T hücreleri (anti-TCRαβ, R7/3 klon) veya B hücreleri (anti-CD45RA, OX33 klon) dışlamak ve CD4 sıralamak+ (anti-CD4, OX35 klon) CD45R+ hücreleri (anti-CD45R, His24 klon). Boncuk FACS üzerinde telafisi matris oluşturmak için her Ab ile etiketleyin. 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya ve 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile yıkayın.
    10. 5 x 107 hücre/mL, 60 µm doku filtre, filtre bir konsantrasyon hücreleri resuspend ve ölü hücreleri 0.1 µg/mL nihai bir konsantrasyon DAPI ekleyerek etiket. Sıralama hücreleri ile 70 µm meme hücre sıralayıcısı, DAPI--TCR CD45RA üzerinde perdeleme tarafından-CD4+CD45R şekil 1' de gösterildiği gibi + .
  2. Yalıtım Yanıtlayıcı efektör T hücre (CD4 + CD25 - T hücreleri)
    1. Dalak bir sigara aşılı saf olmayan tedavi LEW.1A sıçan dan hasat ve kurtarmak o içinde soğuk 1 X PBS.
    2. Dalak bir tabak içinde yerleştirilen bir elek olarak aktarmak ve 10 mL 1 X PBS ekleyin. Dalak hücreleri ayırmak için şırınga'nın piston ile ezmek. Hücreleri 50 mL tüp içine aktarmak, 1 X PBS ile yıkayın ve 430 x g. atma süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi.
    3. RBCs ve trombosit ortadan kaldırmak, RT, 5 min için 10 mL Hipotonik solüsyon içinde splenocyte Pelet resuspend için sonra yıkayın 1 X PBS ve 10 dk 190 x g., santrifüj süpernatant atmak.
    4. Kollajen lifleri 100 µm doku filtre filtre uygulayarak kaldırın. Hücre konsantrasyonu 5 x 107 hücre/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 mm EDTA ayarlamak için hücreleri saymak.
      Not: Splenocytes sayısı 3 x 108 ve 5 x 108 hücreleri arasında olmalıdır.
    5. Faiz hücrelerinin sıralamadan önce zenginleştirmek. 2 µg/mL saf antikorlar (anti-CD8α, OX8 klon) CD8 hücreleri, B hücreleri (anti-CD45RA, OX33 klon), NK hücreleri belirli ile 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya (CD161 anti 3.2.3 klonu), myeloid hücrelerin (anti-CD11b/c, OX42 clone), gama delta T hücreleri (anti-TCRγδ, V65 klon). 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile yıkayın ve santrifüj 430 x g., 10 min süpernatant atın.
      Not: doğal CD8 sıralamak için+ Tregs saf gelen fareler CD4 aynı anda+ efektör T hücreleri, tükenmesi sırasında anti-CD8α Ab eklemeyin.
    6. 2.1.7. adımda açıklandığı gibi 3 kez 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile manyetik boncuklar yıkayın.
    7. Ajitasyon altında 4 ° C'de 10 dakika için manyetik boncuklar ile splenocytes karışımı ile istenmeyen hücre kaldırma sonra tüp 1 dk. için mıknatıs yerleştirin ve süpernatant aktarmak için yeni bir tüp. İki kez tekrarlayın. Hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonu 5 x 107 hücre/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 mm EDTA ayarlayın.
      Not: Splenocytes sayı 5 x 107 ve 8 x 107 hücreleri mesafe.
    8. Sıralama CD4 etiketli antikorlar+CD25 eklemek- T hücreleri: anti-TCRαβ (R7/3 clone), anti CD4 (OX35 clone), anti-CD25 (OX39 klon) ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya Aynı anda CD8 sıralamak için+CD45RCdüşük Tregs, anti-CD45RC Ab (OX22 klon) ekleyin. Boncuk Akış Sitometresi işlenmesi için bir tazminat matris ayarlamak için her Ab ile etiketleyin. 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.
    9. 5 x 107 hücre/ml, 60 µm doku filtre, filtre hücreleri resuspend ve ölü hücreleri 0.1 µg/mL nihai bir konsantrasyon DAPI ekleyerek etiket. 70 µm meme hücre sıralayıcısı hücrelerle DAPI -TCR+CD4 çoğunluğuna göre sıralama+CD25 Yanıtlayıcı hücreler olarak- hücreleri (ve DAPI -TCR+CD4 gerekirse-CD45RCdüşük CD8+ Tregs süpresif hücreleri) Şekil 2' de gösterildiği gibi.
  3. Yalıtım süpresif hücre
    Not: iki aliquots dalak bölün: bir B hücreleri, myeloid hücrelerin ve NK hücreleri ve diğer CD4 sıralamak+ ve CD8+ CD45RCdüşük T hücreleri, süpresif işlevleri değerlendirmek için.
    Not: evlat edinen hücre aktarımı için gerekirse evlat edinen havalesiyle hoşgörünün pozitif kontrol olarak hizmet için 1 x 108 splenocytes kaydedin.
    1. B hücreleri, myeloid hücrelerin ve NK hücreleri boylama
      1. İletişim kuralı 2.1.1-2.1.5 izleyin.
      2. 2 µg/mL T hücre özel antikorlar (anti-TCRαβ, R7/3 klon ve anti-TCRγδ, V65 klon) 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile yıkama etiketsiz ile 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya ve 430 x g. atma süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi.
      3. 2.1.7. adımda açıklandığı gibi 3 kez 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile manyetik boncuklar ile yıkayın.
      4. Splenocytes istenmeyen hücre kaldırma ve ajitasyon altında 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya sonra tüp 1 dk. için mıknatıs yerleştirin ve süpernatant için yeni bir tüp transferi için manyetik boncuklar ile karıştırın. İki kez tekrarlayın. Hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonu 5 x 107 hücre/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 mm EDTA ayarlayın.
      5. Etiketli antikorlar hücre myeloid hücrelerin (anti-CD11b/c, OX42 klon) gibi şüpheli süpresif etkinliği ile B hücreleri (anti-CD45RA, OX33 klon) veya NK hücreleri sıralamak için splenocytes Ekle (anti-CD161, 3.2.3 clone). Boncuk FACS üzerinde telafisi matris oluşturmak için her Ab ile etiketleyin. 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya ve 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile yıkayın.
      6. 5 x 107 hücre/mL, 60 µm doku filtre, filtre bir konsantrasyon hücreleri resuspend ve ölü hücreleri 0.1 µg/mL nihai bir konsantrasyon DAPI ekleyerek etiket. 70 µm meme hücre sıralayıcısı hücrelerle DAPI-CD11b/c+ myeloid hücrelerin CD45RA çoğunluğuna göre sıralama+ B hücreleri ve CD161 için+ şekil 3' te gösterilen NK hücreleri için.
    2. CD4 sıralama + ve CD8 + CD45RC düşük T hücreleri
      1. İletişim kuralı 2.2.1-2.2.4 izleyin.
      2. Manyetik bir sütunda negatif seçim için hücreleri ile 2 µg/mL saf antikorlar için B hücreleri (anti CD45RA, OX33 klon), NK hücreleri belirli 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya (CD161 anti 3.2.3 klonu), myeloid hücrelerin (anti-CD11b/c, OX42 clone), gama delta T hücre ( Anti-TCRγδ, V65 klon), 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile yıka ve 430 x g. atma süpernatant, 10 dk santrifüj kapasitesi.
      3. 2.1.7. adımda açıklandığı gibi 3 kez 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile manyetik boncuklar yıkayın.
      4. Ajitasyon altında 4 ° C'de 10 dakika için manyetik boncuklar ile splenocytes karışımı ile istenmeyen hücre kaldırma sonra tüp 1 dk. için mıknatıs yerleştirin ve süpernatant aktarmak için yeni bir tüp. İki kez tekrarlayın. Hücreleri saymak ve hücre konsantrasyonu 5 x 107 hücre/ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 mm EDTA ayarlayın.
      5. Etiketli antikorlar Tregs sıralamak için hücrelere ekleme: anti-TCRαβ (R7/3 clone), anti-CD4 (OX35 clone), anti-CD45RC (OX22 clone). Boncuk FACS üzerinde telafisi matris oluşturmak için her Ab ile etiketleyin. 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya ve 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile yıkayın.
      6. 5 x 107 hücre/mL, filtre 60 µm doku üzerinde bir konsantrasyon hücreleri resuspend ve ölü hücreleri 0.1 µg/mL nihai bir konsantrasyon DAPI ekleyerek etiket. 70 µm meme hücre sıralayıcısı hücrelerle DAPI üzerinde çoğunluğuna göre sıralama-+CD4 TCR+CD45RCdüşük CD4+Tregs ve DAPI-TCR+CD4-CD45RC düşük CD8+Tregs ( şekil 4).
        Not: T hücreleri CD4 ayrımcılık anti-CD8α Ab (OX8 klon) anti-CD4 Ab yerine kullanılabilir+anti-TCR etiketleme tarafından T hücreleri. CD4 aşırı+Tregs Hücre proliferasyonu boya (GBM) etiketleme nedeniyle hücre ölümü beklentisiyle sıralanmış.
  4. Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Yanıtlayıcı hücrelerin proliferasyonu ölçmek için etiketleme
    1. Sıralama Yanıtlayıcı hücre sonra iki kez hücreleri 1 X PBS ile yıkayın.
    2. 1 x 107 hücre/mL 1 X PBS bir konsantrasyon hücreleri resuspend ve karanlıkta RT, 5 min için 0.5 µM CFSE ile kuluçkaya. Reaksiyon 1,5 X cilt FCS ekleyerek durdurmak ve vasıl 430 x g 4 ° C'de 10 dk santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
    3. İki kez tam orta hücrelerle yıkama ve hücreleri saymak.
      Not: Bu aşamada hücre ölüm % 30'u bekliyoruz.
  5. CPD CD4 etiketleme + Tregs CD4 üzerinde süpresif tahlil için + efektör hücreleri
    Not: CFSE-CD4 ayırımcılık için bu adım gereklidir+Tregs+CFSE- Proliferasyona Yanıtlayıcı CD4 üzerindenT hücreleri, CPD- hücreleri üzerinde perdeleme tarafından günün 6 coculture.
    1. CD4 sonra+ Tregs hücre sıralama, iki kere 1 X PBS hücrelerle yıka.
    2. 1 x 107 hücre/mL 1 X PBS bir konsantrasyon hücreleri resuspend ve CPD V450 10 µM RT, 20 dk içinde belgili tanımlık karanlık ile kuluçkaya.
    3. İki kez tam orta hücrelerle yıkama ve hücreleri saymak.
      Not: Bu aşamada hücre ölüm % 30'u bekliyoruz.
  6. Coculture için tavsiye
    1. Orta oluşan kültür kullanın: RPMI 1640 orta takıma beta-mercaptoethanol (5 x 10-5 M), penisilin (100 U/mL), streptomisin (0.1 mg/mL), sodyum pyruvate (1 mM), glutamin (2 mM), HEPES tampon (1 mM), non-gerekli amino asitler (1 X), FCS () % 10).
    2. 96-şey U hücrelerde kültür plakaları alt.
    3. Hücreleri aşağıdaki sırayla ekleyin: Süpresif hücreleri, Yanıtlayıcı hücreleri ve allojenik hücreleri.
    4. Yanıtlayıcı T hücreleri ve allojenik ZPT sayısı sabit tutmak ve Tregs aralığı birkaç test. Örneğin, oran 4:4:1, 5 x 104 süpresif hücreleri, 5 x 104 Yanıtlayıcı hücreleri ve 1,25 x 104 allojeneik hücreleri ve oranı 2:4:1, 2. 5 x 104 süpresif hücreleri, 5 x 104 Yanıtlayıcı hücreleri ve 1,25 x 104 allojenik hücreleri.
    5. 5 x 104 Yanıtlayıcı hücreleri 200 µL orta/kuyu oranı korumak.
    6. Denetimler için birkaç wells Yanıtlayıcı T hücreleri allojeneik ZPT (negatif kontrol) olmadan ve düzenleyici hücreleri (pozitif kontrol) olmadan allojeneik ZPT Yanıtlayıcı T hücreleri ile CFSE gün (bkz. Adım 2.7.6.) 6 geçişi için içerir.
  7. FACS boyama ve analiz coculture 6 gün sonra
    Not: Birkaç saat noktalarda efektör hücrelerin çoğalması tespit edilebilir. Nükleer silahların yayılmasına karşı Tahminlerime göre Not: hücre bölünmesi arttıkça baskılayıcı koşulları ve negatif kontrol arasında daha fazla farklılıklar görülebilmektedir.
    1. Hücreleri nakletmek--dan 96-şey U alt tabakaları 96-şey V bana alt plakalar ve vasıl 1200 x g 4 ° C'de 1 dk santrifüj kapasitesi
    2. Süpernatant sitokin düzeyleri, ölçme-20 ° C'de yeni bir tabak gerekirse kaydedin.
    3. Hücreleri 200 µL iyi ve santrifüj vasıl 1200 x g 4 ° C'de 1 min başına 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA ile yıkayın
    4. Antikorlar hücrelere daha fazla Yanıtlayıcı T hücreleri üzerinde kapı ekleyin: anti-TCRab (R7/3 clone) ve anti-CD4 (OX35 clone). 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya ve iki kez 200 µL 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA iyi yıkayın. Süpernatant atmak.
    5. DAPI 100 µL 0.1 µg/mL 1 X PBS, seyreltilmiş ve FACS analyzer ile plaka okumak ekleyin.
    6. CFSE profil DAPI olumsuzluklara (canlı hücreleri) çoğunluğuna göre analiz CPD negatif (+CD4-Tregs) TCR+CD4+ hücreleri. Unstimulated Yanıtlayıcı hücreleri maksimal CFSE parlaklık şekil 5 alt sol histogram içinde gösterildiği gibi var. Allojeneik ZPT varlığında maksimal yayılması ve en az CFSE parlaklık (alt, orta) Yanıtlayıcı hücreler içeriyor. Allojeneik ZPT ve düzenleyici hücreleri huzurunda efektör hücreleri orta yayılması ve CFSE parlaklık (sağ altta) sahiptir.

3. bir kalp aktarımda evlat edinen hücre hücreleri süpresif etkinliğinin Vivo içinde değerlendirme aşılı alıcı

Not: Işınlama konak hücreleri ortadan kaldırmak ve donör hücre engraftment ve nükleer silahların yayılmasına karşı iyilik için gereklidir.

  1. Greft alıcıları alıcı yaygõn greft önce günü erken ışınlatayım. Fareler xylazine (8 mg/kg) Im. enjeksiyon ile anestezi-ketamin (80 mg/kg) ve onları bir doz X ışınları ile 4.5 Gy, ışınlatayım.
  2. Protokolü 2.3 hücre ilgi izole etmek için izleyin.
    Not: gerekirse evlat edinen havalesiyle hoşgörünün pozitif kontrol olarak hizmet etmek için 1 x 108 splenocytes kaydedin.
  3. Işınlama (gün önce greft akşam), sonra 12 h % 4 isoflurane O2 inhalasyon tarafından fareler anestezi ve hücreleri demlemek (5.0 x 107 T hücreleri, 3.0 x 107 B hücreleri, 3.0 x 107 myeloid hücrelerin veya 1,50 x 108 penis ven splenocytes tarafından evlat edinen transferi toleransı pozitif kontrol olarak) IV.
    Not: Evlat edinen transferi toleransı hücreleri süpresif faaliyete bağlıdır için gerekli hücre sayısı.
  4. Ertesi gün, protokolü 1.1 homogreft gerçekleştirmek için izleyin. Greft evrim palpasyonla karın üzerinden izleyin.

4. donör spesifik antikor algılama

Not: IgG yönetmen graft donör doğru yanıt ölçülen serum alıcının donörle hücrelerden kuluçka tarafından. Doğrudan LEW.1W B hücrelerinin syngeneic LEW.1W serum hücrelerle kuluçka tarafından boyama tarafından indüklenen arka plan çıkarma.

  1. Fareler kandan hasat ve vasıl 1200 x g 4 ° C'de 15 dk santrifüj kapasitesi Serum kaydedin. Serum-20 ° C'de depolanan veya hemen kullanılabilir. Sera içinde tamamlayıcı 56 ° C'de 30 dk için kuluçka tarafından devre dışı bırakma
  2. Dalak bir donör LEW.1W sıçan dan hasat ve kurtarmak o içinde soğuk 1 X PBS. 2.2.1 adımları izleyin. 2.2.4 için. 2 x 105 hücreleri/iyi bir 96-şey V alt plaka ekleyin. 1200 x g 4 ° c de 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
  3. 1/10 üzerinden seri olarak sera 1 1/270 X PBS için seyreltik (4 dilutions/örnek). Seyreltik serum/iyi 25 µL ile 4 ° C'de 1 h için hücreleri kuluçkaya. Örnek (1 serum x 4 dilutions x 4 IgG alt türlerinden) çözümlemek için donör özgü IgG alt türlerinden (IgG, Igg1, Igg2a, Igg2b) bağışıklık yanıtı sayısı tahmin. 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.
  4. Her fare Anti-sıçan IgG alt türü'Ab fluorochrome 4 ° c, bir alt türü/iyi 30 dk için etiketli hücrelerle kuluçkaya.
    Not: Anti-sıçan IG Ab fluorochrome etiketli kullanılamıyorsa, bu saf etiketlenmemiş fare Anti-sıçan IgG alt türü Ab ve fluorochrome etiketli ikincil Anti-fare AB bağlı kullanılabilir fluorochromes ve sitometresi yapılandırma kullanmak mümkündür, Birkaç anti-sıçan IgG alt türlerinden bir kuyuda uygun ayarlarla test edilebilir.
  5. 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA içeren hücreleri iki kez yıkayın ve süpernatant atın.
  6. DAPI 100 µL PBS 0.1 µg/mL, seyreltilmiş ve FACS analyzer ile plaka okumak ekleyin.
  7. Ab ile fluorochrome tüm DAPI- hücrelerde etiketli Anti-sıçan IgG alt türündeki ortalama Floresans yoğunluğu (MFI) okuyun. Saf LEW.1A serum LEW.1W hücreler (arka plan boyama, sol alt) ile LEW.1W hücrelerde karşılık gelen seyreltme, her alıcı ile sera elde MFI elde MFI çıkarma (alt orta tedavi edilmezse reddetme alıcılar için bu maksimal MFI ve alt orta MFI görüntüleyen şu tedavi hoşgörülü alıcılarına görüntüle) (şekil 6).

5. değerlendirme Humoral yanıt eksojen antijenleri (Naive ve belleği yönetme)

Not: Serum fareler nakli, tedavi ve bağışıklama önce gelen humoral yanıt negatif denetimleri kullanılmalıdır. Aksi takdirde, saf olmayan aşı rats-ebilmek var olmak kullanılmış. Serum immün alıcılar, Yani, transplante exoantigen aşı ve reddetme alıcılar, humoral yanıt olumlu denetimleri kullanılır.

  1. Humoral yanıt-e doğru yeni antijen (Şekil 7) geliştirmek için kapasite
    Not: bir standart yüklü olmadığı gibi Bu humoral yanıt göreli bir miktar yöntemidir. 5.1.6. adımda dilutions sıçan IgG veya IgM anti-KLH Ab bilinen konsantrasyon ile bir dizi ekleyerek bir mutlak IG miktar mümkün olacaktır.
    1. KLH 50 µg tam Freund's adjuvan 200 µL içinde emulsify ve uzun hayatta/dayanıklı alıcılar kuyrukta enjekte, tedavi edilmemiş reddetme alıcıları veya saf fareler humoral yanıt pozitif kontrol kontrol edin.
    2. Kan örnekleri 4 ila 13 gün sonra aşılama, hasat ve vasıl 1200 x g 4 ° C'de 15 dk santrifüj kapasitesi Serum üst aşama kaydetmek. Serum aşı olmayan fareler bir negatif kontrol için gelen hasat. Serum-20 ° C'de ELISA tahlil kadar donmuş olabilir.
    3. ELISA tabak (düz dipli) 50 µL/kuyu, 1 X PBS gecede 4 ° C'de 10 µg/mL sulandırılmış KLH ile kat Kaplama çözüm tüm wells kapsadığından emin olun.
    4. Aşırı kaplamasız KLH yıkama tarafından kaldırın. Yıkama eklemek 150 µL/iyi yıkama arabelleği (%0,1 içeren 1 X PBS ara) ve hafifçe vur.
    5. Blok 100 µL/iyi % 10 FCS içeren yıkama arabelleği ile 37 ° C'de 1 h için kuluçka tarafından alıcının IG belirsiz bağlama. Bir kez yıkayın.
    6. Seri olarak 1/40 1/512 için başlangıç yıkama arabellekte alıcı sera sulandırmak, 50 µL/iyi kaplı levha seri seyreltme kopyası eklemek ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya Bazı kuyular serum bir negatif kontrol için ücretsiz tutun. İki kez yıkayın.
    7. 1 µg/ml serum içeren Wells IgM Ab alıcılar 4 günde veya anti-sıçan IgG 13 gün hasat serum içeren Wells biotin Birleşik 50 µL hasat ve 37 ° C'de 1 h kuluçkaya biotin Birleşik Anti-sıçan 50 µL Ekle İki kez yıkayın.
    8. HRP-Birleşik streptavidin 50 µL/kuyu 1 µg/mL 37 ° C'de 45 dakika için ekleyin 3 kez yıkayın.
    9. 3, 3, 5, 5 '-Tetramethylbenzidine (TMB) substrat < 30 min RT için 50 µL ekleyin ve 2 M sülfürik asit pozitif zaman denetimleri doymuş 25 µL ile reaksiyonu durdurmak.
    10. 405 Absorbans okumak nm. Saf fare kontrol serumu ile elde edilen bir alıcının serum ile elde edilen optik yoğunluk karşılaştırın.
  2. Değerlendirme, bellek humoral yanıt kapasitesi (şekil 8)
    1. 7 gün önce nakli, damardan 109 / xenogeneic RBCs 1 X PBS 800 µL içinde seyreltilmiş saf fareler enjekte. RBCs koyun, at veya herhangi bir diğer türler olabilir.
    2. Nakli gerçekleştirmek ve tolerogenic tedavi yönetmek.
    3. 3 gün greft sonra tekrar i.v.109 1 X PBS greft alıcıları ve sigara aşılı fareler 800 µL içinde seyreltilmiş RBC enjekte et.
    4. İkinci bağışıklama ve santrifüj 1200 x g 4 ° C'de üst serum faz kurtarmak için de 15 dk sonra kan örnekleri 5 ve 14 gün hasat. Serum-20 ° C'de depolanan veya hemen kullanılabilir. Sıçan sera içinde tamamlayıcı kullanmadan önce 56 ° C'de 30 dk kuluçka tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
    5. 2 x 105 RBC/iyi bir 96-şey V alt plaka ekleyin. 1200 x g 4 ° c de 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatli aspirasyon tarafından atın.
    6. Seri olarak sulandırmak sera 2 kat 1/10-1 1/1280 X PBS (8 dilutions/örnek). Seyreltik serum/iyi 25 µL ile 4 ° C'de 1 h için hücreleri kuluçkaya. 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.
    7. RBC türler adsorbe Anti-sıçan IgG hücrelerle veya IgM alt türlerinden fluorochrome 4 ° c, bir alt türü/iyi 30 dk için etiketlenmiş kuluçkaya. Sırasıyla 5 ve 14 gün sonra aşılama, hasat serum. IgM ve IgG anti-RBC köstebeğiyle değerlendirmek 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA içeren hücreleri iki kez yıkayın ve süpernatant atın.
      Not: Anti-sıçan IG Ab fluorochrome etiketli kullanılamıyorsa, saflaştırılmış etiketlenmemiş fare Anti-sıçan IgG alt türü Ab ve fluorochrome etiketli ikincil Anti-fare Ab kullanmak mümkün.
    8. 0.1 µg/mL 1 X PBS, seyreltilmiş DAPI 100 µL ekleyin ve hücreleri bir FACS analyzer ile analiz.
    9. MFI seyreltme her grup için bir fonksiyonu olarak temsil eder.

Sonuçlar

Baskılayıcı etkinlik (Resim 2), ZPT (şekil 1), Yanıtlayıcı hücreleri ve Tregs aynı anda boylama takip değerlendirilmesi veya ayrı ayrı (şekil 4), ve diğer sözde düzenleyici hücreler (şekil 3),-ebilmek var olmak Düzenleyici hücrelerin ve vitro ölçüm CFSE parlaklık (şekil 5) tarafından doğrudan enjeksiyon ta...

Tartışmalar

Evlat edinen toplam splenocytes aktarım yeni aşılı alıcı içine indüklenen veya bir tedavi ile potentiated düzenleyici satır olup olmadığını belirlemek için etkili bir yoldur. Ana ışınlama kaynaklı geçici lymphopenia transferden sonra hücre hayatta kalma ve hoşgörü kurulması teşvik etmektedir. Ayrıca, alt öldürücü ışınlama sırasında bağışıklık sulandırma, bulaşıcı tolerans34denilen bir fenomen yeni düzenleyici hücrelere dönüştürmek tolerogenic öze...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser ANR (ANR-11-LABX-0016-01) ve aynı zamanda tarafından finanse edilen IHU Cesti projesi tarafından yönetilen "Investissements d'Avenir" Fransız hükümeti programı'nın parçası olan Labex IGO proje (n ° ANR-11-LABX-0016-01) bağlamında gerçekleşmiştir " Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR tarafından) (ANR-10-IBHU-005) yönetilen Investissements d'Avenir"Fransız hükümeti programı. IHU Cesti projesi de Nantes Métropole ve Région Pays de la Loire tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
animals
LEW.1W and LEW.1A ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
BN third party donor ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
namecompanycatalogue numbercomments
reagents
AdCD40IgViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
IL34-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
FGL2-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
anti-TCRabHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KR7/3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX39 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX8 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RAHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX33 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K3.2.3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/cHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX42 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgdHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KV65 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RCHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX22 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX35 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RBD Biosciences, Mountain View, CA#554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#112-096-071
anti-rat IgG1Serotec#MCA 194
anti-rat IgG2aSerotec#MCA 278
anti-rat IgG2bSerotec#MCA 195
anti-rat IgM-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#115-095-164
streptavidin HRPBD Biosciences, Mountain View, CA#554066
KLHSigma Aldrich, St. Louis, USA#9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher Scientific Inc, USAPhosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20Sigma, Saint-Louis, USA#9005-64-5
TMB substrate reagent kitBD Biosciences, Mountain View, CA#555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kitThermo Fisher Scientific Inc, USA#C34554
RPMI 1640 medium 1XThermo Fisher Scientific Inc, USA#31870-025
penicilline streptomycineThermo Fisher Scientific Inc, USA#15140-122
Hepes BufferThermo Fisher Scientific Inc, USA#15630-056
non essential amino acidsThermo Fisher Scientific Inc, USA#11140-035
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific Inc, USA#11360-039
2 beta mercaptoethanolSigma, Saint-Louis, USA#M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 CellThermo Fisher Scientific Inc, USA#65-0842-85
GlutamineSigma, Saint-Louis, USA#G3126
DAPIThermo Fisher Scientific Inc, USA#D1306
Collagenase DRoche Diagnostics, Germany#11088882001
EDTASigma, Saint-Louis, USA#E5134
NaCl 0.9%Fresenius Kabi#B230561
Magnetic dynabeadsDynal, Invitrogen#11033Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeadsEbiosciences, San Diego, USA#01-1111-42
BetadineRefer to the institutional guidelines
IsofluraneRefer to the institutional guidelines
NaplbuphineRefer to the institutional guidelines
TerramycineRefer to the institutional guidelines
BuprenorphineRefer to the institutional guidelines
MeloxicamRefer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
RompunRefer to the institutional guidelines
Ringer lactateRefer to the institutional guidelines
KetamineRefer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solutionDilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase DDilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
namecompanycatalog numbercomments
equipments
falcon 50mlBD Biosciences, Mountain View, CA#227261
falcon 15mlBD Biosciences, Mountain View, CA#188271
sieve
Corning plastic culture dishesVWR, Pessac#391-0439
100µm and 60µm tissue filtersSefar NITEX, Heiden, Switzerland#03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning#353077
96 wells V bottom plates for FACS stainingThermoScientifique, Danemark#249570
96 wells flat bottom ELISA platesNunc Maxisorb
seringue for spleen crushBD Biosciences, Mountain View, CA#309649
ELISA readerSPARK 10M, Tecan, SwitzerlandSPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiatorLincolshire, EnglandFaxitron CP160
solar agitator
FACS Canto IIBD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria IIBD Biosciences, Mountain View, CA
magnetThermo Fisher Scientific Inc, USA12302D

Referanslar

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, &. #. 2. 0. 1. ;., Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojisay 126h cre s ralamad zenleyici h creleriTregsBregsRegMCsnakligen tedavisis presif tahlilkardiyak homogreftalloantibodyevlat edinen h cre transferis an

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır