JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Hücresel yaşlanma, hücre döngüsü tutuklama tersinmez durum, çeşitli hücresel stresler tarafından indüklenebilir. Burada, yaşlanmanın işaretlerini değerlendirmek için hücre yaşlanmasının ve yöntemleri ikna etmek protokolleri açıklar.

Özet

Hücresel stres veya hasara yanıt olarak, çoğalan hücrelerin hücresel yaşlanma olarak adlandırılan uzun süreli hücre siklüsü hapsi için bir durum başlatır belirli bir programı, neden olabilir. Yaşlanmış hücrelerin birikimi organizma yaşlanma ile ve in vitro olarak sürekli kültürleme yoluyla ortaya çıkar. Yaşlanan hücreler embriyonik gelişim, doku onarımı ve rejenerasyon, tümör bastırma ve yaşlanma gibi birçok biyolojik süreçleri, etkiler. yaşlanmış hücrelerin ayırt edici arasında, ancak, artan senesans ile ilişkili β-galaktosidaz aktivitesi (SA-β-gal) ile sınırlı değildir; p16 INK4a, p53 ve p21 seviyeleri; γ-H2AX dahil olmak üzere DNA hasarının daha yüksek seviyelerinin; Senesans ile ilişkili Heterokromatin odakları (SAHF) oluşması; ve bir senesans ile ilişkili Salgı fenotip (SASP), pro-enflamatuvar sitokinler ve sinyal molekülleri bir dizi salgılanması ile karakterize edilen bir fenomen kazanılması. Burada, hem replikatif için protokolleri tanımlamak veDNA, kültürlü hücrelerde yaşlanmayı hasar kaynaklı. Buna ek olarak, SA-β-gal, γ-H2AX ve SAHF boyama dahil olmak üzere birçok senesans ile ilişkili belirteçleri kullanarak yaşlanmış bir fenotipi izlemek, ve hücre döngüsü düzenleyicileri ve SASP faktörleri, protein ve mRNA seviyeleri ölçmek için teknikler vurgulamaktadır. Bu yöntemler, çeşitli model ve dokularında yaşlanmayı değerlendirilmesi için uygulanabilir.

Giriş

Yarım Üzeri asır önce, Hayflick ve arkadaşları kültürde çoğalmaya nasıl uğramamış hücreleri anlatılan ama zamanla 1'in yalnızca sınırlı bir süre için. İnsan fibroblast uzun süreli kültürleme çoğalan durdurmak için hücrelerin neden olduğu; ancak, metabolik olarak aktif olduğunu ve bu hücresel yaşlanma olarak adlandırıldı. Yaşlılık tümör oluşumunu inhibe etmek için yararlı olabilir, ama yaşlanma 2, 3 oluşur rejeneratif kapasitesinin kaybına katkıda bulunduğu düşünülmektedir olarak aynı zamanda, zararlı olabilir. Yaşlanmış hücreler Gı'de durdukları yaş 4 insanların ve embriyonik gelişme, yara iyileşmesi, doku tamiri, ve yaşla ilgili enflamasyon 2 de dahil olmak üzere biyolojik süreçler, bir dizi implike edilmiştir gibi dokularda birikebilir gösterilmiştir.

kültürdeki hücrelerin sürekli pasajı bağlanmıştır replikatif senesansın, indükleryıpratma ve genomik istikrarsızlık telomer. DNA hasarı ve onkogenler de dahil olmak üzere çeşitli hücre gerilimleri, aynı zamanda yaşlanmayı 3 neden olabilir. Telomer yıpratma dışındaki faktörlerden kaynaklanan Yaşlılık genellikle stres kaynaklı veya vaktinden evvel yaşlanmaya denilen ve genel olarak p16 INK4a / Rb yolu 5 bağlıdır. Çoğalan birlikte, transforme olmamış hücreler tipik olarak şekil mili görünür yaşlanmış hücreleri, bazı özelliklere sahip bir düz, büyük bir morfoloji ve artan senesans ile ilişkili β-galaktosidaz aktivitesi (SA-β-gal) (Şekil 1 ve 2) dahil olmak üzere tespit edilebilir. Yaşlanmış hücreler de γ-H2AX (Şekil 3), 6, ve muhtemelen, senesans ile ilişkili heterokromatin odakları (SAHF) (Şekil 4) 7 de dahil olmak üzere, DNA hasarı belirteçler birikir. Yaşlanmış hücreler p dahil olmak üzere hücre döngü düzenleyicileri ile ilgili daha yüksek seviyelerde sahip 16 (p16 INK4a) ve / veya p21 ve p53 (Şekil 5) 8, 9. Ayrıca, son veriler yaşlanmış hücrelerin, pro-inflamatuar sitokin ve kemokin, bir dizi salgılayarak otonom olmayan etkileri olduğu senesans ile ilişkili salgı fenotipi (SASP) 10 olarak adlandırılan göstermiştir. Bu SASP olgu, hücre türünden hücre türüne göre değişebilir, ancak genel olarak, bu İnterlökin-6 (IL-6) aksine, IL-8, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), büyümeyi bir artış ile ortaya konmuştur düzenlenmiş onkogen α (GRO-α) ve GRO-β, diğerleri arasında (Şekil 6). Yaşlanmayı indükleyen, özellikle stres veya hasar da salgı fenotipi 11, 12, 13 etkileyebilir. SASP ELISA'lar veya sitokin / protein dizileri kullanılarak salgılanan proteinlerin seviyelerini ölçerek tespit edilebilirs = "xref"> 10, 14. Transkripsiyon sonrası mekanizmalar SASP protein seviyeleri 11, düzenler, ancak 15, 16, 17, mRNA seviyelerinde değişiklikler de birçok durumda tespit edilebilir. Bu değişiklikler genellikle daha duyarlı ve protein seviyesi ölçümlerine göre ölçmek daha kolaydır. Diğer yaşlanmış belirteçler kalıcı DNA hasarı nükleer odaklar, yaşlanmayı (DNA izler) 18 takviye edici kromatin değişiklikler ile adlandırılan DNA bölümlerinin, ve çeşitli diğer belirteçler 3, 19, 20 dahil olmak üzere, saptanabilir.

Burada, SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF da dahil olmak üzere yaşlanma ait birçok belirteç, ölçülmesi için kültürdeki hücreler yaşlanmayı uyarılması ve ortak teknikleri tarif eder ve yaşlanmaya protein ve mRNAmoleküller nce ilişkili.

Protokol

1. Endükleyici Replikatif Senesens

  1. Çözülme düşük geçiş insan diploid fibroblastlar (örneğin, WI-38 ve IMR-90) ya da diğer hücre çizgileri dahildir.
    Not: Burada, insan diploid fibroblastlar kullanıldı, ancak bu protokoller, örneğin endotelyal, epitelyal veya mesenşimal kök hücreleri gibi diğer hücre tiplerinde, yaşlanmayı değerlendirmek için de kullanılabilir. Kültürleme koşulları nedeniyle farklı büyüme oranları veya büyüme koşullarına kullanılan farklı hücre türleri için optimize edilebilir.
    Not: hücre proliferatif olması ve bir mil morfoloji (şematik ve örnek için Şekil 2 Şekil 1 'e bakınız) olması gerekir. İdeal olarak, hücreler olası replikatif yaşlanan hücreleri zorunda kalmamak için deneylerin başlangıcında 30
  2. Aşağıdaki denklem, PDL = log Nf nihai hücre sayısı ve (N f / N 0) / log 2 kullanılarak hücrelerin PDL hesaplayın N 0 tohumlanmış hücrelerin 21 ilk sayısıdır.
  • Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde kültür WI-38 hücreleri,% 10 Cenin Sığır Serumu (FBS),% 1 esansiyel olmayan amino asitler ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir.
  • % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş DMEM içinde IMR-90 hücreleri büyütün.
  • 37 ° C 'de, tüm hücrelerin büyümesine ve% 5 CO 2. sürekli hücrelerin büyümesine ve her 2 bölünmüş -% 80 kaynaşmaya - hücreler, 70 ulaştıklarında 4 d. Bir ışık mikroskobu kullanarak hücre izdiham izleyin. Bu inhibisyon temas nedeniyle hücre büyümesini etkileyebileceği için, yüksek izdiham hücreleri kaçının.
  • Sonraki bir alt-kültür ile ilgili PDL bir değişiklik olduğunda yaşlanmış hücrelerin morfolojik görünüşü için bir ışık mikroskobu altında hücrelerin izlenmesi ve için (Şekil 1 ve 2).

    • 2. DNA hasar kaynaklı Senesens

    1. Plaka hücreleri (örneğin, WI-38, IMR-90, ya da başka bir hücre tipi) seyrek bir yoğunlukta (yani ~ 300.000 hücre / 6 cm tabak) analiz türüne (protein için örneğin 6 cm tabak için uygun bir çanak / RNA kalem veya SA-β-gal ile boyama için bir 6-yuvalı tabak). ertesi gün% 60 bitişik - Genç ve (<30 PDL) çoğalan ve hücreler kabaca 50 olacak şekilde bunları plaka kullan erken geçiş hücreleri.
    2. bir vakuma bağlı bir cam pipet ile büyüme ortamı çıkarın ve 1 x fosfat tamponlu tuzlu suda (PBS) eklenerek hücreler yıkayın. İki yıkar toplam için bu adımı yineleyin. her ikisi de bir "sahte" muamele edilmiş ve bir iyonize radyasyon (IR), tedavi edilen duruma için (6 cm tabak için ~ 750 uL) ile PBS ince bir tabaka ekleyin.
    3. IR 10 Gray (Gy) tek bir doz hücreleri ortaya çıkarmak için bir gamma ışınlama kullanarak; bu en hücre hatları için tipik maruz kalmasıdır. Bir çeker ocakta, PBS kaldırmak ve büyüme ortamı ile değiştirin. Alternatif olarak, B hücreleri tedavi2 saat boyunca 20 ug / mL'de leomycin.
    4. hücreler üzerindeki her 48 -7 2 ​​saat ortam değiştirme ve gerekirse hücreleri bölme.
    5. 10 D kızılötesi tedavi sonrası - 7 yaşlanmış marker için morfolojik değişiklikler (temsilci hücre görüntüler için şematik ve Şekil 2 için bakınız Şekil 1) ve analiz için bir ışık mikroskobu altında hücrelerin izlenmesi.
      NOT: Bu protokol İR sonrası oluşan yaşlanmayı tarif eder. Yaşlanma, bleomisin (koşulları için yukarı bakınız) dahil olmak üzere diğer gerilmeler ile H2O 2 22, 23, kemoterapötik ilaçlar 24, sigara dumanı 25, transforme edici büyüme faktörü (TGF) -β1 26, 27, ve diğer yöntemler, 21 indüklenebilir , 28, 29.

    3. Boyama CelSenesans ile ilişkili β-galaktosidaz için mi

    1. Boyamadan önce, morfolojik değişiklikleri izlemek için, bir ışık mikroskobu altında hücreleri incelemek.
      Not: Yaşlanmış hücreler tipik olarak bir mil morfoloji (şematik ve temsili sonuçlar için, Şekil 2 Şekil 1) sahip çoğalan hücrelere farklı olarak, büyütülmüş ve düz edilir. Proliferatif hücreler bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir, ve IR ya da başka bir DNA'ya hasar veren madde (bakınız bölüm 2) ile tedavi edilen hücreler pozitif kontrol olarak da kullanılabilir.
    2. Ticari bir kit (Malzeme Tablo) 'den belirteçler kullanılarak SA-β-gal etkinliğini ölçmek. tüm reaktifler çözülme ve 37 ° C'ye kadar onları ısıtarak oda sıcaklığına getirin.
      1. boyama çözeltisi ve gerekli fiksatif çözeltisinin miktarını hesaplayın.
        Not: Genellikle, 1 ml hacimde, 6 gözlü plaka içinde bir kuyu için yeterlidir. Farklı plaka boyutları kullanılabilir, ancak bir 6-yuvalı plaka boyutu wel isHer bir durum için üç kopya halinde bir tahlilin gerçekleştirilmesi için L uygundur. Bu yoğunluk, genellikle hücrelerin aşırı sayıda kullanmadan saymak alan başına yeterli hücre sayısını içerir.
      2. damıtılmış su ile boyama çözeltisi 1:10 oranında seyreltin.
      3. damıtılmış su ile sabitleyici çözeltisinin 1:10 oranında seyreltin.
      4. 1 mL örneğin, X-gal, 20 mg N, N-dimetilformamid (DMF içinde X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid) içindeki bir 20x stok çözelti hazırlayın DMF). kitin kullanımını maksimize etmek için, her bir tayin için gerekli olan miktara X-gal ölçülmesi ve daha sonra erimesi için DMF hesaplanan miktarını ekleyin. Seçenek olarak ise, bir ay için bir ışık korunan bir tüp içinde 20 ° C 'de stok solüsyonu saklayın. seyreltilmesi ve X-gal solüsyonların depolanması için sadece polipropilen (opak) tüpler kullanın.
      5. 1x boyama çözeltisinin 930 uL, boyama ek A 10 uL, boyama ek B için 10 uL, 20 mg, 50 uL / ​​ml X: β-gal lekeleme solüsyonu hazırlayınDMF içinde p-gal. lekeli gereken kaç kuyu bağlı bir master miks yapın.
    3. Dikkatli bir şekilde transfer pipeti veya eşdeğeri kullanılarak hücrelerden orta çıkarın.
    4. Yavaşça PBS 1x oda sıcaklığı ile bir kez yıkama hücreleri.
    5. her bir göze, 1 mL 1x sabitleştirici çözeltisi ilave edin ve 10 boyunca inkübe - oda sıcaklığında 15 dakika.
    6. Bir transfer pipet ile sabitleştirici çözüm çıkarın.
      Not: fiksatif solüsyonu (1x),% 2 formaldehit ve% 0.2 glutar aldehit içeren ve laboratuvar güvenlik ofis tavsiyelerine göre, tehlikeli atık olarak bertaraf edilmelidir.
    7. Yavaşça 1 x PBS ile iki kez yıkama hücreleri.
    8. Tamamen PBS çıkarın ve kuyu (1 ml / oyuk, 6 oyuklu plaka) 1 x β-gal lekeleme çözeltisi ilave edilir. (Bu tamponun pH değerini düşürmek ve boyama etkileyebilir, tercihen CO2 yokluğunda) 37 ° C kuluçka makinesi içinde 48 saat - Alüminyum folyo ile tamamen plaka Kapak 24 inkübe edin.
      1. boyama için 24 saatte Hücrelerden ve leke çok açık ise, 24 saat daha inkübe edilir.
    9. İnkübasyon süresinden sonra, β-gal çözüm kaldırmak ve 1 x PBS ile değiştirin.
      NOT: Bu adım arka plan renginin bazı kaldırır görüntüleme ve ayrıca X-gal çözümün tehlikeli dökülmesini önler.
      NOT: laboratuvar güvenlik ofisinin önerilerine göre düzgün β-gal çözümü atın.
    10. 10x veya daha objektif kullanarak bir bağlı kamera ile bir ışık mikroskobu ile hücrelerin incelenmesi; SA-β-gal pozitif hücreler mavi olacaktır. Deney için fotoğrafın istenilen sayıda elde edin. SA-β-gal-pozitif hücrelerin yüzdesi sayma ise görüntülerin uygun sayıda edinmeniz (> 5) ölçümü için kuyu başına. görüntüler de her birimizin içinde çeşitli görüş alanlarından örtüşmeyen olduğundan emin olun.
    11. toplam hücre sayısına karşı hücreleri SA-β-gal pozitif (mavi) sayısınıSA-β-gal pozitif hücrelerin yüzde hesaplamak için. koşul başına> 100 hücreleri sayın.
      NOT: Temsili resimler de rakamlar kullanılabilir. Çok fazla sayıda hücre zor her hücreyi ayırt etmek ve çok az sayıda ölçümü ve istatistikleri için hücrelerin yeterli sayıda vermeyebilir yaptıkça, o hücre confluency sayma hücreleri ise kritiktir unutmayın. .jpeg dosyaları da uygun olmasına rağmen, .tiff dosyaları olarak kaydedilir eğer yayın için rakamlar için Resimler iyi çözünürlükte altındadır. Renkli görüntüler 300 dpi olmalıdır.

    γ-H2AX 4. Boyama hücreler

    1. 24 oyuklu bir plaka içerisinde cam lameller üzerinde Bölümler 1 ya da 2 hücreleri Plate.
    2. Ertesi gün, 1 x hücrelerin PBS ile yıkayın. Yaşlanmış hücreler lamelleri iyi yapışmaz ve kolay bir şekilde yıkama sırasında çıkartılabilir olarak, dikkatli bir şekilde yıkayın. Seçenek olarak ise, doğrudan doğruya yıkanmadan hücrelerin tespit.
    3. PBS çıkarın ve PBS içinde taze hazırlanmış% 3.7 formaldehit ile hücreleri düzeltmekOda sıcaklığında 10 dakika.
    4. çözüm çıkarın ve 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği.
    5. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile, PBS içinde% 5 FBS içinde çözelti ve blok çıkarın.
    6. 4 ° C'de 37 ° C ya da O / N, 2 saat süre ile /% 5 FBS içinde γ-H2AX (Ser139), anti-fosfo ve FITC konjugat ile PBS inkübe edin. Işıktan koruyunuz.
    7. 60 dakika - 30 arasında toplam 37 ° C 'de PBS ile 6x - 3 yıkayın.
    8. DAPI ile Leke (1 seyreltilmiş: 15.000, PBS içinde), oda sıcaklığında 10 dakika karıştırıldı.
    9. PBS ile yıkayın 3x.
    10. antifade reaktif 5 uL - Çabuk tuzları uzaklaştırmak ve 3 kullanılarak bir cam slayt üzerinde lamel monte etmek için su ile yıkanır. Seçenek olarak ise, DAPI içeren bir montaj solüsyonu kullanın.
    11. Kuru O / N olsun ve 63X ya da daha yüksek bir objektif kullanılarak bir flüoresan veya konfokal mikroskop boyanan hücrelerin görselleştirmek.
    12. Aşağıda tarif edilen yöntemlerden herhangi birini kullanarak, γ-H2AX odakları ölçmek. floresan mikroskop kullanılarak gözle ya protokol için Skoru. İdeal olarak, bizeea konfokal mikroskop. Z bölümleri al ve (Şekil 3'te gösterilmektedir çoğalan ve yaşlanmış hücrelerde γ-H2AX boyaması için temsili görüntülerinin) tespit edilebilen bütün odaklar görselleştirmek için tek bir düzlem içine aktarmak. görüntüleme yazılımı kullanılarak gözle odakları sayın; Genel olarak, ~ 100-200 çekirdek sayımı için yeterlidir.
      1. γ-H2AX pozitif odaklar hücrelerin yüzdesi ölçmek için DAPI ile boyanmış çekirdeklerin sayısı ile en az bir odak görünür ve bölme yer alır, her hücre sayısı.
      2. γ-H2AX odaklarının sayısını ölçmek için, hücre başına γ-H2AX odakları sayısı.
        Not: γ-H2AX seviyeleri yaşlanmanın neden olduğu özel bir stres veya hasara bağlı olarak değişebilir.

    SAHF markerleri 5. Boyama hücreler

    NOT: İnsan Yaşlanmış hücreler genellikle yoğunlaştırılmış DNA / kromatin nükleer bölgelere sahip olacaktır. Yaşlanmış hücrelerde, bu heterokromatik bölgeler iseBöyle E2F aile üyeleri olarak çoğalması teşvik genlerin ekspresyonunu inhibe etmek için düşünülmektedir. SAHF DAPI yeniden örgütlenmesi ile görselleştirilebilir; Histon H3 (H3K9Me2 ve H3K9Me3) üzerinde Lys9 di- ve tri-metilasyon içeren heterokromatin ilişkili histon işaretleri, varlığıyla; ve HP1 heterokromatin protein 1 (HP1) de dahil olmak üzere kromatin tekrar organize proteinler ile, HIRA (histon represör A) ve ASF1a (anti-susması işlevi-1a) 30 kromatin için. SAHF OIS modellerinde 30 daha belirgin olduğu gibi biz bir onkogen kaynaklı yaşlanmasının modeli (OIS) kullanmayı tercih etti. IDH4 hücreleri nedeniyle SV40 büyük T antijeninin varlığı deksametazon varlığında prolifere ancak orta 31 deksametazon çıkarılmasından sonra yaşlanmış hale gelir. SAHF DAPI lekelemesi ve yukarıda listelenmiş olan spesifik belirteçleri karşı antikorlarla boyama ile saptanabilir. Burada, visualizat DAPI ve H3K9Me2 lekelenmeye açıklamakhücreler 28 SAHF iyon.

    1. % 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 1 ug / ml deksametazon ile takviye edilmiş DMEM içinde IDH4 hücreleri büyütün. yaşlanmayı uyarmak için, deksametazon çıkarın ve kömür-boşaltılmış FBS içeren, böylece orta değiştirmek; Bu yeni ortamda 10 gün ~ artan sonra, IDH4 hücreler 31 yaşlandı.
    2. Levha IDH4 hücreleri veya Bölüm 1 ya da 2 hücreleri, 24 oyuklu bir plaka içerisinde cam lameller üzerinde, yukarıda tarif edildiği.
    3. Ertesi gün, 1 x hücrelerin PBS ile yıkayın. Yaşlanmış hücreler lamelleri iyi yapışmaz ve kolay bir şekilde yıkama sırasında çıkartılabilir olarak, dikkatli bir şekilde yıkayın. Seçenek olarak ise, doğrudan doğruya yıkanmadan hücrelerin tespit.
    4. PBS çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde taze hazırlanmış% 3.7 formaldehit ile hücrelerin tespit.
    5. 1x PBS ile hücreler 3 kez yıkayın.
    6. çözelti çıkarın ve 5 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 Triton X-100 hücreleri geçirgenliği.
    7. 1x hücreleri yıkayınPBS. PBS çıkarın ve% 3 BSA içeren bloke edici tampon ilave lamelleri blok (ağırlık / hacim) oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde. Her zaman parçacıklı maddeleri çıkarmak için kullanmak BSA önce içeren çözeltiler filtre.
    8. Bloklama tamponunu çıkarın ve anti-H3KMe2 antikorları gibi SAHF belirteçleri karşı primer antikorlar ile hücrelerin inkübe (Şekil 4; ayrıntılar için Materyaller Tablo). bloke edici tampon içinde antikorlar seyreltilir ve 1 boyunca inkübe - oda sıcaklığında 2 saat.
    9. Primer antikor solüsyonu çıkarın ve% 1 PBS içinde (hac / hac) Triton X-100 ile lamelleri 3 kez yıkayın.
    10. Tampon (Malzeme Tablo) bloke ikincil antikorlar seyreltilir ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Işıktan koruyunuz.
    11. 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi: DAPI ile boyama (PBS içinde 15.000 Malzeme bakınız Tablo 1 seyreltilmiş).
    12. Lameller 1x PBS ile 3 kez yıkanır.
      1. Çabuk tuzları uzaklaştırmak için su ile yıkanır, birantifade reaktif 5 uL - nd 3'ü kullanarak bir bardak slayt Her lamel monte edin. Seçenek olarak ise, DAPI içeren bir montaj solüsyonu kullanın.
      2. Kuru O / N olsun ve 63X ya da daha yüksek bir objektif (Şekil 4 'de Örnek Sonuçlar bakınız) kullanılarak, bir flüoresan veya konfokal mikroskop boyanan hücrelerin görselleştirmek. Bölüm 4'te tarif edildiği gibi SAHF ölçmek.
        Not: (diğer bir deyişle, tek başına ikincil) İzotip kontrol birincil antikorlar veya birincil antikor immünofloresan boyama için bir negatif kontrol olarak kullanılır.

    6. immünoblotlama ile senesans ile ilişkili proteinlerin analiz

    NOT: Yaşlanmış fenotip, p16 INK4a, p21 ve p53 dahil olmak üzere hücre döngüsü düzenleyicileri, yukarı regülasyonu ile karakterize edilir. Bu protokol hücre lizatlarında bu proteinlerin seviyelerinin ölçümü anlatacağız. Bu teknikler çeşitli kullanılarak indüklenen yaşlanmayı değerlendirmek için kullanılabiliryöntemler 21, 28, 29.

    1. Bölümler 1 ve 2 'de ya da başka bir yöntemi 21, 28, 29 kullanılarak tarif edildiği gibi hücre yaşlanmasının neden. (RNA izolasyon talimatları için Bölüm 7) 6 cm tabaklarda hücreleri plaka ve aynı zamanda, protein ve RNA hem de analiz, hücresel yaşlanma işaretlerini analiz etmek.
    2. hücre kültürü ortamı çıkarın. buz bir tepsi hücreleri koyun.
      1. Soğuk 1x PBS ile hücreler 2 kez yıkayın. prosedür için kullanılan miktarlar açısından olarak hassas olacak şekilde, tüm PBS aspire sağlamak için çanak yatırın.
      2. PBS, son yıkama aspire edildikten sonra, çanak (6 cm tabak) soğuk 1 x PBS, 200 uL ekleyin. bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri Pençe.
      3. RNA izolasyonu için bir RNaz içermeyen bir tüp içine hücre / PBS karışımı pipetle. Al yaklaşık 150 &# 181; yeni bir tüpe bu karışıma ve pipetle bu L. Bu tümböleni protein analizi için kullanılan, dolayısıyla her bir tüpten aynı miktarda pipetle mutlaka olacaktır.
    3. 75 ekleyerek Hücreleri, - modifiye 2x Laemmli numune tamponu (60 mM Tris-HCI pH 6.8,% 12.5 gliserol,% 2 SDS,% 5 β-merkaptoetanol (BME) ve mavi bromofenol 100 uL; olarak yapılmış olabilir büyük bir toplu, şişelere doldurulur ve -20 kullanıma kadar ° C) ya da eşdeğer bir numune tampon C'de saklandı.
      1. hücre artıklarının ayrılması için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15,000 x g'de liziz tamponu ve santrifüj 100 uL - Alternatif olarak, 75 hücreleri lize. Temiz bir tüp içine süpernatant ve pipet çıkarın. Bir Bradford protein deneyi ya da denk bir protein deneyi proteinin eşit yükleme sağlamak için lizatları üzerinde kullanılabilir.
        Not: Protein deneyleri numune tamponu içerisinde lizlendi numuneler üzerinde gerçekleştirilemez.
      2. lizat ~ 25 mcL çıkarın ve 2x numune tamponu 15 uL ekleyin. yukarı Pipet ve donumune tamponu içinde wn hücreleri lize etmek için.
        Not: liziz tamponu ya da örnek tamponu Birimleri hücre izdiham bağlı olarak ayarlanabilir. Örnek, nükleer lizlenmesine "yapışkan" ise, sulandırmak için daha fazla örnek tampon veya PBS ilave edin. Numuneler, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
    4. bir% 18 Tris-Glisin jeli üzerinde 5, bir sıcaklıkta bir blok üzerinde, 95 ° C'de min (veya eşdeğer ekipman) ve yük numune tamponu içerisinde lizlendi numunenin ~ 40 uL için numune kaynatın.
      NOT: gradyan jel (% 4-15) ya da bir% 14 Tris-Glisin jel aynı zamanda düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin tespit edilmesi için yeterlidir. akrilamid jeller farklı türleri de kullanılabilir, fakat jel ve sistem, düşük molekül ağırlıklı proteinlerin tespit edilmesi için yeterli olduğundan emin olmak edilebilir.
      1. (Istifleme jeli içinden), 20 dakika boyunca sabit bir 100 V 1x çalışan tamponu kullanılarak çalıştırın ve boya cephesinin, sadece kapalı çalışır veya jel altındaki yani ~ 180 V'de 60 dakika jel Monitör düşük molekül, böylece ağırlıklı proteinler r yokjel kapalı un.
    5. bir PVDF membrana akrilamid jel aktarın (aktif hale getirmek için% 100 metanol ile önceden ıslatılmış). ıslak transferi yaparken, yalnızca 1 saat (1.75 saat proteine ​​normal karşı) aktarımı için gereklidir. Uygun transfer sistemi için buna göre ayarlama; Önceden boyanmış molekül ağırlık belirteçler kullanılarak transfer verimi belirlenmesine yardımcı olabilir.
    6. Suda membran yıkayın. örneklerin eşit yükleme izlemek için bir Ponceau lekesi kullanın. Su ile kapalı Ponceau yıkayın.
      1. çalkalama ile 4 ° C'de, oda sıcaklığında ya da O / N C'de 1 saat süreyle TBST içinde% 5 yağsız kuru süt içine bir zar (50 mM Tris-HCI pH 7.5, 150 mM NaCI ve% 0.1 Tween-20) bloke eder.
    7. Yıkama TBST ile bir kez leke ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt TBST (seyreltici ve antikor önerileri malzemeleri Tabloya bakınız) içinde seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.
    8. TBST ile iki hızlı yıkama yapın ve daha sonra ~ toplam ~ 30 dakika (ile bir çalkalama düzenine iki kez, her 15 dk yıkamah).
    9. Oda sıcaklığında 40 dakika için bir ikincil antikor ile inkübe edin. Adımı tekrarlayın 6.10.
    10. taze Western blot substratın ile inkübe ve film geliştirmek ya da bir kemiluminesan okuyucusunda okuyun.
    11. İlk p16 INK4a antikorları ile Prob immünoblot (Şekil 5). su ile 15 dakika, 0.2 N NaOH ile 15 dakika, ve su ile 15 dakika boyunca inkübe edilerek, membran şerit. Anti-p21 antikorları kullanılarak Aşama 6.9 ile devam ediniz.
    12. sökme çözeltisi, 50 mL başına taze eklenmiş BME 300 uL 62.5 mM Tris-HCl pH 6.8 ve% 2 SDS kullanılarak membran şerit.
    13. 30 dakika için 50 ° C'de inkübe edilir ve daha sonra TBS ile TBST ile iyice yıkayın. Protein yükleme kontrolleri anti-aktin ya da anti-GAPDH antikorları ile Prob (Şekil 5, tipik sonuçlarını göstermektedir).
      NOT: p53 seviyeleri de aynı zarlar üzerinde değerlendirilebilir. P53 daha yüksek bir molekül ağırlığı olduğu, ancak, daha iyi (daha düşük yüzdeli jeli üzerinde giderilip ör       % 10 Tris-Glisin veya gradyan jel (% 4-15)). diğer yaşlanma belirteçlerin protein seviyeleri de γ-H2AX ve SAHF belirteçleri immünoblot lizatları ile değerlendirilebilir.

    7. Yaşlılık İşaretlerinin mRNA seviyelerini analiz

    Not: RNA izole ederken, çalışma yüzeyleri RNaz kaldırma çözeltiler veya bir eşdeğeri ile temizlenir sağlamak ve malzeme tüm RNaz içermeyen olduğu.

    1. Aşama 4.2 hücre / PBS karışımı kullanılarak, 30 s için RNA ekstraksiyonu çözeltisi ve girdap solüsyonu 1 mL (hiçbir görünür kümeleri veya hücresel döküntü olmalıdır).
    2. 200 ul kloroform eklenir ve 15 saniye boyunca kuvvetli bir şekilde çalkalanır.
    3. 4 ° C'de 15 dakika boyunca maksimum hızı (> 15,000 xg) santrifüjleyin.
    4. En RNA, sulu tabakanın ~ 400 uL çıkarmak ve yeni bir mikrofüj tüpüne içine pipetle.
    5. ve PR 4 uL (toplam önceki aşamada pipetle sulu tabaka hacmi ile 1: 1) izopropanol 400 mcLRNA, tabakasına ecipitant.
    6. maksimum hız (> 15,000 xg), 15-30 dakika ve 4 ° C'de santrifüj pelet RNA için.
    7. Süpernatantı ve% 75 buz soğukluğundaki etanol 1 ml.
    8. maksimum hız (> 15.000 x g'de) ve 4 ° C 'de 1 dakika süre ile santrifüje.
    9. maksimum hız (> 15.000 x g'de) ve 4 ° C 'de, 1 dakika için supernatant ve santrifüj çıkarın.
    10. 2 dakika için olası ve kuru hava kadar sıvıyı Pipet.
    11. 10x DNaz tamponu 10 uL, H2O 85 uL yeniden askıya ve DNase 1 5 uL.
    12. 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
    13. 200 uL NT2 tamponu (50 mM Tris-HCI pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, ve% 0.05 Nonidet P-40) ilave edilir ve asit fenol-CHCl 2 alt tabakanın 300 uL ekleyin.
    14. maksimum hızda 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 dakika ve santrifüj vorteksleyin (> 15,000 xg).
    15. Üst RNA tabakası (2 x 125 uL) 250 uL toplama, 25 eklemek3 M sodyum asetat pH 5.2,% 100, buzla soğutulmuş etanol 625 uL ve çökeltici 5 uL uL. İyice karıştırın ve -20 ° C 'de O / N hızlandırabilir.
    16. Sonraki gün, karıştırmak ve maksimum hızı (> 15,000 xg) ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ve süpernatant atılır.
    17. Tekrarlayın 6.8-6.11 adımları tekrarlayın.
    18. kullanılana kadar -80 ° C'de nükleazsız su ve mağaza 12 uL pelet yeniden askıya.
      NOT: Diğer RNA izolasyonu prosedürleri ve kitler de kullanılabilir.
    19. rastgele heksamerlerie ters transkripsiyonu gerçekleştirin ve SSII üreticinin protokolüne ters transkriptaz.
      Not: yaşlanmış hücrelerden izole edilmiş RNA grupları en düşük miktar göz önüne alındığında, ters transkripsiyon sentezi için RNA (12 uL) her kullanmak en iyisidir. Seçenek olarak ise, RNA, bir spektrofotometre kullanılarak kantifiye edilebilir ve RNA'nın eşit miktarlarda ters transkripsiyon için kullanılabilir.
    20. kantitatif qPCR (RT-qPCR) amplific gerçek zamanlı kullanılarak mRNA düzeylerini analizasyon ve gen spesifik primerler ile SYBR yeşili PCR ana karışımı.
      1. Tipik bir RT-qPCR reaksiyonunda olduğu gibi, (Rnaz / DNase içermeyen su içinde) cDNA, 1:30 seyreltin ve daha iyi pipetleme doğruluğu için gerçek zamanlı 96 oyuklu plakaya 3 uL ekleyin. gen spesifik ileri bir reaksiyon ana karışımı hazırlamak ve geri primerler (2.5 uM konsantrasyon, 5 uL / ​​reaksiyon ekleme), SYBR yeşili PCR karışımı (6.25 uL / ​​reaksiyon, üreticinin tavsiyesine göre daha az kullanın) ve RNase 5.75 uL / 20 uL (primerler / SYBR yeşili / su 17 uL ve cDNA 3 uL) içindeki bir son reaksiyon hacmi için DNase içermeyen su.
      2. Gerçek zamanlı PCR makinesi kullanılarak RT-qPCR büyütmesi gerçekleştirmek; üreticinin protokolünü takip edin.
        Not: bir ileri doğrulanmış insan listesi ve gerçek zamanlı geri primerler Tablo 1 'de bulunabilir. Bu genler SASP proteinleri ve diğer senesans ile ilişkili işaretleri ve / veya genleri içerir. İR kaynaklı yaşlanma elde edilen temsilci sonuçlar gösterilmektedir Şekil 6.

    8. ükler SASP Protein Düzeyleri

    1. Bölüm 1 ya da 2 ya da başka bir yöntemi kullanarak kullanılarak yaşlanmayı uyarma. (~ 250,000 hücre / 6 cm plaka veya ~ 650.000 / 10 cm plaka) yukarıda tarif edildiği gibi, 6 veya 10 cm tabaklarda, hücreler plaka.
    2. Ya 6 cm ya da 5 ml için (2.5 mL hücreleri, 10 d sonrası İR tedavisi veya replikatif yaşlanmış hücrelerde (ve uygun kontrol hücreleri) ile, 1 x PBS ile hücreler üç kez yıkayın ve küçük bir hacme antibiyotiklerle serumsuz ortam ilave 10 cm).
    3. Bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde CO2 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir ve% 5. Ertesi gün, orta toplamak ve buz üzerinde konik tüp içine koyun.
    4. PBS ile hücreler 2 defa yıkanır ve daha sonra (6 cm tabak) tripsin 1 ml. Daha sonra hücre sayısı uygun konsantrasyonlarda ayarlamak için bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın.
    5. Santrifüj 300 x g, 5 dakika boyunca ortam.
    6. filter, ortam, bir 0.45 mikron şırınga filtresi kullanılarak.
    7. şirketinden ELISA veya eşdeğer tahliller kullanılarak kullanım veya deneye kadar -80 ° C 'de orta ve dondurarak kısım.
    8. Toplanan ortamın toplam hücre sayısı / hacminin alınması ile / mL konsantrasyonda hücre sayısını hesaplayın.
    9. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir enzim-bağlantılı ümmünozorbent deneme (ELISA) ile gerçekleştirin. IL-6, IL-8, GROa, ve diğer sitokinler / kemokinler (Şekil 6B) için tahlil edilmesi için tavsiye edilen ELISA kitleri için malzemeler Tablo bakınız.
    10. ölçülür faktörler ELISA kiti lineer aralığında olmasını sağlamak için, proliferasyon hücre ortamına kıyasla yaşlanmış hücre ortamının dilüsyonları yapmak. Bu seyreltiler ve IL-6 miktarının hesaplanması hacmi için hesap. günde hücre başına salgılanan IL-6 miktarı elde etmek için, ml başına seyreltilmiş hücre konsantrasyonu başına (pg) kitinden elde edilen IL-6 değerini hesaplamak (from adım 7.8).
      NOT: sitokin dizileri gibi diğer yöntemler, SASP protein seviyelerini tespit etmek için kullanılabilir ve SASP faktörlerin büyük sayıda taranması için de uygun olabilir. SASP faktörlerin protein seviyeleri senesans indüksiyonu, hücre tipi veya neden olduğu yaşlanma türü sonra zamana göre değişiklik gösterebilir.

    Sonuçlar

    , 6 SA-β-gal ile boyama temsil edici sonuçlar göstermektedir - 2 Şekil γ-H2AX ve SAHF için boyama; p16 INK4a, p21 ve p53 protein seviyelerinin değerlendirilmesi; ve mRNA ve yaşlanmış ilişkili moleküllerin protein seviyeleri. Artan SA-β-gal boyaması replikatif ve DNA hasarı ile indüklenen yaşlanma ile ortaya çıkar. Ayrıca, yaşlanma ile ortaya morfolojik değişikliklerini izleyin. Hücreler, çoğalan fibroblastların mil g...

    Tartışmalar

    Burada, insan diploid fibroblastlarının kullanılarak replikatif ve DNA hasarına neden olduğu yaşlanma için yöntemler tarif etmişlerdir. Buna ek olarak, protein ve çeşitli senesans ile ilişkili proteinlerin mRNA seviyelerini ölçmek için teknikler, aynı zamanda boyama SA-β-gal ve DNA hasarına işaret γ-H2AX için edilmektedir. Birçok nokta vivo 20 yaşlanmayı karakterize etmek için mevcut olmakla beraber bu protokoller yaygın in vitro ve in vivo...

    Açıklamalar

    Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

    Teşekkürler

    Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri İntramural Araştırma Programı, Ulusal Yaşlanma Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca eleştirel el yazması okumak için yaşlanma ve kotb Abdelmohsen ilgili birçok yararlı tartışmalar için Myriam Gorospe ve kotb Abdelmohsen teşekkür etmek istiyorum. Biz de eleştirel el yazması okumak için, özellikle Douglas Dluzen bizim laboratuvar üyelerine teşekkür.

    Malzemeler

    NameCompanyCatalog NumberComments
    16% Tris-glycine gelsInvitrogenXP00160BOX
    Acid-Phenol ChCl3AmbionAM9720
    Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibodyInvitrogenA110311:300 dilution
    Cell liftersCorning Inc.3008Cell scraper
    ECL anti-mouse HRP linked antibodyAmershamNA931V
    ECL Plus Western Blotting SubstratePierce32132ECL
    DAPIMolecular ProbesMP01306stock 5 mg/mL in dH2O
    GAPDH antibodySanta Cruzsc-322331:1,000 - 5,000 dilution
    GlycoBlueAmbionAM9515
    Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibodyAbcam12201:500 dilution
    Human IL-6 Quantikine ELISA assayR&D systemsD6050
    Human IL-8 Quantikine ELISA assayR&D systemsD8000C
    Human GROa Quantikine ELISA assayR&D systemsDRG00
    N-N-dimethylformamide SigmaD4551DMF
    p16 monoclonal antibodyBD Biosciences51-1325gr1:500 dilution
    p21 monoclonal antibodyMillipore05-3451:750 dilution
    p53 monoclonal antibodySanta Cruzsc-1261:500 dilution clone DO-1
    phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibodyCell Signaling97191:2,000 dilution
    POWER SYBR-green PCR master mix Applied Biosystems4367659
    Pre-stained molecular weight markersBiorad161-0374
    ProLong Gold Antifade InvitrogenP36930
    PVDF membrane Thermo Scientific88518
    Senescence β-Galactosidase Staining KitCell Signaling9860
    TRIzolAmbion/Life Tech10296028

    Referanslar

    1. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
    2. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
    3. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
    4. Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
    5. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
    6. Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
    7. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
    8. Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
    9. Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
    10. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
    11. Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
    12. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
    13. Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
    14. Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
    15. Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
    16. Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
    17. Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
    18. Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
    19. Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
    20. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
    21. Rubio, M. A., Kim, S. -. H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
    22. Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
    23. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
    24. Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
    25. Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
    26. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
    27. Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
    28. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
    29. Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
    30. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
    31. Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
    32. Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
    33. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
    34. Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
    35. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
    36. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
    37. Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
    38. Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
    39. Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
    40. Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
    41. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
    42. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
    43. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
    44. Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
    45. Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
    46. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
    47. Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16 (2010).

    Yeniden Basımlar ve İzinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

    Izin talebi

    Daha Fazla Makale Keşfet

    Cellular BiologySay 123Ya lanmaSASP SA galH2AXp16p21p53IL 6SAHFDNA hasarYa l l k

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Bize Ulaşın

    KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

    JoVE HABER BÜLTENLERİ

    Araştırma

    Eğitim

    Yazarlar

    Kütüphaneciler

    JoVE Hakkında

    Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır