Terapötik Antikorlar Arasındaki Hedef Bağlanma ve CDC İndüksiyonunu Karşılaştırmak İçin İn Vitro Yöntemler: Biyoeşdeğerlik Analizindeki Uygulamalar

Özet

Bu protokol, rituksimab iki önemli fonksiyonel özellikleri in vitro karşılaştırmasını tarif: hedef bağlanma ve tamamlayıcıya bağlı sitotoksisite (CDC) indüksiyonu. yöntem, referans rituksimab ve rituksimab biyobenzerin arasında bir yan-yana karşılaştırma için kullanılmıştır. Bu tahliller, biyobenzer geliştirme sırasında veya üretimlerinde bir kalite kontrol olarak kullanılabilir.

Özet

Terapötik monoklonal antikorlar (mAb), kanserler de dahil olmak üzere farklı patolojilerin tedavisi için önemlidir. İlaç şirketleri tarafından biyobenzer mAb'lerin gelişimi bir pazar fırsatıdır, ancak aynı zamanda uyuşturucunun erişilebilirliğini artırmak ve terapi ile ilişkili maliyetleri azaltmak için bir stratejidir. Burada detaylandırılan protokoller, Daudi hücrelerinde rituksimab ile hedef bağlanma ve CDC indüksiyonunun değerlendirilmesini tanımlamaktadır. Bu iki işlev antikorun farklı yapısal bölgelerini gerektirir ve rituximab'ın indüklediği klinik etkiyle ilişkilidir. Protokoller, bir referans rituksimabın ve piyasaya sürülen rituksimab biyosimerlerinin yan yana karşılaştırılmasını sağlar. Değerlendirilen ürünler hem hedef bağlama hem de CDC indüksiyonunda farklılıklar gösterdi; bu, alttaki fizikokimyasal farklılıkların bulunduğunu ve klinik ortamdaki bu farklılıkların etkisini analiz etme ihtiyacının altını çizdi. Burada bildirilen yöntemler basit ve ucuz in vitro </ Em> rituximab biyosimilar aktivitesinin değerlendirilmesi için modeller. Bu nedenle, biyo-benzeri gelişim sırasında biyoeşdeğer üretimin kalite kontrolünde yararlı olabilirler. Dahası, sunulan yöntemler diğer terapötik mAb'lara ekstrapole edilebilir.

Giriş

Terapötik antikorlar kanser, oto bağışıklık ve kronik hastalıklar, nörolojik hastalıklar ve diğerleri ¹ de dahil olmak üzere, farklı patolojilerin tedavisi için geliştirilmiş rekombinant monoklonal antikorlar (mAb'ler) bulunmaktadır. Şu anda FDA 40'dan fazla terapötik mAb'lere onayını veren ve daha sonraki yıllarda pazara ulaşması bekleniyor.

Rituksimab CD20 ⁺ B hücreli non-Hodgkin lenfoma (NHL), CD20 ⁺ foliküler NHL, kronik lenfositik lösemi, ve romatoid ^{artrit, 2, 3} tedavisi için onaylanmıştır yüksek afiniteli bir kimerik monoklonal IgG1 antikoru. rituksimab tarafından B hücrelerinde aşırı eksprese olan CD20 tanınması, apoptozu indükler; kompleman aktivasyonu; ve antikora bağlı hücre aracılı sitotoksisite (ADCC) ^3. Bu ilacın patent 2013 ve 2016 yılında ABD'de, Avrupa'da ve süresi dolmuş, sırasıyla. Böylece, dünya çapındaki ilaç firmaları rituximab biyosimilar geliştiriyor. İnsan tüketimi için diğer herhangi bir ilacın olduğu gibi, biyosimilarlar da düzenleyici kurumların onayını gerektirir. Uluslararası yönergeler, mAb'ler için yeni ve referans ürünlerin fiziko kimyasal özellikleri, farmakokinetiği, etkililiği ve emniyetini karşılaştırarak biyolojik benzerliğin gösterilmesi gerektiğini göstermektedir.

Buna göre, bu karşılaştırmalarda kullanılan metodolojiler mAb'lerin yapısal ve işlevsel özelliklerini, özellikle de klinik önemi olanları değerlendirmelidir. Bu amaçla, in vitro deneyler in vivo deneylere kıyasla birçok avantaj sağlar (Chapman ve ark. Gözden geçirilir) ⁵ : i) in vitro çalışmalar önerilen biyobenzer ile referans ürün arasındaki farklara daha duyarlıdır; Ii) in vivo çalışmalar ilgili türlerde yapılmalıdır, ki bu birçok mAb içininsan olmayan primatlar; ve iii) hareket mekanizması, klinik öncesi toksikoloji ve referans ürün ile ilgili klinik etkileri itibaren de ek yararlı bilgiler sağlamayabilir biyobenzerlerin ile in vivo çalışmalar, bilinmektedir. Buna göre, biyobenzerleri için Avrupa Birliği'nin Rehberlik adayları vitro verilere yalnız ^6'da sağlam dayalı klinik deneylere girmek için izin verir.

Burada, CD20 ⁺ kültürlü hücreleri kullanılarak rituksimab biyolojik aktivitesini değerlendirmek iki hızlı, ekonomik ve basit deneyleri sunuyoruz. Bu tahliller, rituksimab Biyobenzer adaylar için karşılaştırılabilirlik çalışmasının bir parçası olarak dahil edilebilir.

Protokol

1. Hedef Bağlamanın Akış Sitometresi ile Değerlendirilmesi

1. Biyolojik materyal ve reaktiflerin hazırlanması
   1. % 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu (H-IFBS) ile takviye edilmiş 500 mL RPMI kültür ortamı yapın.
   2. Kültür Daudi Burkitt'in Lenfoma (Daudi) hücreleri ve Daudi GFP ⁺ hücreleri RPMI ve 75 cm2 kültür şişeleri kullanıyor. Kültürleri 37 ° C'de% 5 CO ₂ nemlendirilmiş atmosferde 6 - 9 x 10 ⁵ hücre / mL'ye ulaşıncaya kadar muhafaza edin.
   3. PBS içinde 1/100 H-IFBS seyrelterek 50 mL boyama tamponu yapın; Bu tampon, 2-8 ° C'de en az bir ay boyunca kararlıdır.
   4. Referans ve biyoeşdeç mAb'ler için test çözümlerini hazırlayın. 5 μg / mL'den başlayarak, boyama tamponunda on 1: 2 seri dilüsyon (her biri 500 μL) yapın.
   5. Boyama tamponunu, insan IgG'sini (izotip kontrolü) 5 μg / mL'ye ve PE-Cy5 fare anti-insan IgG'sini (ikincil antikor) sulandırmak için kullanınÜreticinin önerdiği santrasyon.
   6. PBS (fiksasyon tamponu)% 4 paraformaldehid hazırlayın.
2. Hedef ciltleme
   1. 75 cm2 kültür şişelerinden Daudi ve Daudi GFP ⁺ hücre süspansiyonlarını toplayın ve bunları 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 5 dakika boyunca 400 xg'de santrifüjleyin.
   2. 5 mL PBS ekleyerek ve 400 xg'de hücre süspansiyonunu 5 dakika santrifüj ederek hücreleri yıkayın.
   3. PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon ve tripan mavi ile bir hücre sayısı ve canlılık analizi yapın. Analiz için hücre canlılığı seviyeleri ≥% 95 olan kültürleri kullanın.
   4. Hücre süspansiyonunu soğuk boyama tamponu ile 4 x 10 ⁶ hücre / mL'ye seyreltin.
   5. 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde, referans veya biosimilar mAb'lerin farklı test konsantrasyonlarına 100 uL hücre süspansiyonu 50 μL ekleyin. Her deneysel durum için tekrarlar ekleyin.
   6. Ek tüpler hazırlayın.izotip kontrol (yerine rituksimab insan IgG1) ve negatif kontrol (birincil antikor olmayan ikincil antikor).
   7. 30 dakika - 20 boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   8. 1 ml PBS ilave edilerek ve 10 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj hücreleri yıkanır. Süpernatant atılır.
   9. ikincil antikor, 100 uL hücreler süspansiyon halinde tutulur ve 20 için inkübe -, ışıktan korunarak, 4 ° C'de 30 dakika.
   10. PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve sabitleme tampon 200 uL onları askıya alın.
   11. bir akış sitometresinde hücreleri analiz edin.
       Not: örnekler 4 ° C sıcaklıkta saklanan ve ışıktan korunan eğer sinyal birkaç gün sabit kalır.
3. Veri toplama
   1. işletim yazılımının akış sitometresinin bir çalışma sayfasında Açık iki nokta araziler. Birinci ve ikinci SSA-A karşı FSC A FSC H karşı FSC bir dizi. PE-Cy5 kanalı için bir histogram açın.
   2. FSC-A ve FSC-H arsalarında, singlet olaylarını seçerek bir geçit (R1) oluşturun ( Şekil 1A ).
   3. R1 popülasyonunu FSC-A'ya karşı SSA-A nokta-grafiğine ayarlayın ve sonra hedef hücreleri seçerek yeni bir kap (R2) yapın ( Şekil 1B ). Hücrelerin frekans dağılımını görmek için R2 popülasyonunu PE-Cy5 yoğunluk histogramında ayarlayın.
   4. Negatif ve izotip kontrolü ( Şekil 1C ) kullanarak PE-Cy5 kanalı için alt floresans yoğunluğu (FI) sınırını ayarlayın.
   5. Referans ürünün daha yüksek konsantrasyonda örneklemden R2 içerisinde 10.000 olay elde edin. Bu numunenin FI'sı beklenen en yüksek değer olmalıdır ( Şekil 1C ).
   6. Geri kalan örnekleri alın.
   7. Her örnek için, PE-Cy5 kanalında ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) elde edin.
   8. Referans veya biosimilar mAb'si olan numuneler için, MFI ile izotip kontrolünün (ΔMFI) arasındaki farkı hesaplayın.

2. CDC'nin Değerlendirilmesi

1. Biyolojik materyal ve reaktiflerin hazırlanması
   1. Yukarıda açıklandığı gibi hücre kültür ortamı ve kültür Daudi ve Daudi GFP ⁺ hücreleri hazırlayın (adım 1.1.1 - 1.1.2).
      NOT: Ek olarak, CDC tahlili serumsuz RPMI'yi gerektirir.
   2. Serumsuz RPMI ile normal insan serum tamamlayıcısı (NHSC) 1: 2 seyreltin. 2.5 mL hazırlayın.
   3. RPMI ile 1: 2 seyreltilmiş 1 mL ısı ile inaktive (30 dakika / 56 ° C) NHSC hazırlayın.
   4. Serumsuz RPMI'de referans ve biyolojik olarak benzer mAb'ler için test setleri hazırlayın. 1 ila 0.025 μg / mL arasında on seyreltme (her biri 200 mcL) yapın.
2. CDC tahlili
   1. Kültürlerden Daudi ve Daudi GFP ⁺ hücrelerini toplayın ve hücre yaşayabilirliğini ölçün (adım 1.2.1 - 1.2.3'e bakın).
   2. Serumsuz RPMI'de 4 x 10 ⁵ hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.
   3. Eklemek96 pozitif konik (V) alt tabaka mikrofazarda her bir referansın 50 μL'sine 50 uL hücre süspansiyonu veya biosimilar mAb test konsantrasyonu. Her deneysel durum için tekrarlar ekleyin.
   4. Negatif kontrol ( yani mAb olmadan), bazal ölüm kontrolü ( örn., MAb varlığında ısı ile inaktive edilmiş NHSC) ve pozitif kontrol lekesi için ek kuyucuklar hazırlayın ( örn., 50 μL% 70 EtOH maruz bırakılan hücreler).
   5. Hücreleri,% 5 CO ₂ nemlendirilmiş atmosferde 37 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin.
   6. Her oyuğa 50 mcL NHSC (1: 2 oranında seyreltilmiş) ilave edin ve opsonize edilmiş hücreleri 37 ° C'de 2.5 saat süreyle% 5 CO ₂ nemlendirilmiş atmosferde inkübe edin. Bazal ölüm kontrol kanallarında ısı ile inaktive NHSC'yi kullanın.
   7. 10 dakika boyunca 400 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
   8. 150 uL PBS ekleyerek ve 400 xg ve 10 ° C'de 5 dakika süreyle hücre süspansiyonunu santrifüj ederek hücreleri yıkayın. DiSüpernatant scard.
   9. Daha önce ^{7, 8} tarif edildiği gibi, 7-aminoactinomycin (7-AAD) ile örnekleri leke.
   10. Aynı gün bir akış sitometresinde hücreleri analiz edin.
3. Veri toplama
   1. işletim yazılımının akış sitometresinin bir çalışma sayfasında Açık iki nokta araziler. 1.3.3 (Şekil 2A-B) - adımda 1.3.1 içinde olduğu gibi araziler ayarlayın. R2 nüfusa 7-AAD karşı GFP için bir nokta-komplodur üçüncü arsa oluşturun.
   2. Daudi hücreleri kullanılarak yeterli FI sınırlarını tanımlar, Daudi, GFP ⁺ hücreleri ve ölüm pozitif kontrol (Şekil 2C).
   3. Her bir örnek için, 7-AAD ⁺ hedef hücrelerin yüzdesini ölçer. R2, en az 5000 olayları elde edin.
   4. Farklı olan örneklerde bulunan yüzde bazal ölüm kontrol 7-AAD ^{+ 'nın} yüzdesi çıkarılarak spesifik mAb kaynaklı sitotoksisiteyi hesaplamak( Şekil 2D ).

3. Biyoeşdeğerlik Analizi

1. Konsantrasyon ve yanıt değerlerini bir grafik yazılımına girin.
2. Grafikler üretin ve aşağıdaki hatalarla doğrusal olmayan regresyonları hesaplayın: i) mAb konsantrasyonunun log dönüşümünü "X" olarak kullanın; Ii) değişken eğim matematiksel modelini kullanın (Y = minimum tepki + (maksimum tepki - minimum tepki) / 1 + 10 ^ ((LogEC ₅₀ -X) * tepe eğimi)); Ve iii) bazal tepki çıkarıldığından taban değerlerini sıfıra sınırlayın.
   NOT: Simetrik sigmoidal şekle sahip eğrilerin olması beklenir.
3. Hem doğrusal olmayan uyumu F-testi (birçok grafik yazılım programı, bu özelliği içerir) kullanarak küresel uyumu ile karşılaştırın.
   NOT: Bu tür testler, maksimum yanıt, logEC ₅₀ ve Hill eğiminin, iki veri kümesi için aynı olduğu ve bu kütle ile uyuşan boş hipotez oluşturmaktadır.Ele alınması amaçlanan biyolojik soru.

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak, bağlanma hedef ve referans rituksimab CDC indüksiyon Asya'da üretilen biyobenzer rituksimab o ve ticari olarak temin edilebilen paralel olarak karşılaştırıldı.

Daudi hücreleri, her iki mAb de, konsantrasyona bağlı bir şekilde (Şekil 1D) CD20 bağlandı. Bağlanma verilerinin doğrusal olmayan regresyon referans ve biyobenzer rituksimab, sırasıy...

Tartışmalar

Terapötik mAb'nin patent sona ermesi, biyosimilarların gelişimini desteklemektedir. Dolayısıyla, bu ürünlerin klinik olarak ilgili faaliyetlerindeki farklılıkları belirleyebilen basit yöntemlere ihtiyaç vardır. CD20 ⁺ kültürlü hücreler rituximabın iki önemli fonksiyonel özelliğinin değerlendirilmesi için kullanılmıştır: hedef bağlama ve CDC indüksiyonu. Önceki aktivite, CD20'nin mAb'nin Fab bölgesi tarafından tanınmasını gerektirirken, sonuncusu esasen Fc bölges...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.