JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu el yazması karmaşık yüksek maliyetli İmkanları için gerek kalmadan içbükey microwells imalatı, sağlam bir yöntem sunar. Manyetik kuvvet, çelik boncuk ve bir delik aracılığıyla dizi kullanarak, birkaç yüz microwells 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat kuruldu.

Özet

Bir küresel kültür bir in vivosağlar hücresel davranış anlamak için yararlı bir araçtır-üç boyutlu ortamda gibi. Yapışkan olmayan yüzeyleri, değer değiştirici şişeler, asılı damla ve microwells hücre hücre etkileşim, bağışıklık-harekete geçirmek, eleme, uyuşturucu çalışmalarda kullanılan gibi çeşitli küresel üretim yöntemleri kök hücre farklılaşması ve organoid üretimi. Bu yöntemler arasında microwells üç boyutlu bir içbükey geometri ile bilim adamları ve mühendisleri üniforma ölçekli küresel üretimi ve hangi ile bireysel pulcuklarının yanıt olabilir kolaylığı kendi avantajları göz önüne alındığında, dikkatini kazanmıştır sınıf başkanı. Esnek membranlar ve litografi buz kullanımı gibi düşük maliyetli yöntemler teklif etmiş olsa bile, bu tekniklerin desen boyutlarını kontrol zorluk başarı yüksek boy oranları ve üretim gibi ciddi sakıncaları uğramak microwells daha geniş alanları. Bu sorunların üstesinden gelmek için karmaşık yüksek maliyetli İmkanları için gerek kalmadan içbükey microwells imalatı için sağlam bir yöntem öneriyorum. Bu yöntem bir 30 x 30 delik aracılığıyla dizi, birkaç yüz mikrometre-sipariş çelik kullanır boncuk ve Manyetik kuvvet 900 microwells 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrat olarak imal etmek. Hücre biyolojik uygulamalar için bizim yöntem uygulanabilirliği göstermek için biz yağ kök hücreleri 3 gün boyunca kültürlü ve başarıyla pulcuklarının bizim microwell platformu kullanarak üretti. Buna ek olarak, biz bir tertibatla simülasyon sayede Manyetik kuvvet yoluyla deliklere çelik boncuk tuzağa düşürmek için kullanılan mekanizma, araştırmak için gerçekleştirilen. Biz uyuşturucu tarama, doku yenilenmesi, kök hücre farklılaşma ve kanser metastaz gibi birçok küresel tabanlı hücresel çalışma için önerilen microwell imalat yöntemi uygulanan olabilir inanıyoruz.

Giriş

Küresel forma yetiştirilen hücrelerin bir iki boyutlu düzlemsel kültür1' den daha gerçek vücut dokularında benzer. Bu avantaj göz önüne alındığında, pulcuklarının kullanımı çalışma hücre-hücre etkileşim2,3, bağışıklık-harekete geçirmek4,5ve farklılaşma6eleme ilaç geliştirmek için kabul edilmiştir. Ayrıca, birden çok hücre tipleri birleşmeyle pulcuklarının son zamanlarda insan geliştirme ve hastalık7eğitim için çok yararlı olan organoids (yakın-fizyolojik üç boyutlu (3D) doku) uygulanmış olan. Pulcuklarının üretmek için çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Öyle ki birbirimizi ve form pulcuklarının hücreleri toplamak en basit yöntem bir yapışkan olmayan yüzey kullanımını içerir. Petri kabına sığır serum albümin, pluronic F-127 veya onun yüzey yapıştırıcı89yapmak bir hidrofobik polimer (örneğin Poli 2-hydroxyethl metakrilat) ile tedavi edilebilir. Değer değişimi-flask yöntemi pulcuklarının10,11büyük miktarda üreten başka bir iyi bilinen yoludur. Bu yöntemde, hücre süspansiyon onları belgili tanımlık substrate bağlı olma önlemek için karıştırma tarafından tutulur. Bunun yerine, kayan toplamak için form pulcuklarının hücreleri. Yapışkan olmayan yüzey yöntemi ve spinner şişesi yöntemi pulcuklarının büyük miktarda üretebilir. Ancak, küresel boyutu yanı sıra izleme kontrol ve her küresel izleme zorlukları da dahil olmak üzere sınırlamalara tabi bunlar. Böyle bir sorun, başka bir küresel üretim yöntemi, için bir ilaç olarak yani, asılı bırak yöntemi istihdam12olabilir. Bu hücre süspansiyon damla kültür çanak kapağı alt üzerine yatırma içerir. Bu damlalar genellikle 15 ila 30 µL boyutunda ve yaklaşık 300-3000 hücreleri13içerir. Kapağı ters zaman damla yüzey gerilimi tarafından yerinde tutulur. Mikrogravite ortamı içinde her damla tek pulcuklarının ücretsiz sıvı-hava arabirim oluşturan hücreler, yoğunlaşmaktadır. İdam faydaları bırakma yöntem vardır izlemek ve her küresel olmayan yapışkan yüzeyi ve spinner şişesi yöntemleri göre izlemek kolay iken iyi kontrollü boyutu dağıtım sunar. Büyük üretim pulcuklarının ve üretim süreci aşırı emek olmasıdır Ancak, bu yöntem bir dezavantaj maruz kalırsa yoğun.

Bir düz microwell dizidir plaka birçok mikro büyüklükteki wells ile her 100 1000 µm arasında değişen bir çapa sahip. Microwells kullanırken küresel üretim ilkesi olmayan yapışkan yüzey yöntemi için benzer. Microwells öyle ki bu da her tek küresel izlemek kolaylaştırırken küresel boyutunu kontrol etmek kolaydır hücreleri veya pulcuklarının, ayırmak için microwells arasında boşluk sağlamak gerçek yararları. Microwells büyük bir sayı ile yüksek üretilen iş küresel üretim de mümkündür. Form wells seçeneğine farklı şekiller microwells başka bir avantajdır (lokma somun, silindirik, trigonal Prizmatik) bağlı olarak kullanıcıların benzersiz deneysel amaçlar. Genellikle, ancak, üç boyutlu (3D) içbükey (veya hemisferik) şekli tek pulcuklarının üniforma ölçekli üretim için en uygun olarak kabul edilir. Bu nedenle, içbükey microwells kullanışlılığı bu embriyonik kök hücre14, cardiomyocyte farklılaşma incelenmesi gibi birçok hücre biyolojisi Etütler adacık hücre insülin salgılanmasını kümeleri15, bildirilmiştir enzimatik aktivite tetkikine16ve ilaç direnci tümör pulcuklarının17.

Ne yazık ki, sık sık microwells imalatı özel micropatterning İmkanları gerektirir; Plazma ve iyon-kiriş ekipmanları reaktif iyon-gravür tabanlı yöntemleri gerekir klasik fotolitografi tabanlı yöntemler maruz kalma ve gelişmekte olan özellikleri gerektirir. Bu tür ekipman hangi, karmaşık üretim süreci ile birlikte mikroteknoloji erişimi değil biyologlar için giriş yüksek bir engel sunar maliyetlidir. Bu sorunların üstesinden gelmek için düşük maliyetli diğer yöntemler gibi (donmuş su damlacıkları kullanarak) litografi18 buz ve (bir membran, delik aracılığıyla substrat ve bir vakum kullanarak) esnek zar yöntemi14 önerdi. Ancak, bu yöntemler de desen boyutları, yüksek boy oranları kazanma ve daha büyük alan microwells üretimini denetlemek zor olduğu gibi ciddi sakıncaları uğramak.

Yukarıdaki sorunları aşmak için bir delik aracılığıyla substrat, çelik boncuk ve bir mıknatıs dizi roman içbükey microwell imalat yöntemi önerilmektedir. Bu yöntemi kullanarak, içbükey küresel microwells yüzlerce Manyetik kuvvet yoluyla kendi kendine kilitlenen metalik boncuk (şekil 1) mekanizmasının yararlanarak fabrikasyon. İmalat süreci çok az pahalı ve karmaşık özellikleri kullanımını gerektirir ve birçok gelişmiş beceriler talep etmez. Bu nedenle, hatta vasıfsız kişilerin kolayca bu imalat yöntemi üstlenebilir. Önerilen yöntem göstermek için insan yağ elde edilen kök hücre pulcuklarının üretmek için içbükey microwells içinde kültürlü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. delik aracılığıyla dizi alüminyum plaka ve mıknatıs dizi hazırlanması

  1. İki 50 mm x 50 mm hazırlamak (veya büyük) alüminyum levha. Her plaka kalınlığı boncuk çapı yarısı 300 µm yapıldı.
  2. 30 x 30 delik aracılığıyla dizi bir alüminyum levhalar üzerinde Φ550-µm mikro matkap Dalma oranı ve 8000 RPM iğ hızı ile 30 mm/s ile CNC döner engraver kullanarak oluşturur. Her deliğin (merkezi-Merkezi) arasındaki uzaklığı 1 mm (Şekil 1a ve şekil 2a, ben) yapıldı.
  3. 1.2 (Şekil 1a ve şekil 2a, II) açıklanan olarak aynı yordam kullanılarak diğer alüminyum plaka üzerinde Φ750-µm delik aracılığıyla 30 x 30 dizisi oluşturur.
  4. İki tabak birbirlerine bir bant kullanarak eklemek ve Φ3 mm hizalama delik her iki alüminyum levha dört köşesine oluştururlar.
  5. Alüminyum levha % 15 sülfürik asit onların maksatlı 12 h için emmek. Alüminyum oksit alüminyum yüzeyinde ince bir tabaka yapmak beri bu korozyona dayanıklı, delik çapı ve plaka kalınlığı bu asit tedavisi tarafından değiştirilmez.
  6. 1 x 1 x 1 mm neodymium mıknatıslar 30 × 30 dizi (ile 0.363 N bir manyetik gücü) oluşturur. Her mıknatıs komşusu için Ters polarite olduğundan emin olun. Kırılma veya mıknatıs dizi saçılma önlemek için çift taraflı bant (şekil 2a, III ve iç metin içinde Şekil 2) kullanarak mıknatıs dizi dibinde bir 30 x 30 mm alüminyum plaka ekleyin.

2. boncuk yakalama işlemi

  1. Hizalama ve iki alüminyum tabak yığını (top plaka: 750 µm delik plaka, alt plaka: 550 µm delik plaka) hazırlanan hizalama delik her plaka (Şekil 1b) dört köşesine kullanarak.
  2. İki tabak birlikte hizalama deliklere M3 cıvata ekleyerek kilit ve sonra fındık (Şekil 1b) ile cıvata güvenli.
  3. Alüminyum plaka derleme (Şekil 1b, 2bve 2 c) hazırlanan mıknatıs dizisinde yığını. Mıknatıslar dizi ve dizi alüminyum plaka deliklerden yığın işlemi sırasında hizalayın. O zaman bir yapışkan bant mıknatıs dizinin konumunu düzeltmek için kullanın.
  4. Φ600 mm SUJ2 çelik yeterli sayıda tabak derleme boncuk ve boncuk bir akrilik (veya metalik olmayan) kullanarak işlemek yere plaka böyle bir boncuk her deliğin (şekil 1 c, 1 dve 1e) aynı anda tuzak olur ki delikler açılmış değil aşırı boncuk kaldırılıyor.
  5. Dikkatli bir şekilde istenmeyen saçılma ve çıkık kapana kısılmış boncuk (şekil 1f) önlemek için üst plaka çıkarın.

3. içbükey microwell imalat

  1. Adımları 2.1 2.5, yukarıda, Petri kabına için üretilen içbükey microwell kalıp taşıyın.
  2. Bir PDMS monomer ile polydimethylsiloxane (PDMS) monomer ve üreticinin yönergeleri19 göre kür Ajan Mix: Ajan oranı 10:1 kür.
  3. PDMS karışımı de-gaz PDMS karışımı tuzağa kabarcıklar kaldırmak için bir desiccator ve vakum pompası kullanarak.
  4. Ve de-gaz tekrar 3.3 (şekil 1f) açıklanan olarak aynı yordam kullanılarak PDMS karışımı içbükey microwell kalıba dökün.
  5. PDMS karışımı bir ocağın bir boncuk gömülü PDMS substrat (şekil 1 g) oluşturmak 2 h için 80 ° C'de pişirin.
  6. Tedavi PDMS substrat kalıp (şekil 1 g) kaldırın. Kaldırma işleminde PDMS substrat kalıp üzerinden ayırmak için çamaşır şişe kullanarak metanol sprey.
  7. Bir Φ15 mm x 2 mm mıknatıs kullanarak, kapana kısılmış çelik boncuk PDMS substrat (şekil 1 h) kaldırın. Bu işlem için PDMS substrat boncukları çıkarmak için yeterince güçlü bir mıknatıs kullanılabilir.

4. küresel kültür

  1. İçbükey microwell desenli PDMS substrat Φ14 mm biyopsi yumruk kullanarak bu çalışmada 24-şey plaka takılabilir kesti.
  2. Elde edilen Φ14 mm PDMS substrat bir otoklav Sterilizatör 121 ° C ve 15 psi içinde sterilize.
  3. Steril PDMS substrat 24 iyi tabak yerleştirin.
  4. Hücre eki microwell yüzeye önlemek için %4 (w/v) pluronic F-127 solüsyonu ile gecede tüm PDMS substrat kat. Kaplama işlemi sırasında herhangi bir hava kabarcıkları içbükey microwells pipetting veya bir ultrasonik temizleyici kullanarak entrapped kaldırın.
  5. F-127 çözüm üç kez fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) kullanarak floş.
  6. 1 mL (2 x 106 hücreler içeren) hücre-orta (Dulbecco'nın modifiye kartal orta) çözeltisi PDMS substrat üzerine tohum. Not tohumlama yoğunluğu hedef küresel boyutu ve/veya hedef hücre tipi göre değiştirilebilir. Burada, yağ kaynaklı kök hücreleri (ASC) kullanılmıştır.
  7. 1 mL microwells (şekil 3), değil hapsolmuş aşırı hücreler kaldırmak için 1000 µL pipet kullanarak orta Aspire edin.
  8. Hücreleri 36.5 ° c, nem oranı, kuluçkaya > % 95 ve % 5 CO2 durumu. Bizim çalışmada kullanılan ASCs söz konusu olduğunda, bir küresel 48 h için hücreleri toplamak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir dışbükey kalıp ve microwell desen başarıyla aşağıdaki adımlarla 2.1-3.7 fabrikasyon. (Şekil 4). Ticari çelik boncuk 30 x 30 delik aracılığıyla dizisinde kapana kısıldın. Boncuk boncuk ve karşılık gelen aracılığıyla-delikleri (şekil 4a) arasında herhangi bir boşluk olmayan sıkı bir şekilde yapıldı. Fabrikasyon içbükey microwell şeklinde olduğunu içbükey yarımküresel, 600 µm, çapında...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu imalat yöntemi önündeki büyük sorunu alüminyum plaka delik aracılığıyla dizideki boncuk güvenli sabitleme yapıldı. Bu sorunu çözmek için manyetik kuvvet 30 x 30 mıknatıs dizi şeklinde boncuklar güvenli, rakamlar 6 ve 7gösterildiği gibi düzeltmek için kullanıldı. Manyetik akı yoğunluğu Ters polarite vardır, mıknatıs dizinin her mıknatıs yüzey merkezinde en güçlü olduğu. Manyetik kuvvet gücünü akı yoğunluğu üzerinde bağlıdır çünkü bonc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı, ICT ve Gelecek Planlama (NMK-2014R1A1A2057527 ve NATO Mukabele Gücü-2016R1D1A1B03934418) tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
CNC rotary engraverRoland DGAEGX-350
Micro drill bitHAM Präzision30-1301 TAΦ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%Daejung7683-4100For cleaning aluminum plate.
Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnetSupermagneteW-01-N1 x 1 x 1 mm
Bearing ballAgami ModelingSUJ2Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)DowcorningSylgard 184
Pluronic F-127Sigma Aldrichp2443Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)ATCC30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)ATCC30-2200
Fetal bovine serumATCC30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cellsATCCATCC PCS-500-011

Referanslar

  1. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).
  2. Djordjevic, B., Lange, C. S. Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy. Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).
  3. Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes. J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).
  4. Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions. Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).
  5. Zhang, X., et al. Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing. Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).
  6. Kim, B. C., et al. Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell. Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids. Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).
  9. Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).
  10. Nyberg, S. L., et al. Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver. Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).
  11. Lazar, A., et al. Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel. In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  13. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  14. Choi, Y. Y., et al. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).
  15. Hwang, J. W., et al. Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array. Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).
  16. Wong, S. F., et al. Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model. Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).
  17. Yeon, S. E., et al. Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model. PloS one. 8 (9), (2013).
  18. Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network. Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).
  19. Corning, D. Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).
  20. Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds. Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).
  21. Choi, J. S., et al. Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure. RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).
  22. Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique. Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).
  23. Lai, D., et al. Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography. RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).
  24. Pan, J., et al. Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography. J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).
  25. Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells. J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 131i b key microwellk reselManyetik kuvvetboncukdelik arac l yla diziMicrowell dizim knat s dizi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır