bir<em&gt; In vitro</emTüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Öngören Caseum Bağlanma Testi

Özet

Burada pulmoner tüberküloz lezyonlarından ve boşluklardan alınan kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçmek için hızlı bir denge diyaliz (RED) yöntemi anlatılmaktadır. Protokol, aynı zamanda, kaseum için etkili bir vekil olan köpüklü makrofaj kaynaklı bir matriste de kullanılır.

Özet

Tüberküloz hastalığının ortadan kaldırılması, kompleks pulmoner lezyonların çok katmanına nüfuz edebilen ilaç rejimleri gerektirir. Çukurların ve lezyonların kazeöz damarlarındaki ilaç dağılımı, özellikle persistan olarak da adlandırılan uyuşturucuya dirençli bakterilerin alt popülasyonlarını barındırdığı için çok önemlidir. Tüberküloz lezyonlarında ilaç penetrasyonunun ölçülmesine ilişkin mevcut metotlar, biyoanalitik veya görüntüleme teknikleriyle birleştirilen yüksek maliyetli ve zaman alan in vivo farmakokinetik çalışmaları içerir. Kozmetik makromoleküllere bağlanan ilacın in vitro ölçümü, bu tür teknikler için bir alternatif olarak önerildi çünkü bu bağlanma, ilaç moleküllerinin kaseum yoluyla pasif difüzyonunu engelledi. Hızlı denge diyalizi plazma proteini ve doku bağlama çalışmalarında hızlı ve güvenilir bir sistemdir. Bu protokolde, kazanın homojenatlarına ilaç bağlanmasını ölçmek için hızlı denge diyaliz (RED) cihazı kullandık.Tüberküloz ile enfekte tavşanların lezyonlarından ve boşluklarından türetilmiştir. Protokol ayrıca, kaseum yerine kullanılacak lipid yüklü THP-1 makrofajlarından bir vekil matrisi nasıl oluşturulacağını açıklar. Bu kaseum / vekil bağlanma testi, tüberküloz ilaç keşfi için önemli bir araçtır ve lezyonlarda veya apselerde diğer hastalıkların yol açtığı ilaç dağılımının araştırılmasına yardımcı olmak için uyarlanabilir.

Giriş

akciğer tüberkülozu hastalığının tedavisi lezyonlar farklı içine ilaç etkin dağıtım gerektirir. Nekrotik lezyonlar ve boşluklar ilaç toleranslı veya 'kalıcı' bakteri alt-popülasyonunu liman peynir merkez içerir. ^{1, 2} kaviter hastalık alt kür oranları ve kötü prognoz ile ilişkilidir. ^{3, 4} önceki çalışmalar caseum nüfuz kabiliyeti önemli ölçüde bir ilaç sınıfı diğerine değişir, nicel ve görüntüleme teknikleri kullanılarak, göstermiştir. ^{5, 6} Ancak bu yöntemler, yavaş ve zahmetlidir hayvan enfeskiyon modellerinden kullanılmasını gerektirir. Ex vivo olarak caseum bağlanma ilaç ölçen bir in vitro deney tasarlanmıştır. Bu ters nedenle, peynir granülomada ilaç nüfuzunun ile ilişkili ve bulunmuştur bağlanma, birTahmin edici bir araç olarak kullanılmıştır. ⁷

Dengeleme diyalizi, plazma protein bağlama çalışmalarına altın standart yaklaşım olarak görülür. Hızlı denge diyalizi (RED) cihazı, bu tür testleri gerçekleştirmek için hızlı, kullanımı kolay ve güvenilir bir sistem sağlar. ⁸ Cihaz iki bileşenden oluşur: yarı geçirgen zarın dikey bir silindiri ile ayrılmış 2 hazneden oluşan tek kullanımlık, tek kullanımlık uçlar; Ve aynı anda 48 ek parça tutabilen tekrar kullanılabilir taban plakaları. Diyaliz membranı, ilaç-makromolekül bağlama çalışmaları için ideal olan 8 kDa moleküler ağırlıklı bir kesime (MWCO) sahiptir. Membran kompartmanının yüksek yüzey alanı / hacim oranı, hızlı diyaliz ve dengeleme sağlar. Hem ekler hem de taban plakası, asgari spesifik olmayan bağlanma için onaylanmıştır. RED cihazının biyoanalitik tekniklerle kombinasyonu, ilaçların bağlanmamış fraksiyonlarının kesin tahminlerini plasma. ^{8 , 9}

Başlangıçta plazma protein bağlanmasını ölçmek için tasarlanmış olmasına rağmen, RED cihazı homojenatları kullanarak çeşitli doku bağlama çalışmalarında kullanılmıştır. ^{10 , 11} Bu protokolde, tüberkülozla enfekte tavşanların nekrotik lezyonlarından ve boşluklarından eksize edilen nekrotik çöpler, kaseum ile ilacın bağlanmasını ölçüyoruz. Caseus materyalinin asellüler ve non-vascular özelliği, tahlil ile uyumlu homojen bir süspansiyona homojenleştirilmesini kolaylaştırır.

Kaseum üretmek için sıkıcı ve zor gelmesi nedeniyle, protokol de köpüklü makrofajlardan hazırlanan bir vekil matris ile kullanım için onaylanmıştır. THP-1 monosit türevi makrofajlar, onlara 'köpüklü' görünüm veren çoklu lipid cisimcikleri biriktirmek için oleik asit ile indüklenir. Bu lipit yüklü hücreler hasat edilir veBiz caseum için bir ikame olarak kullanmak, bir matris üretmek üzere işlenir. Bu çalışma, bu taşıyıcı matris etkin bir granülomlar ve boşlukların peynir çekirdek ilacın nüfuz etmesine engel in vivo işlemi taklit caseum bağlanma ile iyi bir korelasyon ile bağlanan ilaç göstermiştir.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları NIAID Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (NIH), Bethesda, MD onayı ile Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca gerçekleştirilmiştir. M. tuberculosis içeren tüm çalışmalarda biyo-güvenlik tutucu seviye 3 (BSL-3) ile birlikte bir laboratuarda gerçekleştirilmiştir.

1. Tavşan Enfeksiyon Modeli ve Caseum Koleksiyonu

1. Daha önce tarif edildiği gibi bir sadece burundan bir aerosol uygulama sistemi kullanılarak Yeni Zelanda M. tuberculosis ile beyaz tavşan Infect. ^{12, 13} enfeksiyon 12-16 hafta boyunca ilerlemeye izin verin. Oturaklı 35 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin kas içinden, birlikte tavşan 0.22 ml / kg pentobarbital sodyum ve fenitoin sodyum ile tavşan damar ötenazi ve nekropsilerden devam edin.
2. cımbız ve bir neşter kullanılarak, göğüs ca akciğerleri kaldırmakvity. Her akciğer lobundan, bir neşter yardımıyla bireysel boşlukları ve geniş nekrotik granülomları inceleyin. Kaseyi dikkatli bir şekilde boşluk ve granülom duvarlarından kazıyın. 2 mL vidalı kaptaki tüpleri tartın, kaydedin ve depolayın -20 ° C'de kullanıma hazır oluncaya kadar saklayın.
3. Kuru buz üzerinde 3 MegaRad'de bulaşıcı kazein örneklerini gamma radyasyona maruz bırakarak onları bir bulaşıcı olmayan ve güvenli bir BSL-2 laboratuarında kullanın.

2. THP-1 Hücrelerinden Kaseum Vekilinin in vitro Üretimi

1. T175 hücre kültürü şişeleri (80 mL / şişe) içinde RPMI 1640 ortamında (2 mM L-glutamin ve% 10 sığır fetüsü serumu) THP-1 monositleri büyütün. Şişeleri 37 ° C'de% 5 CO ₂ atmosferinde 3-4 gün inkübe edin.
2. Kültürü, 150 xg'de iki 50 mL konik tüp içinde T175 bir şişeden 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve 10 mL RPMI 1640 ortamda pelet askıya alınız.
3. 45 uL t içeren 1.5 mL tüp içine bu kültürden 5 μL pipetleMavi rippan. Pipetleme ile iyice karıştırın. 10 μL'lik bir hemositometreye aktarın ve canlı bir THP-1 monosit sayısını (renklendirilmemiş) bir ışık mikroskopu (10X büyütme) kullanarak sayın. Kültür mL başına canlı hücrelerin sayısını hesaplayın. RPMI ortamı ile 1.25 x 106 hücre / mL nihai yoğunluğa kadar seyreltin.
4. Büyük bir hücre kültürü plakasına (50 x 10 ⁶ hücre / tabağa) 40 mL kültür yükleyin. 40 uL 100 uM PMA (etanol içinde hazırlanmış forbol 12-miristat 13-asetat) ilave edin ve hücrelerin inkübatöre gece boyunca yapışmasına izin verin.
   NOT: PMA'nın nihai konsantrasyonu 100 nM'dir.
5. Saf oleik asit (OA) (0.89 g / mL), 0.1 M konsantrasyonunda etanol içinde ( yani , 968.3 uL etanolde 31.7 μL OA) seyreltin. Bu çözeltiyi taze önceden ısıtılmış RMPI ortamında 10 mM'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin. Bu OA süspansiyonunu önceden 37 ° C'ye ısıtılmış RPMI ortamında 0,4 mM'ye (son çalışma konsantrasyonu) seyreltin.
6. Mevcut medyayı çıkarın veYapışmış hücreleri hücre kültür plakalarından hafifçe ilave edin ve THP-1 makrofajlarına (THP-M) 40 mL 0.4 mM OA ekleyin. Gece inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
7. Her bir THP-M'de sayısız lipid cesedi kapanımının varlığını teyit etmek için 40x büyütmede hafif bir mikroskop kullanın. Hücre kültürü plakalardan tüm RPMI orta çıkarın ve 50 ml serolojik pipet kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) ile yapışkan hücreleri hafifçe yıkayın.
   NOT: THP-M'nin sitoplazmasındaki lipit cisimler küçük, net, küresel yapılar olarak görünür.
8. PBS içinde 40 mL 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) her bir tabağa ilave edilir. 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
9. Köpüklü makrofajları (FM), 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak tüm plakanın yüzeyinde tekrar tekrar pipetleme ile ayırın. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 150 xg'de aşağı doğru döndürün.
10. 10 mL PBS (üçüncü PBS yıkama) içinde hücre topağını tekrar süspansiyon haline getirin.nd önceden tartılmış 15 mL'lik konik tüplere aktarın. 5 dakika boyunca 150 x g hızında tekrar Spin. Dikkatle bir serolojik pipet ve imha edilmesini kullanarak süpernatant aspire.
11. hücreler lize edildi ve matris proteinleri denatüre etmek için 20-30 dakika süreyle 75 ° C'de inkübe etmek 3 dondurma-çözme döngüsüne FM pelet Konu. Kullanım için hazır olana kadar -20 ° C 'de pelet saklayın.

3. hızlı bir dengeleme Diyaliz (kırmızı) Deneyi

1. dimetil sülfoksit tüm test bileşikleri (DMSO) içinde 10 mM stok çözelti hazırlayın. Her bir deney öncesinde DMSO içinde çözüm çalışan 500 uM'ye seyreltilir.
2. caseum vekil pelet içeren tüp tartılır. tek başına pelet ağırlığı elde etmek için boş bir borunun ağırlığı çıkarılır. (: Ağırlık / hacim 1: 9), her matrisin 10x seyreltilmiş süspansiyonu elde etmek için caseum veya PBS ile taşıyıcı matris bozabilir 1 dakika / dakika 1200 vuruş bir doku homojenleştirici kullanılarak, tüp başına 2-3 metal boncuk ekleyin ve.
3. 500 6.5 uL başakΜM solüsyonu, 5 uM (≤% 1 DMSO) nihai konsantrasyonunu elde etmek için 643.5 uL homojenata ve vorteks içine yerleştirin.
4. KIRMIZI insertleri taban plakasına yerleştirin. Her alıcı bölmesine her RED girişi ve 350 μL PBS verici bölmesine (kırmızı halka) ilaç-spiked matris 200 mcL ekleyin. Her bir test bileşiği için üç eklenti hazırlayın (üçlü örnekler). Plakayı yapışkan plakalı bir conta ile yapıştırın ve 4 saat boyunca 200 rpm'de (1 xg) termomiksör üzerinde 37 ° C'de inkübe edin.
5. Kuluçka işleminden sonra verici ve alıcı odalarının içindekileri hafifçe 2-3 defa yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Donör odalardan 20 μL'lik homojenat kısımları pipetleyin ve 1.5 mL'lik bir tüpe (1: 1) 20 μL temiz PBS ekleyin. Benzer şekilde, alıcı odalardan PBS örnekleri 20 mcL alikotları pipetle ve temiz homojenat (matris eşleme) 20 mcL ekleyin. ⁸
   NOT: Matris eşleştirme işlemi,Kantitatif analiz için yapılacak 2 ayrı kalibrasyon eğrisi (homojenat ve PBS'de) için. Donör odasının içeriği zamanla sedimantasyon yapabilir. Alikotları çıkarmadan önce içeriğini pipetle hafifçe karıştırın.

4. LC-MS Niceleme ve Veri Analizi

1. Her bir tüpe 500 ng / mL diklofenak veya 10 ng / mL verapamil (iç standart) içeren 160 uL 1: 1 metanol: asetonitril ekleyin ve proteinleri çökeltmek için girdap ekleyin. Çökeltiyi tortu haline getirmek ve süpernatantları sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LCMS) analizi için 96 oyuklu derin plakalara aktarmak için 5 dakika boyunca 10,000 xg'de santrifüjleyin. ⁷
2. Yukarıdaki numunelerle aynı matris bileşimini koruyarak, her test bileşiği için 1-1000 nM'den kalibrasyon eğrileri oluşturun. Bir LC-MS yöntemi kullanarak verici ve alıcı odalarından alınan numunelerdeki test bileşiğinin konsantrasyonunu hesaplayın.
3. Bağsız fraksiyonu hesapla ( f _u ) of denklem 1 kullanılarak seyreltilmiş matris içinde ilaç denklem 2 (D = 10 seyreltme faktörü) kullanılarak seyreltilmemiş matris içinde f _u hesaplayın. ¹⁴
   
   
4. stabilite / metabolizma / spesifik olmayan bağlanma konularla bileşimleri belirlemek için Denklem 3 kullanılarak her bileşiğin kurtarma (kütle dengesi) kontrol edin.
   NOT: Kurtarma tipik% 70 ve% 130 arasında düşer. ¹⁵
   

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, yüzlerce tüberküloz ilaç geliştirme bileşiğini penetran kaseumda tahmin edilen etkinlikleri için test ettik. Şekil 1 , RED testinin temel kavramlarını görüntüler. RED eklentilerinin diyaliz zarları bağlanmamış kük moleküllerin donör kuyudan alıcı kuyusuna dağılmasına ve son olarak da her iki bölme arasında denge elde edilmesine olanak tanır. Proteinler veya lipidler gibi makromoleküllere bağlı olan küçük molek?...

Tartışmalar

Tüberkülozla enfekte hastalarda pulmoner nekrotik lezyonlar ve boşluklar, ilaç tedavisine dirençli bakteri alt popülasyonlarını içerir. Bu yapıların kazeöz çekirdeği, özellikle, bu persisörleri ekstraselüler bir ortamda barındırmaktan sorumludur. Anti-bakteriyel maddelerin bu uzak yerlere olumlu dağılımının tüberküloz ilaç etkinliğinin önemli bir belirleyicisi olduğuna inanılmaktadır. Bu protokolün onaylanmasından önce, konstitüsyonel lezyonlarda ilaç keşfi bileşiklerinin dağılı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
New Zealand White Rabbits	Covance	-
HN878 Mycobacterium tuberculosis	BEI Resources	NR-13647
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N	Henry Schein Animal Health	56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution	Virbac	710101
THP-1 monocytic cell line	ATCC	ATCC TIB-202
175 cm² TC-Treated Flask (T175)	Fisher Scientific	T-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamine	Fisher Scientific	MT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated	Fisher Scientific	SH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200 mM	Fisher Scientific	SH3003401
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented	Fisher Scientific	T-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Fisher Scientific	BP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	E6758
Oleic acid	Fisher Scientific	ICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base Plate	Fisher Scientific	PI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box	Fisher Scientific	PI-89809
Pierce RED insert removal tool	Fisher Scientific	89812
Adhesive plate seal	Fisher Scientific	08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)	Life Technologies	10010-049
DMSO	Sigma	472301
Acetonitrile	Sigma	34998
Methanol	Sigma	34860
Verapamil hydrochloride	Sigma	V4629
Diclofenac sodium salt	Sigma	93484
Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher Scientific	15-250-061
Ethanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-451
2010 Geno/Grinder	SPEX SamplePrep	2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads	Fisher Scientific	15-340-158
484R Cobalt 60 Irradiator	JL Shepard	7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers	Fisher Scientific	22-600-100
Upright Light Microscope	Leica	DM1000
Binary Liquid Chromatography system	Agilent	1260	Multi-compenent
Mass spectrometer	AB Sciex	4000