Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem.

Özet

Böcek hücreleri hazırlamak ve onları mCD1d tetramers üreten rekombinant mCD1d proteinand üretimi amacı bakülovirüs ile enfekte Bir Yöntem.

Özet

CD1 proteinler antijen sunan moleküllerin üçüncü sınıf oluşturmaktadır. Onlar noncovalently beta2-mikroglobulin ile ilgili yaklaşık 50 kDa glikozile ağır zincir olarak ifade edilen hücre yüzey glikoprotein. Bu lipidler ziyade peptidler bağlanır. Kendi yapısı MHC sınıf I ve sınıf II antijen sunan moleküllerin CD1 proteinlerin benzerlik teyit rağmen, mCD1d oluk nispeten dar, derin ve son derece hidrofobik ve klasik için açıklanan birkaç sığ cepleri yerine iki bağlayıcı cepleri var MHC antijen sunan moleküller kodlanmış. Kendi amino asit dizilerinin dayanarak, böyle bir hydrobphobic oluk lipid antijenlerin bağlanması için ideal bir ortam sağlar.

Doğal Öldürücü T (NKT) hücreleri, bağlı veya CD1d tarafından sunulan glikolipitler tanımak için kendi TCR kullanın. CD1 tarafından sunulan lipidler reaktif T hücrelerinin otoimmün ve bulaşıcı hastalıklara karşı koruma ve tümör rejeksiyon dahil edilmiştir. Böylece, CD1-reaktif NKT hücre yanıtı belirlemek, arındırmak ve izlemek için yeteneği büyük önem taşımaktadır. CD1d alfa Galactosyl seramid (a-Galcer) tetramers nesil NKT hücreleri biyoloji önemli bir anlayışa sahiptir. Diğer CD1 molekülleri inşa Tetramers de üretilen edilmiş ve bu yeni reaktifleri lipid tabanlı aşılara yanıt izlenmesinde potansiyel kullanımı ile büyük ölçüde ve otoimmün hastalıklar ve diğer tanı, lipid-reaktif T hücrelerinin fonksiyonları bilgi genişlettik tedaviler.

Protokol

I. Hücreler Çözülme

TN5 hücreler dondurulmuş flakon alın ve 37 ° C su banyosu içinde çözünme. 25cm ² TC balon böcek Express orta 5ml (Invitrogen, katalog numarası 10486) ekleyin. Hızlı beş Glutamin olmadan geldiğini unutmayın; 100X glutamin kalem strep veya 1 lt medya tek başına Glutamine 10ml eklemek gerekir. TN5 hücrelerin içine ekleyin ve 30 dakika boyunca 27 ° C inkübatör inkübe. Daha sonra, balonun altına bağlanan hücreleri bozmadan nazikçe DMSO ile orta aspirat. Taze orta 5ml ekleyin.

II. Yetiştirme ve Hücreler genişletilmesi

Her gün hücrelerin izleyin. Balon yaklaşık% 70 konfluent olduğunda, her iki tarafta şişesi vurarak süspansiyon hücreleri getirmek ve Böcek ifade orta ve hücre kültürü 5ml 21 ml ekleyerek 175cm ² balon hücreleri aktarmak. Her T175 şişesi, son bir birim olarak 25-30ml orta etrafında olmalıdır. Split konfluent balonuna (yaklaşık 1 milyon / ml kons.) Gerektiği şekilde 1 / 4 veya 1 / 5. Hücreleri büyümek izin vermeyin. Hücrelere bölünmüş olduğunu pasajların sayısını. Hücre lizis sonucu hücrelerin yaşlanma neden olabilir, çünkü geçit sayısı 30 üzerinde büyümeye etmeyin. 1 milyon / ml konsantrasyonda istenen birimde ulaştığınızda, hücreleri enfekte.

Ben genellikle genellikle yetmiş 175cm ² şişeler ve yaklaşık tutarı 2 ile 2,5 litre kadar büyüyebilir. 25 / 30ml balon ya da beş 1 litre Erlenmeyer şişeler ve yaklaşık. Her balona 400ml 500 ml

Not: Ya T-175 fiş mühür şişesi veya Corning Erlenmeyer şişesinin hücreleri büyüyebilir. Erlenmeyer şişeler büyüyen hücreleri daha hızlı ve kolay.

III. End Point Seyreltme Yöntemi Virüs Titering

1. Hızlı beş SFM orta 200ul düz dipli 96 plaka Plaka 3000-5000 hücreleri de ortalama. Hücreler 27 ° C'de en az 30 dakika dinlendiriniz.
2. Bakülovirüs stok seri seyreltme olun. Bir de ortalama 250ul kullanarak, 96 U alt plakası bir satır, 1 / 10 dilüsyon yapmak gerekir. Dilüsyonları Express Beş SFM ortamda yapılır.
3. Bir çok kanallı pipet kullanarak farklı dilüsyonları sabit tutar (genellikle 20 ul), hücrelere aktarın.
4. 27 ° C'de 7 gün süreyle Kültür. Kenar satır buharlaşmasını önlemek için, parafilm ile plaka kenarları sarın.
5. 7 gün sonra, plaka kontrol ve virüs seyreltme% 50 enfeksiyon verir belirlemek bu virüs konsantrasyonu az yarım kuyu bulaşmış). Sonra pfu / ml (pfu-plak oluşturan birim) cinsinden ifade edilir titresi hesaplamak için bir formül kullanabilirsiniz. En bakülovirüs kılavuzları formül bulundu.

IV. Hücrelerini enfekte

Bu virüs Tam titresi bilmek çok önemlidir. Virüs gerekli miktarda ekleyin. Viral stok hazırlanması için hücreleri değil, daha Yüksek İçişleri Bakanlığı viral mutasyonlar üretimine neden olur (1pfu Beş hücre 1High) 1'den Enfeksiyon Çokluk (İçişleri Bakanlığı) enfekte olmalıdır. Protein üretimi için, her zamanki miktarı MO1 5-10.

Örnek:

MCD1d bakülovirüs titresi = 1X108 pfu / ml

Ekle İçişleri Bakanlığı = 1 (virüs yükseltmek için) = 20X10 ^ 6 hücre / şişeyi / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / şişesi

İçişleri Bakanlığı = 5 - 10 (toplam protein üretimi için) 20x10 = 1ml için 2ml ^ 6 hücre / şişesi

Enfeksiyon sonrası 4. günde, enfekte olmuş hücreleri bakmak. Onlar, yüzen, şişmiş ve şekillendirme sosis müstakil olmalıdır.

V. kurtarma süpernatantlar

Enfekte şişeler orta alın ve 250ml mavi kapaklı Falcon İplik şişe transfer. Otoklavlanabilir ve yeniden kullanılabilir. 200rpm, 20 dakika, 4 ° C de eşit şişe doldurun ve Sorvall GSA rotor hücreler santrifüj Süpernatantı toplayın ve daha ileri saflaştırma için devam edin.

VI. Rekombinant mCD1d Of Arıtma

1. Diyaliz ve Konsantrasyon 150mm Sodyum Fosfat tamponu (pH 7.4)
2. Ni-NTA Agaroz Kromatografi, 150mm Sodyum fosfat 200 mM Immidazole protein mCD1d + B2M Zehir
3. Tuzsuzlaştırma sütun Immidazole, kurtulmak için 20mm Tris HCl pH8 tampon kullanarak çalıştırın
4. Kalan kirleri ortadan kaldırmak için MonoQ sütun kullanarak Anyon Değişimi Kromatografisi çalıştırın.
5. YM 30 konsantratör (Millipore) kullanarak 1mg/ml için Konsantre
   
6. , Bira enzimatik biotynlation üretici protokolü (Avidite) göre mCD1d
   
7. Serbest biotin salin (PBS), pH7.4 tamponlanmış fosfat kullanarak S200 sütunu (boyut dışlama Chromatograpy) tarafından elimine edilir. Biotynlated protein 2 ila 3 MGS ortalama 2 litre süpernatant elde edilebilir
8. A-Galcer CD1d tetramer üretimi.

A-Galcer çözünür biotynlated CD1d-b2 CD1d molekül yüklemek içinm PBS içinde% 0.5 Tween -20,% O.9 Sodyum Klorür çözünmüş bir Galcer üç kat molar fazlalığı, oda sıcaklığında bir gece inkübe edilir. Konjuge streptavidin ve oda sıcaklığında 4 saat için kuluçka Tetramers bir Galcer yüklü CD1d monomerlerin PE, 4 kat molar fazlası ile karıştırılarak oluşturulur. 48 ° C saklayınız

Tartışmalar

Bu yöntemde, başlatmak, büyümek, Böcek hücreleri enfekte ve bu hücreleri kullanarak bakülovirüs nasıl titresi nasıl gösterilir. Bu prosedürün en önemli yönlerinden hücrelerin korunması ve bakülovirüs tam titresi bilmek. CD1 tetramers yarattı, onlar glikolipid reaktif T hücrelerinin analizi için güçlü bir araç olarak kullanılabilir. Baculovirus sistemleri de MHC sınıf II tetramers bu nedenle bu işlemi çok daha geniş uygulanabilirliği içeren rekombinant proteinler üretmek için yaygın olarak kullanılmakta...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Express Five SFM	Serum Free Medium	Invitrogen	10486025
High Five TM	Insect Cells	Invitrogen	B855-02
Glutamine Pen strep	Antibiotics	Invitrogen	10378-016
25cm2 TC Flask	Plastic	Fisher Scientific	10-126-28
175 cm2 TC Flask	Plug seal flask	Fisher Scientific	10-126-8
Erlenmeyer Flask	Cell Culture Flask	Fisher Scientific	07 200 672
YM 30 Concenterator	30,000 MWCO	EMD Millipore	UFC 903096
FPLC equipment		GE Healthcare
BrA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Ni-NTA Agarose Column	His Tag Protein Purification Column	GE Healthcare
Desalting column	To get Rod of Salt from Protein	GE Healthcare
MonoQ Column	Anion Exchange Chromatgraphy	GE Healthcare
S200 Column	Size Exclusion Chromatography	GE Healthcare
alpha-Galcer	Glycolipid
PE- Streptavidin	For conjugating Protein	Molecular Probes, Life Technologies	S-866