JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Drosophila melanogaster'de kapalı kafa travmatik beyin hasarına neden olan yeni bir yaklaşım açıklıyoruz. Metodumuz, başa tek başına ayarlanabilen mukavemetli tekrarlayan çarpmalara doğrudan sahip olma avantajına sahiptir. Omurgasız sistemin daha fazla araştırılması kronik travmatik ensefalopati patogenezinin aydınlatılmasına yardımcı olacaktır.

Özet

Kronik Travmatik Ensefalopati (CTE) tekrarlayan hafif Travmatik Beyin Hasarı (mTBI) ile yakından ilişkili olan nörodejeneratif bir hastalıktır. Nöropatolojik kriterleri tanımlama konusundaki görüş birliğine rağmen, kompleks patolojik değişimlerinden sorumlu mekanizmalar büyük ölçüde zor görünüyor. Burada, beyindeki karakteristik hiperfosforillenmiş tau birikimine ve nöron ölümüne yol açan anahtar genleri ve yolları belirlemek amacıyla Drosophila melanogaster ( Drosophila ) 'da bir CTE modeli geliştiren yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Hafif kapalı yaralanma yaratmak için ayarlanabilir mukavemet etkisi başını hızlı bir ivme ve yavaşlamaya maruz bırakarak doğrudan sinek kafasına gönderilir. Metodumuz, diğer Drosophila mTBI modellerinin doğasında olan potansiyel problemleri ortadan kaldırır ( örneğin, hayvan ölümleri,Vücudun diğer bölümleri veya iç organlar). Daha az emek ve masraf gerektiren hayvan bakımı, kısa ömür ve kapsamlı genetik araçlar, meyve CTE patogenezini incelemek için ideal bir hale getirir ve büyük ölçekli, genetik geniş genetik ve farmakolojik ekranlar gerçekleştirmeyi mümkün kılar. Modelin devam eden karakterizasyonunun hastalık önleme ve terapötik yaklaşımlar üzerine önemli mekanik perspektifler oluşturacağını umuyoruz.

Giriş

Kronik Travmatik Ensefalopati (CTE) son zamanlarda Alzheimer hastalığı 1 gibi diğer tauopatilerden ayrı, ayrı bir nörodejeneratif bozukluk olarak kabul edilmiştir. CTE, Alzheimer hastalığının ve diğer yaygın tauopatilerin (en önemli risk faktörleri ilerleme yaşı ve demans öyküsü olması) aksine, CTE adıyla gösterildiği gibi, muhtemelen temas sporları sporcularında görülen beyin travması öyküsü ile yakın bir ilişki kurar; Boksörler ve futbolcular gibi askeri gazilere, 2 , 3 , 4 , 5 gibi . Başın tekrarlayan sarsıntılı ve alttan vurucu darbelerle başlatıldığı düşünülmektedir. Hastalar Alzheimer hastalığı, frontotemporal ile örtüşen bilişsel açıklar, ruh hali ve davranış değişiklikleri ve hareket disfonksiyonu gibi semptom ve bulgular gösterebilirlerBunama, Lewy cisimci bunama ve Parkinson hastalığı 6 . Buna karşılık, beyin dokusunun ölüm sonrası incelemeleri, diğer dejeneratif koşullarda gözlemlenmeyen bir patognomonik özellik olan kortikal sulkusun derinliklerinde küçük damarları çevreleyen farklı bir hiperfosforile tau birikimi desenini ortaya çıkarmaktadır. Bununla birlikte, bugüne kadar, hastalık ortaya çıkmasına yol açan patogenez hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu büyük ölçüde sadık bir hayvan modelinin bulunmaması nedeniyle - sadece son zamanlarda kemirgen modelleri üretildi 5 , 8 . Bu model organizmalar, maliyet yoğun bakımın dezavantajlarına ve nörodejeneratif hastalık çalışmaları için uygun olmayan nispeten uzun bir yaşam süresine sahiptir.

Memeli meslektaşlarıyla karşılaştırıldığında, Drosophila gibi omurgasız hayvanlar, uygun maliyetli bakımları ile mükemmel bir alternatiftir;Genetik belirleyicileri ayırmak için kapsamlı araçlar ve nispeten kısa ömür 9 . Dikkat çekici bir nokta da, sinek ve insan beyinleri, evrimsel olarak korunmuş moleküler ve hücresel yolakları, aynı zamanda anatomik benzerliklerini 10 , 11 , 12 paylaşmaktadır. Travmatik beyin hasarını incelemek için iki adet dahice Drosophila modeli daha önce 13 , 14 bildirilmiştir. Katzenberger ve arkadaşları tarafından tasarlanan ilk "Yüksek Etkili Travma" (HIT) cihazı , metal bir yay 13 , 15'in serbest ucuna bağlı plastik bir flakondaki serbest hareket eden sinekler içeriyordu. Plastik şişe dik durur ve serbest bırakıldığında, bir poliüretan yastığı vurdu ve sinekler için şişe duvarına sıçrar ve geri teperken travmalar kazandırır. Buna karşın, Barekat ve arkadaşları farklı bir teslim yöntemi önermişti.Omni Boncuk Ruptor-24 homojenizatör platformu 14 . Sinekler CO 2 ile etkisiz hale getirildi ve homojenleştiriciye sabitlenmiş ve önceden programlanmış çalkalama koşullarına tabi tutulan 2 mL'lik bir tampon tüpüne yerleştirildi. Doku homojenleştirici sistemini kullanmanın bir yararı, deneycinin yaralanma yoğunluğunu, hasar süresini ve hasar süresini modüle edebilmesidir. Bununla birlikte, her iki rejimin de aynı dezavantajı vardır: başın birincil yaralanmaları çarpma yeri ve kuvveti açısından rasgele uygulanmaktadır. Buna ek olarak, her iki yöntem de vücudun diğer bölümlerine ve iç organlara kaçınılmaz hasarların neden olduğu önemli mortaliteye neden olmuştur. Burada, meyve sineklerinde mTBI'yi indüklemek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Aparatımız, gazla itilen balistik darbe üreticisinden oluşur. Mevcut Drosophila modelleri 14 , 15'e kıyasla, yöntemimiz,Çarpma şiddeti, etkiler arasındaki zaman aralığı ve sürülen toplam çarpma sayısı gibi çeşitli faktörlerin doğru bir şekilde kontrol edilmesine olanak tanıyarak, serbestçe hareket eden sinek kafasına yönlendirilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Grev Aygıtının Montajı ( Şekil 1 )

  1. Pistonu 1 mL tüberkülin şırıngadan çıkarın. Namlu 1 mL işaretinden kesin.
  2. 200 μL'lik bir pipet ucundan bir aerosol bariyerini (3 mm yükseklik x 4 mm çap) çıkarın ve bir çarpma aracı olarak kullanın. Darbe cihazını şırınga varilinin içine yerleştirin. Darbe önleyici ucunu uç tarafına hareket ettirmek için namluya hafifçe dokunun, düz taraf meme açıklığını kapatacak şekilde.
  3. Namlu ucu ucunu bir Drosophila anestezi istasyonunun karbon dioksit (CO 2 ) akış regülatörüne bağlı plastik boruya takın.
  4. Namluyu dikey tutun ve çarpma tertibatı namlunun altında kalacak şekilde standart bir tutucu tutucuya tutturun.
  5. Sinek tutucu yapmak için bir 200 mcL pipet ucu değiştirin.
    1. Ucundan 4 mm keserek 0.8 mm çapında bir delik açın, böylece sadece sinek başlığının ortaya çıkmasına izin verin.
      NOT: ThoRac ve sinek vücudunun diğer tüm parçaları pipet ucu içinde kalacaktır.
  6. Bağlayıcı yapmak için 1000 mcL pipet ucu ve 1 mL şırınga iğne kapağını değiştirin.
    1. Ucu açıklığından 44 mm kes. 1 mL şırınga iğne kapağının 6 mm uzunluğunu alın ve 1000 mcL pipet ucunun geri kalan segmentine sıkıca itin.

2. Grev Aygıtının Çalıştırılması

  1. Bir sineklik bezle CO 2 kullanarak tek bir 2 günlük yetişkin dişi sinekini anestezi altına al.
  2. İnce bir fırça kullanarak sineğe yavaşça aktarın. Uçucu kafanın uç ucunun dışından görülebilmesi için tutucuya hafifçe dokunun. Uçucu burun ucu dışına maruz bırakılırsa, künt bir 1 ml şırınga iğnesi ile ucun içine nazikçe sokun.
    NOT: Sineğin keneğini tutucuya koyduğunuzdan emin olun. Aksi takdirde, sinek bir emme burun deliklerinden ölebilir.
  3. Sinek sesini sıkıştırŞırınga haznesine bağlayıcıyla birlikte gelin ki sinek başı aşağı bakacak şekilde.
  4. Gaz basıncını 100 kPa olarak ayarlayın. Akış oranını deney tasarımına göre ayarlayın.
  5. Darbe regülatörü değiştirme anahtarını çabucak açıp kapatın, böylece çarpma tertibatı sinek kafasına bir kez vurur.
  6. Sineklik tutucuyu kaldırın ve bir sineklik üzerine hareket ettirin. Sineklik tutucuyu tersine çevirin ve sineklerin dışarı çıkmasına izin vermek için hafifçe hafifçe vurun. Kurtarmak için sinekleri boş bir şişeye bırakın.

3. Video-destekli Hareket Takibi

  1. İzleme arena yapmak için şeffaf silikon elastomer ile 6 cm çapında bir Petri kabını doldurun. Sinekler serbestçe yürümek ancak sinek sağlamak için silikon ve çanak kapağı arasında 3 mm boşluk bırakın.
  2. Her seferinde sahte veya tedavi edilen gruptan dört sinek anestezi uygulayın ve onları arenaya yerleştirin. Sinekleri 1 saat boyunca 22 ° C'de bırakın.
  3. Arenalar üzerinde bir Şarj Bağlı Cihaz (CCD) kamera yerleştirin ve 5 dakika boyunca kaydedin.
  4. Kaydedilen hareket hareketlerini Ctrax yazılımını (Caltech'ten serbestçe temin edebilirsiniz) kullanarak analiz edin 16 . İzlenen verileri bir programlama dilinde (örn., Matlab) uyumlu bir biçimde dışa aktarın ve verileri çerçeve başına seyahat edilen mesafeye göre analiz edin 17 . Her bir sinek için ortalama yürüme mesafesini hesaplayın ve aynı gruptaki dosyaların popülasyonu tarafından gezinilen ortalama kümülatif mesafeyi elde etmek için kaydedilen tüm sinekler / grup ile birleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yetişkin Drosophila kullanılarak bir CTE modeli oluşturmak için, cihazımızın tek bir kapalı baş yarası vermedeki etkinliğini tespit ettik. Genotip, cinsiyet veya yaşla ilişkili varyasyonları gidermek için deneyde 2 günlük Canton-S WT dişi sinekler kullandık. 100 kPa'lık sabit bir gaz basıncında CO 2'nin akış oranını düzenleyerek darbenin gücünü kolayca kontrol edebilirdik. En yüksek akış hızında (15 L / dak.) Tek bir vuruşa ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Nörofizyolojik değişiklikler, nöropatolojik özellikler ve nörobevürek açıklar dahil olmak üzere CTE özelliklerini sadık kalarla modelleyen hayvan modelleri, hastalık mekanizmalarının ortaya çıkarılması ve teşhis ve terapötik hedeflerin geliştirilmesi için gereklidir. Bir insan hastalığına ait hiçbir hayvan modelinin klinik olarak ilgili tüm bitiş noktalarını taklit etmek için mükemmel olmadığı anlaşılabilir bir durumdur. Bununla birlikte, sağlam bir CTE modelinin aşağıdaki üç ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Bu çalışma Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi fakültesi başlangıç ​​fonu tarafından LC'ye desteklenmiştir.

Teşekkürler

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Aerosol BarrierUSA Scientific1120-8810Used as an impactor
200 μL Pipette TipUSA Scientific1111-0706Used as a fly head holder
1000 μL Pipette TipUSA Scientific1122-1830Used as a connector
1 mL Tuberculin SyringeBecton Dickinson309625
60 mm Petri DishesFisher ScientificFB0875713AUsed as a tracking arenas
Flow RegulatorGenesee Scientific59-122WC
Standard Clamp Holder/standEISCO ScientificCH0688
Fine BrushGenesee Scientific59-204
FlypadGenesee Scientific59-114
Sylgard Silicone ElastomerDow Corning4019862
CCD CameraMicrosoft HD-5000
Ctrax Walking Fly TrackerCaltechCtrax 0.2.11
MATLAB Image Processing ToolboxMATLABR2015b

Referanslar

  1. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).
  2. Martland, H. S. Punch drunk. JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).
  3. Millspaugh, J. A. Dementia pugilistica. US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).
  4. Omalu, B. I., et al. Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II. Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).
  5. Goldstein, L. E., et al. Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model. Sci Transl Med. 4 (134), (2012).
  6. Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going? Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407(2013).
  7. McKee, A. C., et al. The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy. Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).
  8. Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
  9. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
  10. Littleton, J. T., Ganetzky, B. Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome. Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).
  11. Appel, L. F., et al. The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).
  12. Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster. Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).
  13. Katzenberger, R. J., et al. A Drosophila model of closed head traumatic brain injury. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).
  14. Barekat, A., et al. Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 25252(2016).
  15. Katzenberger, R. J., et al. A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila. J Vis Exp. (e52905), (2015).
  16. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  17. Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis. Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).
  18. Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
  19. Theadom, A., et al. Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample. J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).
  20. Drobysheva, D., et al. An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster. J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 125Hafif travmatik beyin hasarkronik travmatik ensefalopatiDrosophilaSars ntn rodejenerasyonhayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır