Sinir iletim için ultrasonik bir araç diyabetik sıçan modellerinde engelleme

Özet

Bu çalışma yüksek yoğunluk odaklı ultrason diyabetik nöropatik sinir aksiyon potansiyelleri engellemek için uygulanan metodoloji sunar.

Özet

Sinir iletim bloğu bir yüksek yoğunluk odaklı ultrason (HIFU) çevirici ile normal ve diyabetik hayvan modellerinde son zamanlarda yapıldı. HIFU geri dönülebilir olarak uygun bir ultrasonik parametresini kullanırken sinirler zarar vermeden periferik sinir iletim engelleyebilir. Sinir aksiyon potansiyelleri geçici ve kısmi bloğunu HIFU ağrı yardım için yararlı bir klinik tedavi olma potansiyeline sahip olduğunu gösterir. Bu eser bir HIFU dönüştürücü kullanarak diyabetik sıçan vivo içinde nöropatik sinirler aksiyon potansiyelleri bastırmak için işlemleri gösterir. İlk adım streptozotocin (STZ) enjeksiyonu ile yetişkin erkek diyabetik nöropatik rats üretmektir. İkinci adım STZ-indüklenen diyabetik Sıçanlarda diyabetik periferik nöropati bir elektronik von Frey sonda ve sıcak bir tabak tarafından değerlendirmek etmektir. Kayıt içinde vivo hücre dışı aksiyon potansiyelleri HIFU sonication için maruz sinir son adım etmektir. Burada ortaya yöntem ultrason analjezik uygulamaları çalışma yararlanabilir.

Giriş

Oral ilaçlar, akupunktur¹ve elektriksel sinir stimülasyonu² ağrılı diyabetik polinöropati tedavisi için kullanılır. Ancak, oral ilaçlar, akupunktur ve elektriksel sinir stimülasyonu invaziv işlem yan etkileri terapötik etkinlik ve hastanın bağlılık engel. Hayvan modellerinde periferik sinirler bloğunu ultrason için onlarca yıl^3,4,5araştırmış. Büyük yeşil kurbağa vitro siyatik sinir iletim geri dönülebilir olarak 0.4 için-ultrason pozlama 10-20 darbeleri tedaviden sonra inhibe 1.0 s⁶. Sinir iletim engellemek için bir ultrason⁷tarafından indüklenen sıcaklık artışı faktördür. Polinöropati olan hastalar için bileşik kas aksiyon potansiyelleri (insert) bastırılması düşük yoğunluktaki ultrason için 2 dk⁸maruz peroneal sinir içinde gerçekleştirildi. 5 dk içinde tam kurtarma zamandı.

Son zamanlarda, gıda ve İlaç İdaresi Amerika Birleşik Devletleri'nin HIFU uterin fibroid tümörler⁹, ağrı palliations kemik metastaz¹⁰ve prostat kanseri¹¹için non-invaziv tedavi olarak onaylanmış. Bir HIFU dönüştürücü vücut dışında akustik ışınları yayar ve kirişler çeşitli doku ortamlar içinde iletmek ve odağı hedef tümöre üzerinde birleşirler. Odak bölge hemen hedef tümörler üzerinde lokalize etkileri çevre dokulara zarar vermeden üretmek için kuruldu. HIFU Ayrıca sinir iletim inhibe veya sinir denervation normal Sprague-Dawley (SD) fareler¹² in vivo deneyler neden uygulandı. Buna ek olarak, HIFU kısa ve uzun vadeli etkileri nöropatik sinir incelenen¹³olmuştur. Önceki sonuçlar duyusal sinir iletim tersine çevrilebilir veya kalıcı blok uygun parametrelerle HIFU tarafından elde edilebilir gösterdi. Analjezik uygulamaların yanı sıra HIFU bir araç olarak sinir iletim abluka Nöroloji temel araştırma ve geliştirme ağrı kesici için periferik ve merkezi bileşenleri göreli katkısını araştırmak için kullanılabilir olur. Bu nedenle, bir HIFU engelleme teknoloji platformu belirli hayvan modellerinde periferik sinirler için gereklidir. Bu makalenin amacı, kısmen veya tamamen HIFU tarafından diyabetik nöropatik Sıçanlarda periferik sinir aksiyon potansiyelleri engelleme yordamlarına göstermektir. Diyabetik fare modelleri ve değerlendirme periferik nöropatik semptomların kurulmuştur. Bir HIFU platformu ve deneysel süreçler sıçan siyatik sinirleri tedavisi için belirli sunulmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Tayvan Ulusal Sağlık Araştırma enstitüleri onaylanmıştır tüm hayvan iletişim kuralları.

1. indüksiyon, diyabetik modelinde erkek yetişkin Sprague - Dawley (SD) fareler

1. kaldırmak sıçan gıda granül kafes hızlı erkek SD (300-350 g) sıçanlara STZ indüksiyon öncesinde 6 h için.
2. Hazırlama sodyum sitrat arabellek (0.1 M, pH 4.5).
   1. Erimesi 1,05 g sitrik asit monohidrat (C ₆ H ₈ O ₇ · H ₂ O; mol. WT 210.14) 50 mL 0.1 M sitrik asit çözüm yapmak için su distile.
   2. Erimesi 1,47 g TRISODYUM sitrat dihydrate (C ₈ H ₅ O ₇ Na ₃ · 2 H ₂ O; mol. WT 294.12) 50 mL 0.1 M sodyum sitrat çözüm yapmak için su distile.
   3. Ekle 25 mL sitrik asit çözüm için 25 mL sodyum sitrat çözüm. Sodyum sitrat tampon pH (pH 4.5) monitör pH metre kullanarak.
      Not: İzotonik arabellek buna ek olarak 0.1 M sodyum sitrat çözüm uygun bir birimi tarafından yapılır.
3. Erimesi 50 mg/mL STZ çözüm getirebilecek STZ 0.1 M sodyum sitrat arabellekte.
   Not: STZ çözüm ışığa duyarlı olduğunu, bu nedenle, STZ çözüm alüminyum folyo ile kapak ve 15-20 dk. içinde kullanın
4. 50 mg/kg STZ çözüm ile 26 - 28 gauge iğne. temiz enjeksiyon yeri bir etanol pad ile 1 mL insülin veya tüberkülin şırınga çekmek ve intraperitoneally zarar görmesini önlemek için karın sağ alt çeyreğine STZ çözüm enjekte Karın organları.
5. % 10 Sükroz su ile rats 48 h için tek su kaynağı olarak STZ enjeksiyon sonra hipoglisemi önlemek için tedarik.

2. onay diyabet STZ kaynaklı Sıçanlarda

1. monitör tüm açlık plazma glukoz konsantrasyonu fareler tarafından STZ enjekte sonrası 72 h ile bir glikoz metre.
   1. Hızlı STZ-indüklenen diyabetik sıçan oruç ölçme önce 15 h için kan glikoz düzeyi.
   2. Bir kısıtlama çantasında sıçan dizginlemek ve kan toplama sırasında kan şekeri ölçümleri için kuyruk bulaşmasına neden.
   3. Küçük bir damla kan almak için kuyruk ucu prick kan lanset kullanın. Damla kan glikoz test şeridi üzerinde bir yer. Açlık plazma glukoz düzeyleri rekor.
      Not: Glikoz metre algılar ve mg/dL birimlerinde kan şekeri düzeyini görüntüler. Açlık kan şekeri düzeyleri 150 mg/dL altında farelerle STZ-indüksiyon 2 hafta sonra dışlamak.

3. Diyabetik periferik nöropati diyabetik Sıçanlarda değerlendirilmesi

1. Elektronik von Frey ile mekanik allodynia değerlendirin.
   1. Alıştırmak STZ indüklenen diyabetik sıçan 30 dk önce hind değerlendirmek için bir 1 cm çapında metal kafes katta bir kafeste pençe çekilme yanıt.
   2. El ile fareler arka pençe plantar yüzeye baskı uygulamak için katı ipucu (0.8 mm çapında) ile bir elektronik von Frey sonda kullanın ve bir pençe çekilme yanıt görülür kadar basınç yavaş yavaş artırın.
   3. Bu sistemdeki gösterir ve ölçüm fareyle her ölçüm arasındaki 30 s aralığı başına 5 kez tekrarlayın basınç kaydetmek.
2. Isı hyperalgesia elektrikli Ocak ile değerlendirmek.
   1. Ağrı yanıt değerlendirmeden önce 10 dakikadır (24 ± 0,5 ° C) sıcak tabakta STZ-indüklenen diyabetik sıçan alıştırmak.
   2. Kaldırmak ve fareler habituation sonra onların kafes yerleştirin, sıcak plaka ısı ve sıcak plaka korumak ' s 55 ± 0,5 ° c sıcaklıkta
   3. Fare aynı anda zamanlayıcıyı başlatılırken ısıtmalı sıcak tabağa yerleştirin.
   Fareyi farklı davranışlar sergiler, hind yalama gibi pençe veya anormal derecede flicking hind pençe, sayacý durdurmak ve para çekme gecikmesi kaydetmek
   4. .
      Not: Eğer bir fare sonra 20 farklı davranışları ifade değil s (20 s kesme süresi), sıcak plaka test sonlandırmak ve fare sıcak plaka kaldır.

4. Vivo Sinir iletim blokajı HIFU dönüştürücü ile

Not: vivo içinde deneme hafta 5 50 mg/kg STZ enjeksiyon sonra başlar.

1. CMAPs HIFU sonication ile engelleme önce hayvan yordamları gerçekleştirin.
   1. Cerrahi araçlarda (neşter, makas, pens ve cam kanca) bir otoklav ameliyattan önce sterilize.
   2. Tiletamine/zolazepam karışımı (40 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) mayi enjeksiyon veya inhalasyon yolu ile isoflurane isoflurane Buharlaştırıcı üzerinden %1.75 farelerle anestezi. Vücut ısısını korumak için bir Isıtma yastığı fareler yer.
   3. Cerrahi sıçanlara ventral recumbency getirin. Göz merhem uygulamak. Fareyi bacak uzatmak ve anestezi derinliği tespit için tırnakları ayak plantar yüzeyine çimdik. Fareler çekilme yanıtları göstermek, ek anestezi uygulanır.
   4. Bacağından çıkardığınızı tüylerden ve arkasında bir elektrik kesme makinesi ile fareler daha düşük. Cerrahi alanında temiz gazlı bez ile sıvı iyot uygulamak ve dairesel yayın gazlı bez cerrahi sitesi dışa doğru hareket ettirin. Bir alkol takımını aynı dairesel hareketi ile sıvı iyot silmek için kullanın. Bu deney sol ve sağ cerrahi sitesinde gerçekleştirilir. Diğer cerrahi sitesinde yordamı yineleyin ne zaman yordam sonraki adımında gerçekleştirmek.
   5. Steril Cerrahi makas veya neşter deri kesik dorsal uyluk olun Dikkatle doku cilt altında ayrı ve cilt ile cilt kanca. uyluk kas içinde görülebilir güvenli künt Cerrahi makas kullanın.
   6. Makas kasları gömülü orta uyluk siyatik sinir lifleri görünür hale gelene kadar dikkatle femur paralel kasları ayırmak için kullanın. Dikkatle çevreleyen bağ doku ve kasları orta uyluk siyatik sinir ayırmak için bir cam kanca kullanın.
2. Siyatik sinir bir ısmarlama sinir fiksatör ( Resim 1 ve şekil 3) kullanarak HIFU odak bölgesi içinde konumlandırın.
   Not: Özel yapım sinir fiksatör oluşmak-in 3 parça ( şekil 3). Tüm bileşenleri şeffaf Polimetilmetaakrilat (PMMA) yapılır. Dış iş parçacığı bileşen üst yapısını ben aynıdır 2,5 mm boyunda ve M10XP0.7 ( şekil 4A). Merkezi iyi 4.0 mm çaplı delik bileşeni aracılığıyla ben var. Kuyu alt açıklıklı teyp tabakasıyla kaplı kalır. Yuvası çapı 1.2 mm olduğunu ve ben yuvasının Merkezi uçak ve bileşenin üst yüzeyi arasındaki mesafedir 3.1 mm. bileşen II ana gövdesi, dört bacağı ve alt yapı ( şekil 4B) oluşur. 2.5 mm boyunda ve bileşen dış iplik sığacak şekilde M10XP0.7 alt yapısının iç iş parçacığı olduğunu ben. Merkez delik çapi bileşen Merkezi kuyusu aynıdır ben. Ana gövde 32 mm çapında ve 5.4 mm kalınlıkta boyutlardır. Dört bacaklı simetrik olarak dağıtılır. İki özdeş kısa bacakları hizalama için tasarlanmıştır ve iki özdeş uzun bacaklı bileşen III çengel için iş. Dış çap ve bileşenin III yüksekliğini 41 mm ve 9,2 mm dir. İç iş parçacığı M36XP1.0 ve ile delik 27,5 mm çapında (< güçlü sınıfı "xfig" => Şekil 4 c). Koni 84 mm çapında üst açıklıklı ve 27,5 mm alt açıklıklı çapı ile içi boş bir konik olduğunu. Yüksekliği 57,5 ( şekil 5A) mm'dir.
   1. 30-60 dk steril suda ıslatarak takip için çamaşır suyu çözümünde özel akrilik sinir fiksatör deneme önce emmek.
   2. Bir cam kanca kullanarak sinir çýkýntýdan ve bileşen ı. yuvası koymak
   3. Vida bileşen II bileşenine ı. dolgu Merkez iyi bileşeni I zil ile ' ultrasonik yayılması ve sinir korunması için s çözüm.
   HIFU konut koni
   4. vida bileşenine III. Dock bileşeniyle bileşeni bileşen II dört bacağı II III.
      Not: Üç bileşenden geometrik merkezi ve dönüştürücü hizalanır. Sinir ve dönüştürücü arasındaki mesafe sinir HIFU odak bölge içinde olmasını sağlar odak uzaklığı eşittir.
3. Siyatik sinir ve diğer çift gastroknemius kas içine kökeni akupunktur iğneleri bir çift yerleştirin. Her çift iğne Elektrofizyoloji koordinat belirleme sistemi bir elektrik koaksiyel kablo ( şekil 1) aracılığıyla bağlanmak.
   Not: kablosunun bir ucunu iki iğne küçük ayrı ayrı ve kablosunun diğer ucundaki iki timsah klipleri sistem bağlamak için BNC Bağlayıcısı vardır. Akupunktur iğneleri çiftlerini siyatik sinir, uyarıcı elektrotlar ve kayıt elektrotları gastroknemius kas olarak çalışıyorum.
   1. Örnekleme hızı ve bant genişliği Elektrofizyoloji koordinat belirleme sistemi 50 kHz ve 70 Hz - 3 kHz ila, anılan sıraya göre ayarlayın. Siyatik sinir kökeni, uyarıcı elektrotlar supra-azami uyarıcı bir darbe genişliği 0.1 MS ile uygulamak.
   2. Üzerinden kayıt elektrotları CMAPs kaydetmek ve insert ile dahili amplifikatör Elektrofizyoloji koordinat belirleme sistemi yükseltmek.
      Not: dahili amplifikatör Elektrofizyoloji Koordinat Belirleme Sistemi sinir sinyalleri yükseltmek ve Elektrofizyoloji koordinat belirleme sistemi ile kayıt elektrotları üzerinden CMAPs kaydetmek için kullanabilirsiniz.
4. Diyabetik nöropatik Sıçanlarda CMAPs bastırmak için bir ticari 2.68 MHz HIFU çevirici kullanın.
   Not: Dönüştürücü teknik özellikleri aşağıda açıklanan: tek öğeli bir küresel kase diyafram çapı 6 cm ve 5 cm odak uzaklığı ve 4 mm derinlik ve genişliği ücretsiz alanındaki 0.8 mm elips bir odak bölgesi.
   1. Küresel koni, HIFU dönüştürücü ve koni içinde belgili tanımlık tank kapak bırakın degassed su. HIFU dönüştürücü küresel koni koymak ve koni kapak küresel konik üst açılması için 6 baş vidalar tarafından ( 5B rakam) düzeltin. Küresel koni kabarcıkları doğal olarak baloncuklar su ile karşılaştırıldığında düşük yoğunluk nedeniyle okuldan sonra ön uç açılış koni şeffaf 0,03 mm kalın bant tarafından mühür. Üzerine küresel konik vida bileşen III.
   2. Degassed su tankından HIFU dönüştürücü ile küresel koni ve bileşen III çıkar.
      Not: çalışmada kullanılan Ters Ozmos Ters Ozmos işlem tarafından arıtılmış su sudur. Ters Ozmos su gaz çıkarmak için kaynatılır. Soğutma sonra degassed su içinde bireysel bir kapalı tank elde edilir.
5. Bileşen koymak ben sinir ve kas arasındaki boşluğa dikkatle ve sinir bileşen ı. gerçekleştirme adımları 4.2.3 ve sinir HIFU odak bölge içinde olduğundan emin olmak için 4.2.4 boşluk yerleştirin ( şekil 3A < / güçlü >).
6. Bir işlev üreteci ve Radyofrekans amplifikatör bağlantı. Güç amplifikatörü HIFU dönüştürücü HIFU kiriş üretimi için bağlayın. El ile güç amplifikatörü HIFU dönüştürücü üzerinden için işlev üreteci gerilim çıkışını ayarlayın. HIFU maruz kalma süresi doldu sonra el ile işlev üreteci kapatmak. Bir zamanlayıcı kullanarak zaman gözlemlemek.
   Not: Yoğunluk ve enerji bu çalışmada kullanılan HIFU demetinin 2,810 W/cm ² ve 84 J/mm ², sırasıyla vardır.
7. Aynı anda, uyarıcı Elektrofizyoloji Koordinat Belirleme Sistemi (Adım 4.3) üzerinden ve HIFU ışın HIFU sistemi (Adım 4.6) üzerinden siyatik sinir CMAPs kaydederken teslim. Yavaş yavaş HIFU siyatik sinir üzerindeki 3 artırmak s, 5 s 8 azalması veya insert genliği inhibisyonu görülmektedir kadar s.
   1. Kayıt HIFU teslimi sırasında saniyede bir kez CMAPs ışın. İnsert genliği değişikliği gözlemleyerek sonra HIFU etmeyi kapat ve el ile Elektrofizyoloji edinme yazılım kayda CMAPs erken 10 min, her 5 dakika içinde arka arkaya 30 dk içinde her 2 dk kayıt simgesini tıklayın ve her 10 min Son aşama kayıt süresi 2 h. ulaşana kadar
8. Ayrı bileşen II ve III. sinir fiksatör ( şekil 3) HIFU dönüştürücü kesi siteden kaldırmak için. Ayrı bileşen II ve ben güvenli siyatik sinir serbest bırakmak için. Diyabetik sıçan cerrahi sitesi 4-0 fotokromik akorduna dikiş tarafından CMAPs kaydettikten sonra dikiş. Sıvı iyot enfeksiyonu önlemek için cerrahi sitesi uygulamak.
   1. Kafesleri Isıtma yastığını yerleştirin ve onların kafes hayvan tesisine dönmeden önce kurtarmak fareler sağlar. Fareler 3 gün veya buprenorfin (0,05 - 0,1 mg/kg) mayi enjeksiyon için ibuprofen içme suyu sağlamak.
9. Kayıt ve uyarıcı elektrotlar siyatik sinir ve imzalat diyabetik nöropatik sıçan gastroknemius kas kökenli adımları 4.1.2 ve 4.3 7, 14 ve 28 gün sonra ilk HIFU sonication açıklandığı gibi ekleyin. 4.3.1-4.3.2 adımları yineleyin.
   1. Kafesleri Isıtma yastığını yerleştirin ve onların kafes kafes hayvan tesisine taşımadan önce kurtarmak fareler sağlar.
10. Fareler deneyden sonra ötenazi. Fareyi bir karbon dioksit odaya koyun. 5 dakika farelerin nefes durdurmak için bekleyin. Kalp yenerek durdurdu emin olmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

3 s sonication bir yoğunluk itibariyle 2,810 W/cm²bir HIFU doz, insert temellerin % 20 oranında bastırılır, ancak tamamen (şekil 2A, elmas) 30 dk sonra ele geçirildi ve neredeyse giriyordu, in vivo çalışmada gösterilmiştir 28 gün (şekil 2B, elmas) döneminde sürekli. 5 s HIFU maruz kalma, aynı yoğunlukta CMAPs 65,4 temel 4 dk (%9,5) oranında azalmış ve %73,7 (%12,6) satır taban çizgisiyle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Action potentials diyabetik sıçan vivo içinde gelen nöropatik sinir ve anlık oluşumunu engelleyici etkisi HIFU tedavisi hem gözlenmiştir sonra kısmi ve geçici bastırma. 28 günlük takip çalışması insert üzerinde güvenli bir abluka sinir iletim, uygun HIFU riziko taşınan dışarı gösterdi. Sonuç olarak, yukarıdaki Protokolü HIFU tedavisi siyatik sinirleri diyabetik Sıçanlarda tersinir iletim bloğu için alternatif bir çözüm sağlayabilir.

Bu yöntemde, i?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
streptozotocin	Sigma	85882
citric acid monohydrate	Sigma	C1909
trisodium citrate dihydrate	Sigma	W302600
glucose meters	Roche Accu-Check Active	GC
electronic von Frey device	IITC Life Science	2390
hot plate	IITC Life Science
Biopac MP36 acquisition system	Biopac Systems, Inc.
HIFU transducer	Sonic Concepts	H108
function generator	Agilent	33250A
power amplifier	Electronics & Innovation	1040L
Rats	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube vet ointment	Dechra
isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurance	Attane
Restraint bag (Decapicones)	Braintree Scientific	DC 200