Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Hücresel iyon taşıma kez değerlendirilen hücre içi pH izleyerek (pHben). Genetik olarak kodlanmış pH-göstergeler (GEpHIs) olduğu gibi hücrelerde hücre içi pH optik miktar sağlar. Bu iletişim kuralı aracılığıyla hücresel ex vivo canlı görüntüleme, Drosophila melanogaster Malpighi tübüllerin pHerry ile hücre içi pH miktar detayları, sözde ratiometric genetik olarak kodlanmış pH göstergesi.
Epitel iyon taşıma sistemik iyon homeostasis gibi temel hücresel elektrokimyasal gradyan bakımından önemlidir. Hücre içi pH (pHı) birçok iyon taşıyıcılar tarafından etkilenir ve böylece pHben izleme ışınlama etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir araçtır. Modern genetik olarak kodlanmış pH-göstergeler (GEpHIs) optik miktar pHben sağlam hücrelerde, hücre ve hücre altı ölçekte sağlar. Bu iletişim kuralı hücresel pHben yönetmelikte Malpighi tübüllerin (MTs) Drosophila melanogaster ex vivo canlı görüntüleme yoluyla pHerry, sözde ratiometric GEpHI pK, gerçek zamanlı miktar açıklar bir sitozol pH değişiklikleri izlemek için oldukça uygundur. Ayıklanan yetişkin sinek MTs tek hücre katmanı epiteli morfolojik ve fonksiyonel olarak ayrı bölümden oluşmaktadır ve epitel taşıma incelenmesi için erişilebilir ve genetik olarak uysal bir model olarak hizmet verebilir. GEpHIs geleneksel pH duyarlı floresan boyalar ve iyon-seçici elektrot çeşitli avantajlar sunuyor. Uygun organizatörü öğeleri kullanılabilir olması şartıyla GEpHIs farklı hücre popülasyonlarının etiketleyebilirsiniz. Bu etiketleme ex vivo, in vivove doğal olarak heterojen situ hazırlıklar, özellikle kullanışlı olur. GEpHIs da sağlam dokularda ezelî lüzum için tekrarlanan boya tedavi veya doku dışa zamanla pHi miktar izin. Birincil geçerli GEpHIs yanıt olarak doku hasarı sitozolik kapanımlar toplamak ve aşırı ifade oluşturmada eğilimi dezavantajıdır. Bu eksiklikler, çözümleri ve GEpHIs doğal avantajları bu protokolü demiri proton (H+) taşıma ayıklanan sineğin MTs işlevsel olarak ayrı asıl ve Yildiz Seklinde hücrelerdeki değerlendirilmesi ile gösterilen. Teknikleri ve analiz açıklanan çeşitli omurgalı ve omurgasız hazırlıkları için kolayca uyarlanabilir ve tahlil sofistike labs karmaşık iyon akı belirli taşıyıcılar yoluyla belirlenmesi için öğretim ölçeklendirilebilir.
Bu protokol miktar hücre içi pH (pHi) bir genetik olarak kodlanmış pH-gösterge (GEpHI) kullanarak açıklamak ve bu yöntem demiri H+ Ulaştırma modeli böcek (ö. değerlendirmek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için hedeftir melanogaster) böbrek yapısı, Malpighi tübül (MT). MTs meyve sineği boşaltım organları hizmet ve işlevsel olarak birkaç anahtar bakımdan1memeli nefron benzer. MTs tübüllerin (anterior ve posteiror) göğüs ve karın anında 2 çift olarak düzenlenir. Tek hücreli epitelyal tüp her MT metabolik olarak aktif asıl hücreleri ile farklı apikal oluşmaktadır (luminal) ve demiri (hemocoel) polarizasyon gibi Yildiz Seklinde hücre ara. Anterior MTs 3 oluşan morfolojik, işlevsel olarak, ve gelişimsel olarak farklı kesimleri, özellikle ilk kesimi, geçiş bölütü ve üreter2' ye katıldı salgı ana segment büyümüş. Hücresel ölçekte trans-epitel iyon taşıma Lümen içine bir apikal plazma zarı V-ATPaz3 ve bir alkali-metal/H+ Eşanjör gibi bir demiri Na+-K+tarafından gerçekleştirilir-ATPaz4, içe-doğrultucu K+ kanal5, Na+-Cl−/HCO3− Eşanjör (NDAE1)6ve+Na -K+tahrik-2 Cl− cotransporter (NKCC; Yildiz Seklinde hücre Cl- aracılık ve su taşıma8,9Ncc69)7. Bu karmaşık ama erişilebilir fizyolojik sistemi farklı genetik ve davranışsal toolsets Drosophilaile birleştirildiğinde endojen iyon taşıma mekanizmaları incelenmesi için mükemmel fırsatlar sağlar.
Bu iletişim kuralı için gerekçe epitel iyon taşıma hücreden Tümleştirme davranış ve araçları diğer sistemleri modellemek için ihracat potansiyeli ile çalışmak için genetik olarak yumuşak bir sistemi açıklamak için yapıldı. PHerry10ifadesi, bir füzyon kırmızı pH-duyarlı mCherry13, MTs ve yeşil pH duyarlı süper tutulum pHluorin11,12 (SEpH) türetilmiş bir GEpHI miktar H+ taşıma izni Tek MT hücreleri ile yüksek K+/nigericin kalibrasyon tekniği14. Birçok iyon taşıyıcılar H+ eşdeğerleri geçtiğinizde, hücre içi pHben bir miktar iyon hareketi taşıyıcılar çeşitli yoluyla fonksiyonel bir temsili olarak hizmet vermektedir. Drosophila MT modeli sistem Ayrıca doku özgü transgene15 ve hücresel görüntüleme ve bütün organ deneyleri17 ile birlikte RNA müdahale (RNAi)16 ifade güçlü genetik araçlar sunar , 18 , 19 tübül işlevinin davranışına molekülleri üzerinden dikey entegrasyon ile sağlam bir araç kümesi oluşturmak için. Bu Buna ek olarak diğer birçok protokolün epitel biyoloji, tarihsel olarak bu tür ölçümler üzerinde karmaşık yararlanmıştır olarak değerlendirilmesi ve mikro-diseksiyon, sofistike iyon-seçici elektrot20,21yıldırıcı anlamına gelir, ve pahalı pH duyarlı22 kısıtlayıcı yükleme gereksinimleri ve türdeş olmayan dokularda zavallı hücresel özgüllük ile boya. GEpHIs kapsamlı pHben hücre türleri23çeşitli ölçmek için kullanılmaktadır. Erken dönem çalışmaları doğal pH-duyarlılık, yeşil flüoresan Protein (pHben kültürlü epitel hücreleri24 içinde izlemek için GFP) yararlanan ama son yirmi yılda nöronlar25, glia26, mantar27 kullanılan GEpHIs gördün mü , ve bitki hücreleri28. GAL4/UAS ifade sistem15 ve Drosophila MT fizyolojik erişilebilirliğini genetik yapıları, hücresel hedefleme için potansiyel kombinasyon bu araştırmalar pHiçin ideal bir hazırlık yapmak ben düzenlemesi ve epitel iyon taşıma.
pH yönetmelikben yıllardır okudu ve yaşam için çok önemlidir. Fizyoloji pH yönetmelikben öğretmek ama aynı zamanda gerçekleştirmek için güçlü bir modeli pHi yönetmelik ex vivo ve içinde vivosofistike MT hazırlık kursları sunar. Bu iletişim kuralı miktar H+ hareketinin Drosophila NH4Cl darbe asit tekniği21yükleme kullanarak MT epitel hücrelerinin demiri membran arasında açıklar, ancak pH göstergesi olarak genetik olduğunu kodlanmış, bu yöntemler ve teorik çerçeve herhangi bir hazırlık transgenesis mükellef ve canlı görüntüleme için uygulanabilir.
Bu iletişim kuralı tüm adımlarını Mayo Clinic (Rochester, MN) hayvan kullanım yönergelerle uyumlu olmak.
1. yetiştirme fly
2. slaytlar Poly-L-lizin hazırlanması.
3. yemek ve cam çubuklar dissekan hazırlık
Resim 1: Cam çubuklar Malpighi tübüllerin işlemek için imalatı.
A - E. Isıtma ve bir mum tıkıp üretmek ve açı bir cam çubuk MTS'yi okları işleme için uygun çekme işlemi göstermek yönü ve büyüklüğü uygulanacak kuvvet. F. bir uygun şekilde fabrikasyon cam araç fotoğrafı. Ölçek çubuğu 10 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
4. çözümler ve perfüzyon sistemi hazırlanması
Not: Perfüzyon sistemleri üreticisi tarafından farklıdır. Bu iletişim kuralı bir yerçekimi beslenen 8-kanal açık rezervuar bir giriş akış hızı regülatör ve elektrikli tahrik çıkış ama MTs burada açıklandığı gibi herhangi bir perfüzyon sistemi ile çalışmaya adapte edilebilir montaj yöntemi ile dayanmaktadır.
Resim 2: Perfüzyon sistemi ve yapılandırma görüntüleme.
MT demiri taşıma fonksiyonu sayesinde aynı anda fizyolojik değerlendirilmesi için gerekli bileşenleri Floresans görüntüleme ve hızlı çözüm değişimi yaşıyor. Gaz satırları isteğe bağlıdır ve genişleme deneyler HCO3- taşıma değerlendirilmesi için izin vermek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Akış şeması perfüzyon cihazları, NH4Cl darbe için deneyler.
Oklar akış yolunu ve Vana noktaları geçiş tasvir. Çözüm rezervuar numune için yerçekimi akışı tarafından hareket ve numune odasından atık şişeye vakum emme tarafından çizilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
5. yetişkin Drosophila ön Malpighi tübüllerin diseksiyon.
6. doğrulama protokolü ve tübül sağlık görüntüleme
Not: Bu protokol bir ters geniş alanlı epifluorescent mikroskobu GFP (SEpH) ve RFP (mCherry) filtre setleri ile gerçekleştirilir (470/40 nm uyarma (ex), 515 nm longpass emisyon (em), 500 nm dikroik ve 546/10 nm ex, 590 nm longpass em, 565 nm dikroik), 10 X / 0.45 hava amacı, tek renkli kamera canlı görüntü yakalama ve düşsel bilgisayar yazılımı için. Protokol için herhangi bir dik adapte olur veya en uygun pozlama süreleri, ışık şiddeti ve binning parametrelere göre değişir, ancak mikroskop GFP ve RFP optik ve görüntü edinme şalter bilgisayar yazılımı arasında otomatik filtre ile ters. Her kanaldaki bir yatırım Getirisi ile kullanarak arka plan çıkarma hiçbir Floresans sinyal ROI bitişik içerir sonra tüm analizi, faiz (ROI), bölgedeki ortalama piksel yoğunluğu olarak floresan yoğunluğu analiz edilmelidir.
7. tam kalibrasyonu Malpighi tübüllerin Ex VivopHerry.
8. demiri asit ekstrüzyon Ex Vivo Malpighi tübül epiteli gelen miktar.
Sağlıklı doku ve uygun ön MTs tanımlaması bu protokolü başarısı için önemlidir. Diseksiyon sırasında doğrudan dokunmak MTs özen gösterilmelidir ve tek tanıtıcısına onları doğrudan MTs sürükleyici olarak üreter tarafından kırılması (- 4A şekil B) götürecek. MTs düz slayt süpürüldü vardır, tübüllerin mümkün olduğu kadar az değiştirilmesi gereken ve aşırı hareket bu kadar kaçın?...
Miktar pHben in başarısında Drosophila MTs tamamen ayıklanan MTs ve montaj ve diseksiyonu (Şekil A - C) kalitesini sağlığı üzerinde bağlıdır. Bu nedenle, dikkatli işleme doku açıklanan zorunludur. Taze PLL içinde kaplı slaytlar önemli ölçüde daha fazla yapışkan olma eğilimi olarak yardım MT montaj daha önce kullandığı eriyik-e doğru kayıyor. Dikkatli montaj da ayrı MT kesimleri (Şekil D) tanımlamas...
Yazarlar ifşa gerek yok.
Bu eser NIH DK092408 tarafından desteklenen ve DK100227 MFR. AJR için T32-DK007013 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Julian A.T. Dow Çapar-GAL4 ve c724-GAL4 için teşekkür etmek istiyorum Drosophila stokları. Ayrıca Jacob B. Anderson deneysel sinek haçlar sürdürmek yardım için teşekkür ediyoruz.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Poly-L-Lysine (PLL) Solution | Sigma-Aldrich | P4832 | Store at 4 °C, can be reused. |
Nigericin Sodium Salt | Sigma-Aldrich | N7143 | CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C. |
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm | Sigma-Aldrich | GBL622105 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Available from multiple vendors. |
Helping Hands Soldering Stands | Harbor Freight Tools | 60501 | Available from multiple vendors. |
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors | Bioscience Tools | PS-8S | Any comparable perfusion system can be used. |
Flow Regulator | Warner Instruments | 64-0221 | Can be substituted as needed to match perfusion system. |
Schneider's Medium | Fisher Scientific | 21720024 | Store at 4 °C in sterile aliquots. |
#5 Inox Steel Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Can be substituted based on experimenter comfort. |
35 x 10 mm polystyrene Petri dish | Corning Life Sciences | Fisher Scientific 08-757-100A | Exact brand and size are unimportant. |
75 x 25 mm Microscope Slides | Corning Life Sciences | 2949-75X25 | Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible. |
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm | Warner Instruments | 64-0796 | Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells. |
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" | Fisher Scientific | 14-171-129 | Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system. |
Vacuum Silicone Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 | Available from multiple vendors. |
Plastic Flow Control Clamp | Fisher Scientific | 05-869 | Available from multiple vendors, sterility not required |
Glass rods, 5 mm diameter | delphiglass.com | 9198 | Exact size is personal preference, multiple vendors available |
PAP Hydrophobic Pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | Available from multiple vendors. |
Sealing Film | Sigma-Aldrich | P7668 | Available from multiple vendors. |
15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | Available from multiple vendors. |
50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | Available from multiple vendors. |
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | H3375 | Available from multiple vendors. |
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 69892 | Available from multiple vendors. |
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | T5130 | Available from multiple vendors. |
10X/0.45 Air Objective | Zeiss | 000000-1063-139 | Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging. |
Dissecting Stereoscope | Zeiss | Discovery.V8 | Any dissecting stereoscope can be used. |
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 10 | |
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 32 | |
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster | Available from Romero Lab | First published: Citation 2 | |
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera | Zeiss | Axiocam 506 mono | Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging. |
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic | Chroma | CZ909 | Any GFP/FITC filer set can be substituted. |
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic | Chroma | CZ915 | Any GFP/FITC filer set can be substituted. |
Inverted Epifluoescent Microscope | Zeiss | Axio Observer Z.1 | Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives. |
Statistical Analysis Software | Microcal | Origin 6.0 | Any software with comparable functionality can be substituted |
Image Analysis Software | National Institutes of Health | ImageJ 1.50i | Any software with comparable functionality can be substituted |
Image Acquisition Software | Zeiss | Zen 1.1.2.0 | Any software with comparable functionality can be substituted |
Single-edged Carbon Steel Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 71960 | Available from multiple vendors. |
Microscopy Slide Folder | Fisher Scientific | 16-04 | Available from multiple vendors. |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 50-110-1231 | Available from multiple vendors. |
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs | Genesee Scientific | 32-109BF | Comparable items can be substituted. |
2.5 L Laboratory Ice Bucket | Fisher Scientific | 07-210-129 | Available from multiple vendors. |
NMDG; N-Methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | Available from multiple vendors. |
200 uL barrier pipette tips | MidSci | AV200 | Available from multiple vendors. |
200 μL variable volume pipette | Gilson Incorporated | PIPETMAN P200 | Available from multiple vendors. |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır