JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Özet

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Kas glikoz metabolizmasını araştırmaya ve metabolik değişiklikleri karakterize etme amaçlı tüm çalışmalar için kas hücrelerinin insülin duyarlılığının değerlendirilmesi büyük önem taşımaktadır. Kas hücrelerinde, glukoz taşıyıcı tip 4 (GLUT4) proteinleri, insüline tepki olarak plazma membranına translokasyon yapar, böylece hücrenin içine glükoz girmesini sağlar. Kas hücrelerinin glikoz alım oranını arttırarak insüline cevap verme yeteneği, insüline karşı kas hücrelerinin duyarlılığını ölçmek için standart okumalardan biridir. İnsan primer miyotları, in vitro model olarak uygundur, çünkü hücreler insülin duyarlılığı da dahil olmak üzere verici fenotipin birçok özelliğini korurlar. Bu in vitro model de insülin yanıt vermeyi etkileyebilecek herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Farklı miyotlarda glikoz alım hızı ölçümleriInsülin duyarlılığı.

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklılaşmış miyotlar elde edilir ve insülin stimülasyonu olan ve olmayan glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [3H] 2-deoksi-D-Glukoz ([3H] 2dG) kullanılarak pasif ve aktif glikoz taşınım oranlarını belirlemek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hesaplama yöntemleri, aktif bazal ve insülin tarafından uyarılan hızların yanı sıra stimülasyon katının miktarını belirlemek için sağlanır.

Giriş

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Bu insülin yanıt veren doku, insülin stimülasyonu 1 tarafından tetiklenen glikoz alımının birincil bölgesidir.

Tip 2 diyabette, iskelet kası da dahil olmak üzere çeşitli dokularda insülin direnci gözlenir ve normal kan şekeri konsantrasyonunun üstünde seyreder. Bu nedenle, bir öznedeki bir kusurun karakterize edilmesine mi yoksa iyileştirmek isteyen bir tedavinin verimliliğini değerlendirmeye mi götürmesi gerektiği gibi, bu dokunun ve hücrelerinin insülin duyarlılığının seviyesinin belirlenmesi büyük önem taşır. Insan ya da hayvan konularda, insülin duyarlılığını değerlendirmek için altın standart tekniği, hiperinsülinemik-öglisemik klipstir. DeFronzo tarafından 1979 2'de tanıtıldı ve 3 , 4'den sonra değiştirildi, yöntem tüm vücudu a veDokular insülin tepkisi, normal kan şekeri konsantrasyonunu korumak için insülin uyarımı altında perfüze edilecek glikoz oranı olarak ölçülmüştür.

İnsülin duyarlılığı araştırması, in vitro kas modelleri kullanılarak hücre seviyesinde de yapılabilir ve glikoz alım oranlarının ölçümü, hücrenin insülin stimülasyonuna biyolojik tepkisini ölçmek için etkin ve güvenilir bir araç olarak kalır 5 , 6 , 7 . Aslında, glikoz alım ölçümleri, insülin reseptörüne bağlanmasından, GLUT4 zenginleştirilmiş vezikülleri translokasyonuna kadar ve hücre içi sinyalizasyon ve fosforilasyon kaskadları dahil olmak üzere, insülin stimülasyonuna verilen hücre biyolojik tepkisini niceleştirir.

Farklılaşmış miyotlar, verici fenotipin metabolik özellikleri de dahil olmak üzere pek çok özelliğini muhafaza ettiği için insan numuneleri ile büyük ilgi görüyor.Hastalarda görülen bozukluklar ve bozukluklar 9 , 10 , 11 , 12 . Miyotüpler, glikoz taşıyıcıları 15 ve hücresel insülin sinyalleme makineleri 16'nın ekspresyonu dahil olmak üzere iskelet kasına 13 , 14 yapısal, metabolik ve fenotipik benzerlikler gösterir. Bu nedenle, primer miyotlarda glikoz alımı ölçümü, bir donörün kas fenotipinin karakterize edilmesi veya bir müdahalenin (ilaç, beslenme veya fiziksel aktivite) kas hücresindeki insülin duyarlılığı üzerindeki etkisinin araştırılması ile ilgilidir.

Kültürlenmiş miyotlarda glikoz alımı ölçümü, insülin duyarlılığını değiştiren deneyler yaparken güvenilir bir araçtır17,18. In vitro modeli, insülin yanıt vermeyi iyileştirebilen veya edinilen veya indüklenen insülin direncini 19 , 20 , 21 , 22 , 23 engelleyebilen veya tersine döndürebilen herhangi bir bileşiğin testi için uygundur.

Burada insan miyotlarını kültürlemek ve ayırmak ve hücre glikoz alım hızlarını ölçmek için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, laboratuvar ortamındaki preparatlardan, işbirliğinden ya da piyasada bulunan tedarikçilerden gelmiş olmasına rağmen, insan kas öncül hücrelerinin herhangi bir kaynağına uygulanabilir. Fare ve sıçan kökenli sırasıyla C2C12 ve L6 gibi ölümsüzleştirilmiş kas hücre çizgileri, bu protokolle glikoz alım ölçümleri için de kullanılabilir 7 .

Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2dG'yi kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. TEtiketli bir glikoz analoğunun kullanılması, birincil hücrelerle çalışıldığında ortak bir koşul olan indirgenmiş başlangıç ​​materyali ile glikoz girişinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Modifiye glikoz molekülü, metabolik yollara giremiyor ve böylece hücre içinde birikiyor ve toplam hücre radyoaktivitesi aracılığıyla güvenilir bir şekilde ölçülebiliyor. Deneysel koşullar arasında bir glikoz transport inhibitörü (sitokalasin B) kullanımı yer alır ve ölçümler insülin ile veya insülinsiz yapılır. Bu kombinasyon, glukoz aktif giriş hızlarının belirlenmesine ve insülin tepki indeksi için kat değişikliğinin hesaplanmasına izin verir. Yöntem tek bir kuluçka süresi boyunca bir doz insülin ile sunulur, ancak protokol doz yanıtı ya da zaman dersi deneyleri için kolayca modifiye edilebilir 12 .

Protokol

1. Hücre Kültürü Ortamlarının ve Çözümlerinin Hazırlanması

  1. Kültür ortamının hazırlanması
    1. Ham'in F-10 ortamını glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL final),% 2 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve% 2 serum replasmanı ile takviye ederek çoğalma ortamı hazırlayın.
    2. Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL son) ve% 2 FCS ile takviye ederek farklılaşma ortamı (DM) hazırlayın.
  2. Glikoz alım çözümlerinin hazırlanması
    Dikkat: Radyoaktif maddenin taşınmasına yalnızca sınırlı ve kontrollü bir alanda yetkili personel tarafından izin verilmektedir. Malzeme ve atıklar, uygun prosedürlere, kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak ele alınmalıdır.
    1. X-Dulbecco fosfat tamponlu salin (X-DPBS) hazırlamak için,% 0.2 (w / v) (son konsantrasyon) sığır serumu alb içeren bir DPBS solüsyonu hazırlayınUmin (BSA). Çözeltiyi 0.2 um'lik bir filtreden geçirin. 4 ° C'de saklayın.
    2. Soğuk 2-deoksi-D-glikoz (2dG) solüsyonu hazırlamak için 16.4 mg 2dG'yi tartın ve 10 mM'lik bir çözelti elde etmek için 10 mL damıtılmış suda çözünürleştirin. 4 ° C'de saklayın.
    3. Radyoaktif olarak işaretlenmiş 2dG (2dG *) çözeltiyi elde etmek için 600 μL soğuk 2dG ve 6 μL radyoaktif işaretlenmiş [3H] 2dG'yi 5400 μL X-DPBS'ye ekleyin.
      NOT: Nihai konsantrasyon 1 mM 2dG'dir ve etiketleme 1 mcC / mL'dir.
      1. Radyoaktif olarak işaretlenmiş 2dG * solüsyonundan 20 μL'lik bir alikot (TC20) ayırın.
  3. Kuluçka karışımlarının hazırlanması
    1. Sitokalasin B karışımı için, 2 mL radiolabeled 2dG * solüsyonuna 2 mcL 20 mM sitokalazin B ilave edin.
      NOT: Sitokalasin B stok solüsyonu dimetil sülfoksid (DMSO) içinde 10 mg / mL'dir.
    2. DMSO karışımı için kalan 4 mL radyoaktif işaretlenmiş 2dG * çözeltisine 4 uL DMSO ekleyin.

2. İnsan Primer Kas Hücrelerinin Kültürü

  1. İnsan kaslı uydu hücreleriyle 6 oyuklu plakaların tohumlanması
    NOT: Dondurulmuş bir flakondan (250.000 hücre içeren) ticari olarak temin edilebilen insan kaslı uydu hücrelerini şirket içinde kullanın (bkz. Referans 24 ). Tek bir durumda glikoz alımının ölçümü için gerekli olan bir 6 kuyulu plaka elde etmek için aşağıdaki prosedür 250,000 hücre için verilmiştir.
    1. İçinde 24 bulunan donmuş flakonları veya önceden hazırlanmış ılık suda (37 ° C) insan kas uydu hücrelerinin ticari preparatlarını flakona sadece küçük bir buz bloğu kalana kadar hızla çözdürür.
    2. Doğrudan 10 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) PM içeren 50 mL'lik bir plastik tüp içine dökün.
    3. 500 xg'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
    4. Hücre pelletini, önceden ısıtılmış PM'nin 18 mL'si ile hafifçe tekrar süspanse edin (her biri 42.000 hücre elde etmek için3 mL orta). 6 oyuklu bir plakanın (9.6 cm2) her oyuğuna 3 mL dağıtın.
      NOT: Bir plakanın altı ayrı oyuğu, pasif nakil inhibisyonu (kuyucuk 1 ve 2), bazal hız (kuyu 3 ve 4) ve insülinle uyarılan hız (kuyular 5 ve 6). Farklı tedavilere ihtiyaç duyulduğundan altı kuyucuklu plakaları tekrarlayın.
    5. Hücreler% 90 konfluansa erişene kadar standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin.
      NOT: Bu adım, hücre partisine bağlı olarak 48 - 72 saat arasında sürer. Bu adımda orta maddeyi değiştirmeyin.
  2. Kas hücrelerinin farklılaşması
    1. PM'yi alın (48-72 saat sonra) ve önceden ısıtılmış DM (kuyucuk başına 3 mL) ile değiştirin. 37 ° C'de,% 5 C02'de inkübe edin.
      NOT: Farklılaşma, hücrelerin hizalanması ve polinükleer hale getirildiği istikrarlı bir duruma erişmek için beş gün sürer. Tipik olarak birincilMiyotüpler, 1 g / L glikoz ortamında kültürlenir. Bu nedenle, kültür esnasında şeker tükenmesini önlemek için, yeterli glikoz substratının her zaman hücreler için mevcut olduğundan emin olmak için plakayı 3 mL ortam ile doldurun.
    2. DM ortamını iki günde bir değiştirin.
      NOT: Bu noktadan itibaren, miyotüpler önemli bir değişiklik olmaksızın 7 gün boyunca kararlıdır ve glikoz alım ölçümleri her an yapılabilir.
  3. Kas hücresi tedavisi (opsiyonel)
    NOT: Birincil miyotürler, insülin uyarımı ve glikoz alım ölçümlerinden önce modifikasyon (uyuşturucu testi, sinyal yolunun inhibitörleri / aktivatörleri vs. ) uyandırmak için birkaç gün tedavi edilebilir. Kas hücreleri insülin hassasiyetini etkileyebilecek her tedaviye tabi tutulabilir ve glikoz alım ölçümleri bu etkiyi nicelleştirir. Örneğin, kas hücrelerinin doymuş yağlı asit palmitat ile kuluçkalanması insülin direncini arttırır ve hücreler azaltılmış iNsulin, glikoz alımını uyarmıştır.
    1. % 10 BSA (yağ asidi içermeyen) ve 0.5 mL palmitat (PALM) ile desteklenmiş 12 mL DM hazırlayın. Sadece% 10 BSA (yağ asidi içermeyen) ile desteklenmiş 12 mL DM hazırlayın.
    2. İnsan primer miyotları ile iki 6 oyuklu levha hazırlayın ve bölümler 2.1 ve 2.2'de (5 günlük farklılaşma ile) açıklandığı gibi kültürleyin.
    3. 5. günde, her oyuğu 2 mL PBS ile yıkayın. Bir tabağa, PALM içeren 2 mL DM ekleyin. Diğer plakaya yalnızca DM içeren 2 mL BSA ilave edin.
    4. 48 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 C02'de inkübe edin.

3. İnsülin Uyarımı

  1. Farklılaşmış kas hücrelerini iki kez 2 mL PBS ile yıkayın.
  2. PBS'yi dikkatlice çıkarın ve serum tükenmesi için 3 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO 2 ) FCS içermeyen 3 mL DM ile inkübe edin.
  3. Tüm kuyularda bulunan ortamları FCS içermeyen 3 mL DM ile değiştirin. Kuyu 5 ve 6'ya 100 nM insülin ekleyin.
  4. Için insan miyotüp kültürü kuluçkalayın1 saat (37 ° C,% 5 C02).

4. Glikoz Alımı

  1. 1 saatlik insülin stimülasyonundan sonra, oyukları X-DPBS ile yıkayın (yıkama başına 1 mL).
  2. 1 mL sitokalazin B karışımı kuyu 1 ve 2'ye ve 1 mL DMSO karışımı çukurlara 3 - 6 ekleyin. 15 dakika inkübe edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). Kuluçka işleminin sonunda, plakayı derhal buzda bekletin.

5. Hücre Lizizi

  1. Hücreleri 1 mL buz soğukluğundaki PBS ile iki kez yıkayın.
  2. Hücreleri, 600 uL 50 mM NaOH ile her oyukta Lyse. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve yavaş yavaş yörünge dönüşü ile karıştırın.
    NOT: Lizat çok yapışkan ise, 1.5 mL NaOH ile seyreltin.
  3. Bir pipet kullanarak, tekrar askıda bırakın ve hücre lizatını toplamayın.

6. Radyolabellenmiş Glikoz Tayini

  1. Bir sıvı sintilasyon sayma flakonda her bir hücre lizatı 400 mcL koyun. 400 ile negatif kontrol flakonu hazırlayın50 mM NaOH'nin 50 uL'si ve 20 uL TC20 ile pozitif bir kontrol şişesi (basamak 1.2.3.1'den).
  2. Her flakona 4 mL sıvı sintilasyon solüsyonu ilave edin. Kapağı kapatın ve her şişeyi iyice karıştırın (1-2 s).
  3. Her şişeyi bir sıvı sintilasyon sayacına yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre radyoaktiviteyi ölçün. Her sintilasyon flakonu için 10 dk için dakika başına rekor (BGBM) kaydedin.
    NOT: CPM = "dakika başına parçalanma" x "sayım verimliliği".

7. Glikoz Alım Oranı

  1. Kalan lizatı (200 uL, adım 5.2'den itibaren) protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanın. Her hücre lizatının protein konsantrasyonunu Bradford 25 veya eşdeğer bir yöntem kullanarak belirleyin. Her kuyu için toplam protein miktarını (Q) mg cinsinden hesaplayın.
  2. TC1 (1 μL radyoaktif işaretli 2dG * değeri) elde etmek için, TC20'nin BGBM değerini 20'ye bölün.
  3. Her şişe için tGlikoz alımı oranı şu şekildedir:
    figure-protocol-7992
    NOT: R, pmol / mg / dak olarak ölçülür. Kuyular 1 - 2 için R ortalaması, pasif nakliye oranını, R p'yi verir . 3-4 kuyu için R ortalaması, bazal toplam nakliye oranını, Rbt'yi verir . Kuyular 5-6 için R değeri, insülinle uyarılan toplam nakil oranını verir, R it .
    1. Bazal aktif nakil oranını (R ba ) aşağıdaki gibi hesaplayın:
      figure-protocol-8456
    2. İnsülin ile uyarılan aktif aktarım hızını ( Rıa ) aşağıdaki gibi hesaplayın:
      figure-protocol-8624
      NOT: Miyotüpler gibi insüline duyarlı hücrelerde, glikoz alım hızı genellikle üç değerle temsil edilir: R ba , Rıa ve kat insülin uyarımı Rıa / R ba olarak .

Sonuçlar

3. günde miyoblastlar konfluansa ulaşır ( Şekil 1A ). Bu aşamadaki miyoblastlar tipik olarak mononükleotiddir. Ortam değiştirildi ve 8. günde farklılaşma tamamlandı ( Şekil 1B ) (protokol bölümü 2). 5 gün farklılaştıktan sonra, miyotlar hizalanır ve tipik olarak polinükleere edilir. İnsan primer miyotları, glikoz alım hızı ölçümünden önce bir palmitat veya bir BSA'ya uygulanmıştır. Hücrele...

Tartışmalar

Glukoz alımı, hücre kültürü üzerindeki aktivatörleri veya inhibitörleri test etmek için önemli biyolojik bir ölçümdür ve glikoz kullanımını nasıl etkilediği ve hücrenin insüline cevap verme yeteneği. Burada açıklanan yöntemin hızlı ve güvenilir olduğu gösterilmiştir ve sağlıklı kişilerden ve / veya metabolik olarak etkilenen hastalardan alınan primer miyotları kullanan birçok çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır 6,7,10,12,21,26,27,36,37. Sadece bir 6 kuyucuklu plaka ile, ...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Radiobiyoloji servisindeki (Lyon-Sud hastanesi) Anne Charrié'yi ve maddi desteklerinden dolayı Fond National Suisse'yi (FNS) onaylarlar.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Human primary muscle cellIn house preparation from human skeletal muscle biopsiesIn house preparation from human skeletal muscle biopsiesIf not available, use commercial source
Human primary muscle cellPromocellC-12530Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plateCorning356400BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10DutscherL0145-5001 g/L glucose
GlutamineDutscherX0551-100
penicilin/streptomycin 100xThermo fisher scientific15140122
Serum substitute UltroserGPall France15950.017serum substitute in text
DMEM low glucoseDutscherL0064-5001 g/L glucose
Fetal Calf SerumEurobioCVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineDutscherL0625-500Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution humanSigma-AldrichI9278
2-deoxy-D-glucose Sigma-AldrichD6134
Albumin bovineeuromedex04-100-812-E
fatty acid-free BSARoche10,775,835,001
palmitateSigma-AldrichP0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]PerkinElmerNET328A001MCSpecific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin BSigma-Aldrichc2743
PICO PRIAS VIAL 6 mLPerkinElmer6000192
ultima gold MW CA PerkinElmer6013159scintillation liquid
bêta counter PerkinElmer2900TR

Referanslar

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18 (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90 (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68 (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93 (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109 (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7 (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49 (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home?. Cell Tissue Res. 354 (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10 (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60 (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459 (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159 (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374 (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49 (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4 (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40 (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120 (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57 (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60 (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293 (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283 (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54 (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55 (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460 (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68 (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152 (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55 (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7 (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62 (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64 (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9 (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284 (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56 (2), 190-198 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel BiyolojiSay 124skelet kasglikoz metabolizmasins lin sinyaliinsan miyotuins lin duyarl lradyoaktivite

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır