Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.
İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Kas glikoz metabolizmasını araştırmaya ve metabolik değişiklikleri karakterize etme amaçlı tüm çalışmalar için kas hücrelerinin insülin duyarlılığının değerlendirilmesi büyük önem taşımaktadır. Kas hücrelerinde, glukoz taşıyıcı tip 4 (GLUT4) proteinleri, insüline tepki olarak plazma membranına translokasyon yapar, böylece hücrenin içine glükoz girmesini sağlar. Kas hücrelerinin glikoz alım oranını arttırarak insüline cevap verme yeteneği, insüline karşı kas hücrelerinin duyarlılığını ölçmek için standart okumalardan biridir. İnsan primer miyotları, in vitro model olarak uygundur, çünkü hücreler insülin duyarlılığı da dahil olmak üzere verici fenotipin birçok özelliğini korurlar. Bu in vitro model de insülin yanıt vermeyi etkileyebilecek herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Farklı miyotlarda glikoz alım hızı ölçümleriInsülin duyarlılığı.
Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklılaşmış miyotlar elde edilir ve insülin stimülasyonu olan ve olmayan glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [3H] 2-deoksi-D-Glukoz ([3H] 2dG) kullanılarak pasif ve aktif glikoz taşınım oranlarını belirlemek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hesaplama yöntemleri, aktif bazal ve insülin tarafından uyarılan hızların yanı sıra stimülasyon katının miktarını belirlemek için sağlanır.
İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Bu insülin yanıt veren doku, insülin stimülasyonu 1 tarafından tetiklenen glikoz alımının birincil bölgesidir.
Tip 2 diyabette, iskelet kası da dahil olmak üzere çeşitli dokularda insülin direnci gözlenir ve normal kan şekeri konsantrasyonunun üstünde seyreder. Bu nedenle, bir öznedeki bir kusurun karakterize edilmesine mi yoksa iyileştirmek isteyen bir tedavinin verimliliğini değerlendirmeye mi götürmesi gerektiği gibi, bu dokunun ve hücrelerinin insülin duyarlılığının seviyesinin belirlenmesi büyük önem taşır. Insan ya da hayvan konularda, insülin duyarlılığını değerlendirmek için altın standart tekniği, hiperinsülinemik-öglisemik klipstir. DeFronzo tarafından 1979 2'de tanıtıldı ve 3 , 4'den sonra değiştirildi, yöntem tüm vücudu a veDokular insülin tepkisi, normal kan şekeri konsantrasyonunu korumak için insülin uyarımı altında perfüze edilecek glikoz oranı olarak ölçülmüştür.
İnsülin duyarlılığı araştırması, in vitro kas modelleri kullanılarak hücre seviyesinde de yapılabilir ve glikoz alım oranlarının ölçümü, hücrenin insülin stimülasyonuna biyolojik tepkisini ölçmek için etkin ve güvenilir bir araç olarak kalır 5 , 6 , 7 . Aslında, glikoz alım ölçümleri, insülin reseptörüne bağlanmasından, GLUT4 zenginleştirilmiş vezikülleri translokasyonuna kadar ve hücre içi sinyalizasyon ve fosforilasyon kaskadları dahil olmak üzere, insülin stimülasyonuna verilen hücre biyolojik tepkisini niceleştirir.
Farklılaşmış miyotlar, verici fenotipin metabolik özellikleri de dahil olmak üzere pek çok özelliğini muhafaza ettiği için insan numuneleri ile büyük ilgi görüyor.Hastalarda görülen bozukluklar ve bozukluklar 9 , 10 , 11 , 12 . Miyotüpler, glikoz taşıyıcıları 15 ve hücresel insülin sinyalleme makineleri 16'nın ekspresyonu dahil olmak üzere iskelet kasına 13 , 14 yapısal, metabolik ve fenotipik benzerlikler gösterir. Bu nedenle, primer miyotlarda glikoz alımı ölçümü, bir donörün kas fenotipinin karakterize edilmesi veya bir müdahalenin (ilaç, beslenme veya fiziksel aktivite) kas hücresindeki insülin duyarlılığı üzerindeki etkisinin araştırılması ile ilgilidir.
Kültürlenmiş miyotlarda glikoz alımı ölçümü, insülin duyarlılığını değiştiren deneyler yaparken güvenilir bir araçtır17,18. In vitro modeli, insülin yanıt vermeyi iyileştirebilen veya edinilen veya indüklenen insülin direncini 19 , 20 , 21 , 22 , 23 engelleyebilen veya tersine döndürebilen herhangi bir bileşiğin testi için uygundur.
Burada insan miyotlarını kültürlemek ve ayırmak ve hücre glikoz alım hızlarını ölçmek için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, laboratuvar ortamındaki preparatlardan, işbirliğinden ya da piyasada bulunan tedarikçilerden gelmiş olmasına rağmen, insan kas öncül hücrelerinin herhangi bir kaynağına uygulanabilir. Fare ve sıçan kökenli sırasıyla C2C12 ve L6 gibi ölümsüzleştirilmiş kas hücre çizgileri, bu protokolle glikoz alım ölçümleri için de kullanılabilir 7 .
Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2dG'yi kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. TEtiketli bir glikoz analoğunun kullanılması, birincil hücrelerle çalışıldığında ortak bir koşul olan indirgenmiş başlangıç materyali ile glikoz girişinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Modifiye glikoz molekülü, metabolik yollara giremiyor ve böylece hücre içinde birikiyor ve toplam hücre radyoaktivitesi aracılığıyla güvenilir bir şekilde ölçülebiliyor. Deneysel koşullar arasında bir glikoz transport inhibitörü (sitokalasin B) kullanımı yer alır ve ölçümler insülin ile veya insülinsiz yapılır. Bu kombinasyon, glukoz aktif giriş hızlarının belirlenmesine ve insülin tepki indeksi için kat değişikliğinin hesaplanmasına izin verir. Yöntem tek bir kuluçka süresi boyunca bir doz insülin ile sunulur, ancak protokol doz yanıtı ya da zaman dersi deneyleri için kolayca modifiye edilebilir 12 .
1. Hücre Kültürü Ortamlarının ve Çözümlerinin Hazırlanması
2. İnsan Primer Kas Hücrelerinin Kültürü
3. İnsülin Uyarımı
4. Glikoz Alımı
5. Hücre Lizizi
6. Radyolabellenmiş Glikoz Tayini
7. Glikoz Alım Oranı
3. günde miyoblastlar konfluansa ulaşır ( Şekil 1A ). Bu aşamadaki miyoblastlar tipik olarak mononükleotiddir. Ortam değiştirildi ve 8. günde farklılaşma tamamlandı ( Şekil 1B ) (protokol bölümü 2). 5 gün farklılaştıktan sonra, miyotlar hizalanır ve tipik olarak polinükleere edilir. İnsan primer miyotları, glikoz alım hızı ölçümünden önce bir palmitat veya bir BSA'ya uygulanmıştır. Hücrele...
Glukoz alımı, hücre kültürü üzerindeki aktivatörleri veya inhibitörleri test etmek için önemli biyolojik bir ölçümdür ve glikoz kullanımını nasıl etkilediği ve hücrenin insüline cevap verme yeteneği. Burada açıklanan yöntemin hızlı ve güvenilir olduğu gösterilmiştir ve sağlıklı kişilerden ve / veya metabolik olarak etkilenen hastalardan alınan primer miyotları kullanan birçok çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır 6,7,10,12,21,26,27,36,37. Sadece bir 6 kuyucuklu plaka ile, ...
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Yazarlar, Radiobiyoloji servisindeki (Lyon-Sud hastanesi) Anne Charrié'yi ve maddi desteklerinden dolayı Fond National Suisse'yi (FNS) onaylarlar.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/L glucose |
Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/L glucose |
Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq |
Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
PICO PRIAS VIAL 6 mL | PerkinElmer | 6000192 | |
ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır